A pesar de los grandes avances logrados en el tratamiento de las enfermedades oncológicas, la sobrevida de los pacientes se ha alargado mínimamente en algunos tipos de cáncer. Por ello resulta fundamental profundizar la búsqueda de terapias novedosas evaluando nuevos compuestos. El 1α,25(OH)2-vitamina D3 o calcitriol tiene efectos antitumorales en varios tipos de cáncer y algunos ensayos clínicos realizados han dado resultados alentadores, aunque en la mayoría de los casos se ha observado hipercalcemia, lo que dificulta la administración de la dosis necesaria para inducir una respuesta antitumoral. Por ello se han sintetizado análogos con el objeto de hallar algunos que conserven o incrementen los efectos antitumorales pero carezcan de la actividad calcémica. En este sentido, análogos de la vitamina D3 que poseen un grupo fosfonato en su cadena lateral y los derivados de la vitamina D2 han mostrado tener baja actividad calcémica, y los llamados tipo gemini han mostrado poseer una potente actividad antitumoral. Es por ello que en colaboración con dos grupos de investigación de Química Orgánica, hemos diseñado y sintetizado análogos de la vitamina D con estas características. En este trabajo de tesis nos propusimos evaluar la actividad calcemiante y antitumoral de tres de los análogos sintetizados. Se demostró que dos de ellos (C10 y UVB1) no poseen efectos hipercalcemiantes, mientras que el tercero (UVB2) genera hipercalcemia. Se comprobó que los dos primeros análogos poseen efectos sobre la viabilidad celular de varias líneas celulares tumorales diferentes, indicando su potencial utilidad como agentes terapéuticos. El C10 demostró ejercer los efectos anti-proliferativos más potentes y se eligió para seguir evaluando con mayor profundidad. El análisis de los mecanismos subyacentes a la actividad antitumoral demostró que el aumento en los niveles del inhibidor del ciclo celular p27 es un evento común en todos los tipos celulares estudiados. Además, se demostró que el C10 induce arresto del ciclo celular en la línea de glioma T98G, aumentando los niveles de expresión de p21 y disminuyendo los de Ciclina D1. También se identificaron algunas vías implicadas en la acción del C10. Posteriormente, se realizaron ensayos in vivo en modelos animales de cáncer. La administración del C10 a un modelo animal de glioma mostró tener efectos in vivo disminuyendo la carga tumoral. Un ensayo similar realizado en un modelo de cáncer mamario demostró efectos inhibitorios del C10 en el proceso de metástasis. En dos modelos animales de carcinoma celular escamoso, en cambio, no se observaron efectos antitumorales. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan evidencia que indica que este nuevo análogo podría ser, solo o en combinación con otros tratamientos, un posible agente terapéutico contra el cáncer. El calcitriol y sus análogos usualmente requieren del receptor de vitamina D (VDR) para ejercer su accion antitumoral. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos para el C10 en gliomas y sabiendo que, hasta el momento, no se ha reportado la expresión de VDR en éstos, nos propusimos también estudiar la expresión y el rol de este receptor en gliomas humanos. Encontramos principalmente que la expresión de VDR se correlaciona con una sobrevida global más larga de los pacientes de glioblastoma multiforme. Modulando genética y farmacológicamente al VDR en una línea celular de glioma humano demostramos que este receptor se encuentra implicado en la viabilidad y la migración celular y que es necesario para los efectos del calcitriol sobre la migración celular. Estos resultados indican que el estudio de la expresión de VDR en biopsias de gliomas constituye un importante requisito para la potencial utilización del calcitriol y/o sus análogos en el tratamiento de esta entidad tumoral. / Despite major advances in the treatment of oncological diseases, patient survival has only improved minimally for some types of cancer. It is therefore vital to search new therapies by evaluating novel compounds. The 1α,25(OH)2 vitamin D3 or calcitriol has antitumor effects in several types of cancer and some clinical trials have yielded encouraging results, although in most cases side effects such as hypercalcemia have been observed. These side effects preclude the administration of the dose required to induce an antitumor response. For this reason, new analogs are being synthesized with the object of finding those that maintain or increase the antitumor effects but lack calcemic activity. In this regard, analogs of vitamin D3 that possess a phosphonate group in its side chain and analogs derived from vitamin D2 have shown to display low calcemic activity, and the Gemini family analogues have been shown to display potent antitumor activity. That is why, in collaboration with two research groups of Organic Chemistry, we have designed and synthesized analogues of vitamin D with these features. In this thesis work we assessed the calcemic and the antitumor activity of three of the