Une stratégie d’ingénierie du métabolisme de C. acetobutylicum a été développée afin de construire une souche capable de produire de l’isopropanol à partir de sucres en C5, en C6 ou de substrats plus complexes. Dans un premier temps, une souche de C. acetobutylicum a été ingénieriée pour la production d’un mélange isopropanol/butanol/éthanol (IBE), ce microorganisme n’étant pas capable de produire naturellement de l’isopropanol. Différents opérons, exprimant une voie synthétique de production d’isopropanol, ont été construits et introduits à partir d’un plasmide dans une souche chez laquelle la voie de synthèse du butyrate a été supprimée (C. acetobutylicum ATCC 824 Δcac15ΔuppΔbuk). La souche la plus performante a été sélectionnée à partir de cultures réalisées en fermenteur, en mode discontinu à pH 5,0 et s’est avérée être celle exprimant la voie de l’isopropanol sous la dépendance du promoteur thl. Une optimisation des paramètres de culture a conduit à la production d’un mélange IBE, à partir de glucose, à une concentration de 21 g.l-1, un rendement de 0,34 g.g-1 et une productivité de 0,8 g.l-1.h-1. La production du mélange IBE à partir de xylose ou de xylane comme unique source de carbone a également été démontrée et permet une production IBE de 10,4 g.l-1 avec un rendement de 0,31 g.g-1 sur xylose et une production IBE de 4,28 g.l-1 avec un rendement de 0,28 g.g-1 sur xylane. Enfin, l’analyse des flux passant par la voie de l’isopropanol a permis d’identifier l’étape limitant la production de ce composé. Cette dernière semble être liée à la concentration en acétate intracellulaire et aux propriétés catalytiques la CoA-transférase, qui possède une faible affinité pour l’acétate. Ainsi, une CoA-transférase synthétique basée sur les caractéristiques de la CoA-transférase AtoAD d’E. coli, qui est décrite comme ayant un Km pour l’acétate plus faible, a été conçue et exprimée dans la souche précédement construite afin de tenter de lever la limitation de la voie de synthèse de l’isopropanol. Dans un deuxième temps, des modifications supplémentaires du métabolisme de C. acetobutylicum ont été effectuée afin de produire de l’isopropanol comme unique produit de fermentation à partir de glucose ou de xylose. Différentes stratégies ont alors été évaluées dans le but de contourner le déséquilibre rédox causé par la délétion des voies parasites consommatrices de carbone. Ainsi, des outils permettant la mesure d’activité hydrogénase, in-vivo et in-vitro, ont été développés pour tester la fonctionnalité de 3 hydrogénases, utilisant la bifurcation d’électrons pour la production d’H2 à partir de NADH et de ferrédoxine. Une deuxième stratégie utilisant les potentialités de la voie des phosphocétolases pour la métabolisation du xylose en acétyl-CoA a été étudiée et des résultats prometteurs ont été obtenus malgré les limitations actuellement rencontrées / First, C. acetobutylicum was metabolically engineered to produce a biofuel consisting of an isopropanol/butanol/ethanol (IBE) mixture. Different synthetic isopropanol operons were constructed and introduced on plasmids in a butyrate minus mutant strain (C. acetobutylicum ATCC 824 Δcac15ΔuppΔbuk) in which the butyrate pathway was deleted. The best strain expressing the isopropanol operon from the thl promoter was selected from batch experiments at pH 5.0. By further optimizing the pH of the culture, an IBE mixture with almost no by-products was produced at a titer of 21 g.l-1, a yield of 0.34 g.g-1 and productivity of 0.8 g.l-1.h-1, values never reached before. IBE production was also shown to be efficient using xylose or xylan as the sole carbon source with 10.4 g.l-1 IBE produce at a yield of 0.31 g.g-1 from xylose and 4.28 g.l-1 IBE produce at a yield of 0.28 g.g-1 from xylan. Furthermore, by performing in vivo and in vitro flux analysis of the synthetic isopropanol pathway, this flux was identified to be limited by acetate intracellular concentration and the high Km of CoA-transferase for acetate. A synthetic CoA-transferase based on the AtoAD E. coli characteristics was designed, synthesized and evaluated in vivo. This enzyme, that displays a lower Km for acetate, was found to be a good candidate to alleviate the bottleneck of the isopropanol pathway. Secondly, several strategies were evaluated to redraw C. acetobutylicum metabolism and finally construct a strain able to produce isopropanol as the only fermentation product from glucose or xylose. To overcome the severe redox imbalance caused by homo-isopropanolic fermentation, several strategies were investigated. On the one hand, a new class of electron bifurcating enzyme, the NADH hydrogenases, that can use NADH and ferredoxin to produce H2, were evaluated in C. acetobutylicum. This strategy opens the alternative to produce isopropanol and H2 from glucose without any carbon lost. On the other hand, the use of an alternative catabolic pathway, the phosphocetolase pathway, for xylose utilization and acetyl-CoA production was evaluated. These results allow the identification of the metabolic bottlenecks to overcome to obtain a C. acetobutylicum strain able to produce only isopropanol from xylose at high yield

