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Analysis of CdgC as the major diguanylate cyclase in S. venezuelae

Neumann, Sara Alina 23 August 2021 (has links)
Die Entwicklung des grampositiven Bodenbakteriums Streptomyces ist in einem komplexen Lebenszyklus koordiniert, bestehend aus drei Stufen: vegetativem Hyphenwachstum, Luftmycelbildung und Sporulation. C-di-GMP kontrolliert die Enwicklung über zwei Effektorproteine: dem Masterregulator BldD und dem Anti-Sigmafaktor RsiG. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das membranständige GGDEF-EAL Protein CdgC eine wichtige aktive Diguanylatzyklase (DGC) in S. venezuelae ist. Chromosomale Deletion von cdgC führte zu einer flachen, gräulichen Koloniemorphologie mit radialen Stegen und hydrophiler Oberfläche sowie zu frühzeitiger Sporulation ohne Lufthyphenbildung. Phänotypische Analysen zeigten, dass die DGC-Aktivität von CdgC essentiell ist für dessen biologische Rolle und deuten auf einen zusätzlichen Protein-spezifischen morphologischen Effekt von CdgC hin. CdgC-FLAG akkumuliert im Laufe des Lebenszyklus und scheint BldD-abhängig über eine c-di-GMP vermittelte Feedbackschleife reguliert zu werden. Frühere RNA-seq Daten, verifiziert für repräsentative Gene mittels qRT-PCR, deuten eine differentielle Expression der Bestandteile des hydrophoben Mantels als Ursache der Lufthyphendefizienz an. Konfokalmikroskopische Aufnahmen des bakteriellen Tubulin-Homologons FtsZ deuten einen c-di-GMP-sensitiven Einfluss von CdgC auf die Koordination der Zellteilung an. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass CdgC mit sich selbst sowie drei potentiellen Membranproteinen interagiert. Demnach trägt CdgC zur Koordination von Zellteilungs- und hydrophoben Zelloberflächenproteinen bei und beeinflusst damit c-di-GMP-abhängig den Zeitpunkt der Sporenbildung. Insgesamt führt diese Studie CdgC als GGDEF-EAL-Tandemprotein mit spezifischem Knockout- Phänotyp ein, der von seiner DGC-Aktivität sowie seinem Membrananker bestimmt wird. Zudem ist CdgC, als Reaktion auf eine noch unbekannte Signalübertragungskaskade, an der Koordinierung von Zeitpunkt und Verlauf der Sporulation ausschlaggebend beteiligt. / The proliferation of Gram-positive soil bacteria Streptomyces is temporally and genetically coordinated with a complex developmental life cycle, including three main stages of differentiation: vegetative hyphal growth, formation of aerial mycelium and sporulation. The key factor of Streptomyces developmental control is c-di-GMP with to-date two identified effector proteins: the master regulator BldD and the anti-sigma factor RsiG. In this thesis, the membrane-associated GGDEF-EAL protein CdgC, was identified as a major active diguanylate cyclase (DGC) in S. venezuelae. Deletion of cdgC results in the unique flat gray colony morphology with radial wrinkles and a hydrophilic surface, that shows enhanced sporulation without forming aerial hyphae. Phenotypic analyses suggest, that the DGC activity is essential for its biological role, but hint to an additional protein specific role. The protein levels of CdgC-FLAG were found to accumulate during the life cycle of S. venezuelae. Further investigation of CdgC-FLAG in a strain carrying a DNA-binding deficient BldD_D116A allele indicated, that BldD represses the expression of CdgC in a regulatory feedback loop along with the DGCs CdgA, CdgB and CdgE. RNA‐sequencing data indicated that reduced expression levels of the major compounds of the hydrophobic sheath result in the initiation of sporulation out of the vegetative mycelium and were verified for representative examples via qRT-PCR. Confocal microscopic imaging of the bacterial tubulin homolog FtsZ indicated a contribution of CdgC via its DGC activity in coordination of the cell division. In addition, BTH screenings revealed self-interaction and identified three membrane associated interaction partners. In conclusion, this study introduces the GGDEF-EAL tandem protein CdgC, whose specific knockout phenotype is governed by its DGC activity and membrane association. CdgC seems to drive timing and mode of sporulation in response to an unknown signal to a major extend.

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