analogues synthesized. Of the three analogues studied, two showed no hypercalcemic effects (C10 and UVB1) while the third (UVB2) induced an important hypercalcemia. The two non-calcemic analogues evidenced effects on cell viability in various cancer cell lines, indicating their potential utility as therapeutic agents. The C10 is the one that proved to display the most potent antiproliferative effects on cell lines and it was chosen to perform additional studies. The analysis of the mechanisms underlying the antitumor activity of C10 showed that the increase in the levels of the cell cycle inhibitor p27 is a common event in all cell types studied. In addition, this compound induces cell cycle arrest in the glioma cell line T98G, increasing the levels of expression of p21 and decreasing Cyclin D1. In vivo assays using animal models of cancer were further performed. The administration of C10 to an animal model of glioma evidenced a decrease in the tumor load. A similar experiment carried out in an animal model of breast cancer showed that C10 exerted inhibitory effects of the metastasic process. In two models of squamous cell carcinoma, in contrast, no antitumor effects were observed for C10. The results obtained provide evidence that indicates that this new analog could be, alone or in combination with other treatments, a therapeutic agent against cancer. Calcitriol and its analogs exert their antitumor effect mainly through vitamin D receptor (VDR) action. Taking into account the interesting results obtained for C10 in gliomas and knowing that so far there have been no reported studies that describe the expression of VDR in gliomas, we proposed to investigate the expression of this receptor in human gliomas. We found that the expression of VDR correlates with a longer overall survival time of glioblastoma multiforme patients. By modulating genetically and pharmacologically VDR in a glioma cell line we showed that the receptor is involved in the cellular survival and migration processes and that is necessary for calcitriol-mediated inhibition of cell migration. The results obtained in human gliomas provide evidence that indicates that the study of the expression of VDR is an important requisite for the utilization of 1α,25(OH)2-vitamin D3 or its analogues in the treatment of gliomas.

In ständigem Kontakt mit zahlreichen Mikroorganismen benötigt unser Körper eine Vielzahl an Mechanismen zur Abwehr krankheitserregender Keime. Antimikrobielle Peptide unterstützen als Effektormoleküle die einzellige Epithelschicht des Darms, die als Mukosabarriere unseren Körper vor dem Eindringen pathogener Keime bewahrt. Die Expression des antimikrobiellen Peptids LL-37, auch Cathelicidin genannt, stellt eine Strategie des angeborenen Immunsystems zur Abwehr von Mikroorganismen im Kolon dar. Die Expression des Cathelicidin Gens camp kann, wie in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, durch exogene Faktoren, wie die biologisch aktive Form des Vitamin D3, das 1,25(OH)2D3, die kurzkettige Fettsäure Butyrat und das Ernährungssupplement Intestamin®, angeregt werden. Die Stimulation der Zellen mit den genannten Substanzen führte in allen gestesteten Zelllinien zeit- und dosisabhängig zu einer Steigerung der Expression des Cathelicidin Gens. Die Induktion der camp-Expression durch 1,25(OH)2D3 wird durch die Existenz eines Vitamin D Response Elements (VDRE) in der Promoterrregion des camp-Gens begründet, an das der Vitamin D-Rezeptor Komplex als ligandenabhängiger Transkriptionsfaktor bindet und die Genexpression vermittelt. Die Auswirkungen von Butyrat auf die Genexpression des Cathelicidins werden auf die Modifikation des Acetylierungsstatus der Histonproteine zurückgeführt. Butyrat bewirkt durch eine reversible Hemmung der Histondeacetylase die Hyperacetylierung bestimmter Kernhistone und greift auf diese Weise in die Regulation der Gentranskription ein. Das enterale Ernährungssupplement Intestamin®, das als Pharmakonutrition speziell für schwerkranke Patienten entwickelt wurde, ist reich an Glutamin-Dipeptiden, Tributyrin und Antioxidantien. Der Effekt, den Intestamin® auf die Expression des Cathelicidin Gens ausübt, ist wahrscheinlich auf Tributyrin zurückzuführen. Tributyrin, der Ester aus Glycerin und Butyrat, wird durch Hydrolyse zu Butyrat umgesetzt und bewirkt vermutlich die Steigerung der camp-Expression. Eine Co-Stimulation von GEKI 02 Zellen mit 1,25(OH)2D3 plus Butyrat erzielte nach 48 Stunden eine weitere Steigerung der Expression des Cathelicidin Gens gegenüber beiden Einzelsubstanzen. In allen anderen getesteten Zelllinien zeigte sich keine synergetische Wirkung der beiden Substanzen. Auch eine Co-Stimulation mit Intestamin® plus Butyrat konnte nicht zu einer stärkeren Zunahme der camp-Expression führen als eine Behandlung mit beiden Einzelsubstanzen. Eine synergetische Wirkung der Substanzen 1,25(OH)2D3 und Butyrat in GEKI 02 Zellen könnte durch die Acetylierung der Histone bedingt sein, die eine Auflockerung der Chromatinstruktur bewirkt, was wiederum