À l'heure actuelle, il y a un regain d'intérêt pour Clostridium acetobutylicum, le biocatalyseur du procédé Weizmann historique, pour produire le n-butanol un produit chimique de commodité et un bio-carburant alternatif et renouvelable . Ce mémoire de thèse décrit un procédé de recombinaison homologue, utilisant plasmide réplicatif, pour la délétion ou l'introdu ction de gènes chez C. acetobutylicum avec une élimination facile des marqueurs utilisés. La souche de C. acetobutylicum cacl502upp et ce système de recombinaison homologue ont été utilisés dans d'autres expériences d'ingénierie pour obtenir une souche produisant du n-butanol avec une sélectivité élevée et en éliminant la plupart des co-produits. Le mutant final, C. acetobutylicum (C. acetobutylicum CAB1060) a été généré avec succès. Cette souche CAB1060 a été utilisée dans un nouveau procédé de fermentation continu qui utilise i) l'extraction in situ des alcools par distillation sous pression réduite et ii) des cultures à haute densité cellulaire (et ne faisant pas intervenir de procédé membranaire) pour atteindre des titre, rendement et productivité en n-butanol qui n'ont jam ais été obtenus chez aucun micro-organisme.Un second procédé de recombinaison homologue utilisant un plasmide non réplicatif pour la modification de gène sans marqueur est également décrit dans le présent mémoire. Cette méthode permet d'inactiver simultaném ent deux gènes. Il a été utilisé avec succès pour la construction d'un mutant incapable de produire de l'hydrogène et utile, comme souche plate-forme, pour l'ingénierie de C. acetobutylicum pour produire en continu des produits chimiques de commodité et des bio­ carburants. / Current ly, there is a resurgence of interest in Clostridium acetobutylicum, the biocatalyst of the historical Weizmann process, to produce n-butanol for use both as a bulk chemical and as a renewablc alternative transportation fuel. This thesis describes a method of homologous recombination by replicative plasmid to delete or introduce genes in C. acetobutylicum . This method was successfull y used to delete genes, includin g CACJ502, CAC3535, CAC2879 (upp), to generate C. acetobutylicum. These strains are readily transformable without any previous plasmid methylation and can serve as hosts for a "marker-less" genetic exchange system. A mutant C. acetobutylicum (C. acetobuty licum CAB 1060) was successfully genera ted. This final mutant produces mainly bu tanol, with ethanol and traces of acetate at a molar rati o of 7:1 :1 . This CAB 1060 strain was subjected to a new continuous fermentation process using i) in situ extraction of alcohols by distillation under low pressure and ii) high cell density cultures to increase the titer, yield and productivity of n-butanol production to levels that have never been previously açhieved in any organism . A second homologous recombination method using non-replicative plasmid for marker less gene modification is also described in this thesis. This method allows the simultaneou s inactivation of two genes. lt has been successfully used to construct a mutant unable to produce hydrogen and useful, as a platform strain, for further engineering of C. acetobutylicum to continuously produce bulk chemicals and fuels.

Butanol production by four different Clostridium sp. strains was investigated using glucoseP2-medium supplemented with increasing concentrations of butyric acid, added as cosubstrate.Batch fermentations were carried out in serum bottles (freely-suspended cellcultures) and fibrous-bed bioreactor (FBB) with medium recirculation (immobilized cells).Butyric acid clearly revealed to inhibit cellular growth with all specific growth rates decliningupon the increase of butyrate concentrations. However, the presence of low and moderatelevels in the medium can readily enhance the ABE-fermentation and increase butanolproduction through a shift induction towards the solventogenic phase controlled by themedium pH. In all cases it was found that 4.0 g⋅l-1 is the optimal concentration of butyratethat maximizes the yields for all ABE-solvents and butanol productivities. The non-mutant C.acetobutylicum ATCC 824 was singled out as the most efficient butanol productive strainamong all bacteria tested (10.3 g⋅l-1 butanol versus 0.72 g⋅l-1 with and without 4.0 g⋅l-1butyrate, respectively) showing a productivity augment in the order of 0.078 g⋅l-1⋅h-1 (78.5%)and yields of 0.3 g⋅g-1 from substrate and 7.6 g⋅g-1 from biomass versus 0.072 g⋅g-1 and 0.41g⋅g-1 with and without the optimal butyrate concentration, respectively. This strain alsorevealed the best overall tolerance over increasing butyrate concentrations up to ∼6.0 g⋅l-1 andthe highest glucose uptake (65.5%) among all bacteria. Furthermore, the beneficial effects ofbutyric acid were also observed through the use of a fibrous bed-bioreactor when the mutatedstrains of C. beijerinckii ATCC 55025 and BA 101 were tested. The use of this immobilizedcell system effectively improved butanol production over the free system with butanol titersin the fermentation broth around 11.5 g⋅l-1 and 9.4 g⋅l-1 for the two bacteria, respectively,roughly doubling the values attained with the corresponding suspended cell cultures when themedia were supplemented with 4.0 g⋅l-1 of butyrate. All these results confirm theenhancement of butanol formation using either free or immobilized cell culturessupplemented with butyric acid concentrations up to 4.0 g⋅l-1 in the media.