die Bindung von Transkriptionsfaktoren wie dem Vitamin D-Rezeptor Komplex erleichtert. Die fehlende synergetische Wirkung in allen anderen getesteten Zelllinien könnte mit der Tatsache in Zusammenhang stehen, dass die Induktion der camp-Expression zeitabhängig ist: Vitamin D3 erzielte nach 24 Stunden, Butyrat nach 48 Stunden die deutlichsten Auswirkungen auf die Genexpression des Cathelicidins. Der Einfluss des MEK/ERK Signalweges auf die durch 1,25(OH)2D3, Butyrat und Intestamin® induzierte camp-Expression wurde in den durchgeführten Versuchen mittels des spezifischen MEK 1/2 Inhibitors U0126 untersucht. U0126 blockierte die Induktion des Cathelicidin Gens durch Intestamin® und Butyrat, was die Beteiligung des Signalweges MEK/ERK belegt. Vitamin D3 dagegen übt seinen Einfluss auf LL-37 nicht über den Signalweg MEK/ERK aus. Obwohl Vitamin D3 und Butyrat die Expression des Cathelicidin Gens camp induzieren, konnte die Inkubation der Zellen mit beiden Substanzen die antimikrobielle Aktivität der Kolonepithelzellen gegenüber E.coli im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen nicht steigern. Ursächlich hierfür könnte neben der Wahl eines apathogenen Bakterienstammes das Mikromilieu der Umgebung sein. Außer der Konzentration des Peptids spielen insbesondere der pH-Wert und die Salzkonzentration des Kulturmediums eine wichtige Rolle, da sie die Ausbildung der Sekundärstruktur, nämlich der α-helikalen Konformation, des LL-37 beeinflussen, die für die Interaktion mit Biomembranen erforderlich ist. Aufgrund der zunehmenden Resistenzentwicklung von Bakterien gegenüber herkömmlichen Antibiotika, wächst das Interesse an der Erforschung antimikrobieller Peptide. Exogene Faktoren wie 1,25(OH)2D3, Butyrat und Intestamin® können eine Steigerung der Expression des Cathelicidin Gens erzielen. Ob sich dieser Effekt allerdings auch in-vivo zeigt und eventuell therapeutischen Einsatz finden könnte, müssen weitere Studien klären. / Defence of mucosal and epithelial surfaces against microbial pathogens involves the innate and adaptive immune response. The single cell layer of the colonic epithelium produces an array of immune modulators, including antimicrobial peptides, such as cathelicidins, that participate in the innate immune system. The aim of the present study was to analyse the effect of calcitriol, the histon-deacetylase inhibitor butyrate and the enteral pharmaconutrition supplement Intestamin® on the expression of the cathlicidin gene camp. After exposure to these stimuli a time and dose dependent induction of the expression of the cathelicidin gene was found in all investigated colorectal cell lines. The effect of calcitriol, 1,25(OH)2D3, is mediated by the vitamin D response element (VDRE) in the camp promoter that was bound by the vitamin D receptor (VDR). The induction of cathelicidin expression after treatment with butyrate is attributed to a reversible inhibition of histone deacetylases resulting in modulation of core histone and non-histone proteins and subsequent regulation of the gene transcription. The enteral pharmaconutrition supplement Intestamin® contains glutamine, antioxidant vitamins and tributyrin. The increased cathelicidin level after treatment with Intestamin® are ascribed to tributyrin because tributyrin is a novel structured lipid composed of three molecules of butyrate esterified with glycerol that induces the cathelicidin gene camp after hydrolysis to butyrate. When colorectal cells GEKI 02 were stimulated with 1,25(OH)2D3 plus butyrate, a further increase of cathelicidin expression was seen after 48 hours. This effect was not seen for the incubation with Intestamin® plus butyrate. Changes in the acetylation status of core histone and non-histone proteins caused by butyrate that enhance binding of the vitamin D receptor complex as a transcription factor might be responsible for the synergistic effect of butyrate and calcitriol. To determine the influence of the MEK/ERK signalling pathway in the investigated cell lines the specific MEK/ERK inhibitor U0126 was utilized. Inhibition of the MEK/ERK pathway blocked butyrate- and Intestamin®-induced cathelicidin expression while no effect was observed for calcitriol. Although incubation with vitamin D3 and butyrate increased cathelicidin expression, the antimicrobial activity against E.coli could not be enhanced in the investigated colorectal cells. This might be caused by selection of a commensal bacterium and the absence of relevant microenvironmental stimuli because the antibacterial activity correlates with the extent of α-helicity, which is influenced by ion composition, pH, and peptide concentration. Due to the fast development of bacterial resistance to traditional antibiotics, there is increasing interest in the research on antimicrobial peptides. Exogenic factors like 1,25(OH)2D3, butyrate and Intestamin® can enhance an expression of the cathelicidin gene. Further in vivo studies, however, are necessary to verify this effect for the potential future therapeutic application.

El avance logrado en los últimos años en el conocimiento de la biología del cáncer ha permitido el desarrollo de diversas terapias oncológicas. Sin embargo, dada la complejidad de esta patología y la variabilidad de respuestas halladas en los pacientes, es necesario continuar la búsqueda y el desarrollo de terapias dirigidas con el fin de mejorar el pronóstico y la calidad de vida de los pacientes. El calcitriol, la forma activa de la vitamina D3, actúa como una hormona reguladora de la homeostasis fosfocálcica y las investigaciones desarrolladas en las últimas tres décadas avalan su potencial uso como agente antineoplásico en la prevención y tratamiento de varios tipos de cáncer. Si bien algunos ensayos clínicos realizados a la fecha han aportado resultados alentadores, en la mayoría de los casos se han evidenciado efectos colaterales, como hipercalcemia, a las dosis necesarias para lograr una respuesta antitumoral efectiva. Tales razones han llevado al diseño y síntesis de análogos del calcitriol con el objeto de hallar compuestos que conserven o superen su actividad antitumoral y carezcan de los efectos hipercalcemiantes. En este trabajo de tesis nos propusimos evaluar las propiedades antitumorales y calcemiantes de un nuevo análogo del calcitriol de tipo gemini que hemos diseñado y sintetizado en colaboración con un laboratorio de Química Orgánica. Demostramos que el nuevo análogo, denominado UVB1, posee efectos antineoplásicos en varias líneas celulares de cáncer. Específicamente, el UVB1 redujo la viabilidad celular mediante un mecanismo de acción que es dependiente del tipo tumoral en cuestión, es decir, el análogo ejerció acciones anti-proliferativas en células de carcinoma celular escamoso de cabeza y cuello y pro-apoptóticas en células de carcinoma colorrectal (CCR). Además, el análogo exhibió propiedades anti-metastásicas, al disminuir la capacidad migratoria e invasiva de líneas tumorales modulando la actividad de metaloproteasas implicadas en estos procesos celulares. También, el UVB1 presentó características pro-diferenciantes al aumentar la expresión de E-cadherina en células tumorales mamarias y de CCR. En relación a estos efectos antitumorales, comenzamos a evaluar los mecanismos moleculares implicados. Posteriormente, realizamos ensayos in vivo en distintos modelos animales de cáncer, lográndose reproducir los efectos antitumorales del UVB1 obtenidos en células de CCR en el modelo animal correspondiente. La importante inhibición del crecimiento tumoral en los animales tratados con el análogo fue resultado de la inducción de apoptosis, aumento de la expresión de E-cadherina y disminución de la expresión nuclear de β-catenina. En relación a la actividad calcemiante, el análogo no provocó hipercalcemia a las dosis y tiempos evaluados, ni tampoco detectamos signos de toxicidad como disminución del peso corporal de los ratones, cambios en el hematocrito o en la histología de los órganos. Por último, dado que el calcitriol y sus análogos ejercen la mayoría de sus efectos antitumorales a través de su receptor VDR, se realizaron estudios computacionales que permitieron predecir que el UVB1 es capaz de unirse con gran afinidad al receptor VDR, sugiriendo su participación en las acciones biológicas demostradas por el análogo. Los resultados obtenidos en esta tesis aportan evidencia que indica que este nuevo compuesto podría ser, solo o en combinación con otros tratamientos, un posible agente terapéutico contra el cáncer. / In recent years, progress in the knowledge of cancer biology has allowed the development of various oncology therapies. However, owing to the complexity of this pathology and the variability of responses found in cancer patients, it is necessary to continue the search and development of targeted drugs in order to improve the prognosis and quality of life of patients. The active form of vitamin D3, calcitriol, acts as a hormone that regulates phospho-calcium homeostasis, and the research over the last three decades supports its potential use in the prevention and treatment of various types of cancer. So far, some clinical trials have provided encouraging results; however, at the doses necessary to achieve an effective antitumor response, side effects, such as hypercalcemia, occur in most cases. To prevent this particular undesirable effect, our research has focused on the design and synthesis of calcitriol analogs in order to obtain compounds that retain or even increase the antitumor activity but preclude the hypercalcemic effects. In this thesis we have aimed to evaluate the antitumor properties and the calcemic activity of a new gemini calcitriol analog that we have designed and synthesized in collaboration with a laboratory of Organic Chemistry. We demonstrate that the new analog, called UVB1, has antineoplastic effects on several cancer cell lines. In particular, UVB1 reduced cell viability by a mechanism of action that depends on the tumor type; specifically the analog exerted anti-proliferative actions on head and neck squamous cell carcinoma cells and pro-apoptotic effects on colorectal carcinoma (CRC) cells. In addition, the analog exhibited anti-metastatic properties by decreasing the migratory and invasive capacity of tumor cell lines and modulating the activity of metalloproteinases involved in these cellular processes. Also, UVB1 exhibited pro-differentiating features by increasing E-cadherin expression in tumor mammary and CRC cells. In relation to these antitumor effects, we began to evaluate the molecular mechanisms involved. We subsequently performed in vivo assays using different animal models of cancer, and the UVB1 antitumor effects obtained in CRC cells were successfully reproduced in the corresponding animal model. The significant inhibition of tumor growth in animals treated with the analog was a consequence of the induction of apoptosis, increase in E-cadherin expression, and decrease in nuclear β-catenin expression. In regard to calcemic activity, the analog showed lack of hypercalcemia at the doses and times evaluated, and no toxic effects, such as loss of body weight, changes in the hematocrit and in the histology of the organs of mice were observed. Finally, since calcitriol and its analogs exert their antitumor effects through their receptor VDR, we carried on computational studies that allowed us to predict that UVB1 is able to bind to VDR with high affinity, suggesting its participation in the biological actions demonstrated by the analog. The results obtained in this thesis provide evidence that this new compound could be, alone or in combination with other treatments, a potential therapeutic agent against cancer.

A pesar de los grandes avances logrados en el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades oncológicas, la sobrevida de los pacientes se ha alargado mínimamente en algunos tipos de cáncer. Por ello, resulta fundamental profundizar la búsqueda y desarrollo de terapias novedosas evaluando nuevos blancos moleculares y nuevos agentes quimioterapéuticos. La forma hormonalmente activa de la vitamina D3, el 1α, 25-dihidroxiVitamina D3 o calcitriol, tiene efectos antitumorales en varios tipos de cáncer pero presenta hipercalcemia como efecto secundario, lo que dificulta la administración de la dosis necesaria para inducir una respuesta antitumoral. Es por ello, que se busca diseñar racionalmente análogos del calcitriol que posean mayores o iguales efectos antitumorales, pero que carezcan de la actividad hipercalcemiante. En este sentido, análogos de la vitamina D que poseen un grupo fosfonato en su cadena lateral han mostrado tener baja actividad calcémica. Teniendo en cuenta estos antecedentes, previamente a este trabajo de Tesis Doctoral, se diseñó y sintetizó un análogo del calcitriol denominado EM1, que contiene un grupo alquinilfosfonato en su cadena lateral. Este análogo demostró poseer potentes efectos antitumorales in vitro en diferentes líneas celulares cancerosas e in vivo en modelos animales de cáncer, y carecer de actividad hipercalcemiante en ratones, demostrando que es un buen candidato para el tratamiento de algunos tipos de cáncer. Por lo tanto, en base a la evidencia previa sobre los potentes efectos antitumorales del análogo sintético EM1; en este trabajo de Tesis Doctoral, nos propusimos sintetizar nuevos análogos fosforados de la vitamina D3, introduciendo modificaciones en la cadena lateral del análogo EM1 a partir de reducciones parciales, síntesis de oxanálogos, así como también síntesis de vinilfosfonatos vía química de cupratos y/o complejos de titanio, adición con pentacloruro de fósforo o clorofosfato de dietilo; y síntesis de bisfosfonatos. Las distintas alternativas fueron ensayadas en primera instancia con sustratos modelos, con el objeto de optimizar las condiciones de reacción para luego trabajar sobre el biciclo CD del análogo EM1. En cuanto a la estrategia de reducción, con sustratos modelos se logró controlar la reducción parcial del alquinilfosfonato, sin embargo, cuando dichas condiciones se emplearon con el biciclo CD, no se pudo controlar el grado de avance de la misma, conduciendo a la obtención del producto de reducción total del triple enlace. Además, una alternativa que se evaluó para sintetizar vinilfosfonatos, es la adición de complejos de titanio sobre alquinilfosfonatos pero lamentablemente, los resultados no fueron los esperados. Otra opción contemplada dentro del plan de trabajo, fue la adición de cupratos sobre alquinilfosfonatos. De este modo, obtuvimos vinilfosfonatos di y trisustituidos con rendimientos buenos y moderados en sustratos modelos y biciclo CD del análogo EM1. En la presente Tesis Doctoral se describe la síntesis, caracterización, evaluación biológica y computacional de un nuevo análogo del calcitriol denominado SG, el cual es un derivado del EM1. Este análogo se sintetizó a partir de la química de cupratos, y presenta un grupo vinilfosfonato disustituido en su cadena lateral. Por otra parte, se describen los métodos elegidos para la preparación de los precursores del análogo SG, como son, la síntesis del biciclo CD a partir del diol de Inhoffen y el óxido de fosfina portador del anillo A. La construcción del sistema triénico, se realizó mediante la reacción de Wittig-Horner, a través del acoplamiento entre la cetona de Grundmann con la cadena lateral modificada y el anión del óxido de fosfina. Este método permite construir el sistema triénico de manera eficiente, estereoselectiva y en condiciones suaves en las últimas etapas de síntesis. Posteriormente, se evaluó la actividad calcemiante y acción antitumoral del análogo SG, comparando sus efectos con los ejercidos por el calcitriol y el análogo EM1, con el fin de realizar estudios estructura actividad. Pudimos demostrar que SG no presenta efectos hipercalcemiantes in vivo en ratones, resultados similares al análogo sintético EM1, aunque sus efectos biológicos sobre diferentes líneas tumorales in vitro fueron escasos. Por último, realizamos los estudios in sílico de modelado y dinámica computacional para poder comprender los efectos biológicos diferenciales entre ambos análogos, y pudimos evidenciar que debido a la modificación estructural en la cadena lateral entre el vinilfosfonato SG y el alquinilfosfonato EM1, hay una considerable variación en la energía de unión específica con el receptor de vitamina D (VDR), debido a una interacción diferencial, que se refleja en los cambios observados en los efectos antitumorales. De este modo, podemos concluir que el análogo SG tiene menor afinidad al VDR, lo cual sugiere que es un mal ligando y modulador en comparación con el análogo EM1. / Despite of the great advances made in the diagnosis and treatment of oncological diseases, patient outcome has improved minimally in some types of cancer. Therefore, it is essential to deepen the search and development of novel therapies by evaluating new molecular targets and new chemotherapeutic agents. The hormonally active form of vitamin D3, 1α,25-dihydroxyVitamin D3 or calcitriol, has antitumor effects in several types of cancer but displays hypercalcemia as secondary effect, making it difficult to administer the necessary dose to induce an antitumor response. For this reason, the aim is to rationally design calcitriol analogues that display greater or equal antitumor effects, but lack hypercalcemic activity. In this regard, vitamin D analogues that have a phosphonate group in their side chain have been shown to have low calcemic activity. Taking into account these antecedents, before this Doctoral Thesis work, a calcitriol analogue called EM1 was designed and synthesized, which contains an alkynylphosphonate group in its side chain. This analogue was shown to have potent antitumor effects in vitro in differents cancer cell lines and in vivo in animal models assays, and to lack in vivo hypercalcemic activity in mice, showing that it is a good candidate for the treatment of some types of cancer. Therefore, based on previous evidence on the potent antitumor effects of the synthetic EM1 analogue; this doctoral thesis work, we set out to synthesize new phosphorous analogues of vitamin D3, introducing modifications in the side chain of the EM1 analogue from partial reductions, synthesis of oxanalogues, as well as synthesis of vinylphosphonates via chemical cuprates and/or titanium complexes, added with phosphorous pentachloride or diethyl chlorophosphate; and synthesis of bisphosphonates. The different alternatives were first tested with model substrates, in order to optimize the conditions of reaction and then work on the CD bicycle of the EM1 analogue. Regarding the reduction strategy, with models substrates it was possible to control the partial reduction of the alkynylphosphonate, however, when these conditions were used with the CD bicycle, the degree of advancement of the same could not be controlled, leading to obtaining the product of total reduction of the triple bond. In addition, an alternative that was evaluated to synthesize vinylphosphonates is the addition of titanium complexes on alkynylphosphonates, but unfortunately, the results were not as expected. Another option contemplated within the work plan was the addition of cuprates over alkynylphosphonates. In this way, we obtained di and trisubstituted vinylphosphonates with good and moderate yields on model substrates and CD bicycle of the EM1 analogue. This doctoral thesis describes the synthesis, characterization, biological and computational evaluation of a new calcitriol analogue called SG, which is a derivative of EM1. This analogue was synthesized from cuprate chemistry, and has a disubstituted vinylphosphonate group on its side chain. On the other hand, the methods chosen for the preparation of the SG analogue precursors are described, such as the synthesis of the CD bicycle from the diol Inhoffen and the phosphine oxide carrying ring A. The construction of the trienic system is performed by the Wittig-Horner reaction, through the coupling between Grundmann's ketone with the modified side chain and the phosphine oxide anion. This method allows to build the triene system efficiently, stereoselectively and under mild conditions in the last stages of synthesis. Subsequently, the calcemic activity and antitumor action of the SG analogue was evaluated, comparing its effects with those exerted by calcitriol and the EM1 analogue, in order to carry out structure-activity studies. We were able to show that SG does not have hypercalcemic effects in vivo in mice, similar results to the synthetic EM1 analogue, although its biological effects on different tumor lines in vitro were scarce. Finally, we carried out in silico modeling and computational dynamics studies in order to understand the differential biological effects between both analogues, and we were able to show that due to the structural modification in the side chain between vinylphosphonate SG and alkynylphosphonate EM1, there is considerable variation in the specific binding energy with the vitamin D receptor (VDR), due to a differential interaction, which is reflected in the changes observed in the antitumor effects. Thus, we can conclude that the SG analogue has a lower affinity to VDR, which suggests that it is not a good ligand and modulator compared to the EM1 analogue.

Base teórica: Suplementos dietéticos são comumente empregados para prevenir e tratar a deficiência de vitamina D, apesar disso, o mecanismo de absorção intestinal da vitamina D é pouco compreendido até o momento. Objetivo: Avaliar o impacto do ezetimibe na absorção da vitamina D em indivíduos saudáveis e, com isso, determinar se o transportador de colesterol Niemann–Pick C1-Like 1 participa deste processo. Métodos: Ensaio clínico randomizado, controlado e duplo-cego (ClinicalTrials.gov: NCT02234544), realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde 51 médicos residentes foram randomizados para ezetimibe 10 mg ou placebo por cinco dias. No quinto e no décimo nono dias, foram coletadas, em jejum, amostras de sangue para dosagem de 25-hidroxicolecalciferol (25OHD), hormônio paratireoidiano (PTH), cálcio e albumina. Após a primeira coleta de sangue, todos os participantes receberam uma dose única oral de 50.000 UI de colecalciferol com um lanche contendo 15 gramas de gordura. Níveis plasmáticos de 25OHD foram dosados pelo imunoensaio Diasorin Liaison®. Medidas foram comparadas por regressão linear múltipla e corrigidas pelo teste de Bonferroni. Resultados: Níveis séricos basais de 25OHD foram <30 ng/mL e <20 ng/mL em, respectivamente, todos e 82,3% dos participantes. Quatorze dias após dose única de colecalciferol 50.000 UI, a média (DP) das variações de 25OHD foi similar entre o grupo que recebeu ezetimibe e o grupo placebo, respectivamente, 8,7 (3,7) ng/mL versus 10,0 (3,8) ng/mL, p = 0,26, após ajuste para IMC e 25OHD basal. A média dos níveis séricos de 25OHD, PTH, cálcio e albumina permaneceram semelhantes em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que o ezetimibe não influenciou a variação nas médias de 25OHD após consumo de dose única de colecalciferol 50.000UI, nestes jovens saudáveis. / Background: Oral supplements are important to prevent and treat vitamin D deficiency. Despite the growing number of prescriptions, vitamin D's absorptive mechanisms are not clearly elucidated. Objective: By evaluating the effect of ezetimibe on vitamin D absorption, we aimed to determine if the cholesterol transporter Niemann–Pick C1-Like 1 transporter contributes to it. Methods: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial (ClinicalTrials.gov NCT02234544) was developed in a South Brazilian University Hospital. Fifty-one medical students were randomized to ezetimibe 10 mg/day for 5 days or placebo. On the fifth and 19th days, blood samples for 25-hydroxycholecalciferol (25OHD), parathyroid hormone (PTH), calcium, and albumin were collected. After the first blood sample collection, all participants received a single oral 50,000 IU cholecalciferol dose during a 15 g-fat meal. Serum 25OHD levels were measured by the immunoassay Diasorin Liaison®. Measurements were compared in a general linear model adjusted for multiple comparisons by the Bonferroni test. Results: Before cholecalciferol administration, 25OHD was <30 ng/mL and <20 ng/mL, respectively, in all and in 82.3% of the participants. Fourteen days after a single 50,000 IU oral dose of cholecalciferol, mean (SD) changes in serum 25OHD were similar in both groups, after adjustment to BMI and 25OHD levels, before cholecalciferol administration (p = 0.26): 8.7 (3.7) ng/mL in the ezetimibe group, versus 10.0 (3.8) ng/mL in the placebo group. Mean serum 25OHD, PTH, calcium and albumin levels remained similar in both groups. Conclusion: We concluded that ezetimibe had no effect on the mean change in serum 25OHD after a single oral dose of cholecalciferol, in healthy and young adults.

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2004--Hannover.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / A vitamina D (VD), um hormônio esteróide com diversas funções no Sistema Nervoso Central (SNC), produz inúmeros efeitos fisiológicos através de respostas genômicas mediadas pelo seu receptor (VDR). Estudos clínicos e experimentais mostram uma associação entre disfunções da VD e epilepsia. Nesse sentido, o I objetivo de nosso trabalho foi analisar a expressão relativa de RNAm do VDR na formação hipocampal de ratos nos três períodos do modelo de epilepsia do lobo temporal induzido pela pilocarpina. Ratos machos, da raça Wistar, foram divididos aleatoriamente em 5 grupos: 1- ratos controle (Grupo CTRL), 2- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados após 4 horas de status epilepticus (Grupo SE), 3¬ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 7 dias após status epilepticus (Grupo SIL 7 dias) 4- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 14 dias após status epilepticus (Grupo SIL 14 dias) 5- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 60 dias após a primeira crise espontânea (Grupo Crônico). A expressão relativa de RNAm do VDR foi determinada através da técnica do RT -PCR em tempo real. Nossos resultados demonstraram um aumento da expressão relativa de RNAm do VDR nos grupos SIL 7 dias, SIL 14 dias e Crônico, respectivamente (O,060±0,024; O,052±0,035; 0,085±0,055) quando comparado com os animais do grupo CTRL e SE, respectivamente (0,019± 0,017; 0,019±0,025). Nossos resultados sugerem que o VDR é um possível candidato a na participação do processo de epileptogênese no modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina em ratos. / Vitamin D, is a steroid hormone with multiple functions in the central nervous system (CNS), producing numerous physiological effects mediated by its receptor (VDR). Clinical and experimental studies have shown a link between VD dysfunction and epilepsy. In these lines, the purpose of our work was to analyze the relative expression of VDR mRNA in the hippocampal formation of rats during the three periods of the pilocarpine-induced epilepsy. Wistar male rats were divided into five groups: 1- control rats (CTRL group), 2 – rats that received pilocarpine and were killed 4 hr after the status epilepticus (SE group), 3 - rats that received pilocarpine and were killed 7 days after the status epilepticus (SIL 7 days group), 4 - rats that received pilocarpine and were killed 14 days after the status epilepticus (SIL 14 days group), 5 - rats that received pilocarpine and were killed 60 days after the first spontaneous seizure, (chronic group). The relative expression of the VDR mRNA was determined through real-time PCR technique. Our results showed an increase of the relative expression of the VDR mRNA in the SIL 7 days, SIL 14 days and chronic groups respectively (0,060 ± 0,024; 0,052 ± 0,035; 0,085 ± 0,055) when compared with the CTRL and SE groups (0,019 ± 0,017; 0,019 ± 0,025). These data suggest the VDR as a possible candidate participating in the epileptogenesis process of the pilocarpine model of epilepsy. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Base teórica: Suplementos dietéticos são comumente empregados para prevenir e tratar a deficiência de vitamina D, apesar disso, o mecanismo de absorção intestinal da vitamina D é pouco compreendido até o momento. Objetivo: Avaliar o impacto do ezetimibe na absorção da vitamina D em indivíduos saudáveis e, com isso, determinar se o transportador de colesterol Niemann–Pick C1-Like 1 participa deste processo. Métodos: Ensaio clínico randomizado, controlado e duplo-cego (ClinicalTrials.gov: NCT02234544), realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde 51 médicos residentes foram randomizados para ezetimibe 10 mg ou placebo por cinco dias. No quinto e no décimo nono dias, foram coletadas, em jejum, amostras de sangue para dosagem de 25-hidroxicolecalciferol (25OHD), hormônio paratireoidiano (PTH), cálcio e albumina. Após a primeira coleta de sangue, todos os participantes receberam uma dose única oral de 50.000 UI de colecalciferol com um lanche contendo 15 gramas de gordura. Níveis plasmáticos de 25OHD foram dosados pelo imunoensaio Diasorin Liaison®. Medidas foram comparadas por regressão linear múltipla e corrigidas pelo teste de Bonferroni. Resultados: Níveis séricos basais de 25OHD foram <30 ng/mL e <20 ng/mL em, respectivamente, todos e 82,3% dos participantes. Quatorze dias após dose única de colecalciferol 50.000 UI, a média (DP) das variações de 25OHD foi similar entre o grupo que recebeu ezetimibe e o grupo placebo, respectivamente, 8,7 (3,7) ng/mL versus 10,0 (3,8) ng/mL, p = 0,26, após ajuste para IMC e 25OHD basal. A média dos níveis séricos de 25OHD, PTH, cálcio e albumina permaneceram semelhantes em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que o ezetimibe não influenciou a variação nas médias de 25OHD após consumo de dose única de colecalciferol 50.000UI, nestes jovens saudáveis. / Background: Oral supplements are important to prevent and treat vitamin D deficiency. Despite the growing number of prescriptions, vitamin D's absorptive mechanisms are not clearly elucidated. Objective: By evaluating the effect of ezetimibe on vitamin D absorption, we aimed to determine if the cholesterol transporter Niemann–Pick C1-Like 1 transporter contributes to it. Methods: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial (ClinicalTrials.gov NCT02234544) was developed in a South Brazilian University Hospital. Fifty-one medical students were randomized to ezetimibe 10 mg/day for 5 days or placebo. On the fifth and 19th days, blood samples for 25-hydroxycholecalciferol (25OHD), parathyroid hormone (PTH), calcium, and albumin were collected. After the first blood sample collection, all participants received a single oral 50,000 IU cholecalciferol dose during a 15 g-fat meal. Serum 25OHD levels were measured by the immunoassay Diasorin Liaison®. Measurements were compared in a general linear model adjusted for multiple comparisons by the Bonferroni test. Results: Before cholecalciferol administration, 25OHD was <30 ng/mL and <20 ng/mL, respectively, in all and in 82.3% of the participants. Fourteen days after a single 50,000 IU oral dose of cholecalciferol, mean (SD) changes in serum 25OHD were similar in both groups, after adjustment to BMI and 25OHD levels, before cholecalciferol administration (p = 0.26): 8.7 (3.7) ng/mL in the ezetimibe group, versus 10.0 (3.8) ng/mL in the placebo group. Mean serum 25OHD, PTH, calcium and albumin levels remained similar in both groups. Conclusion: We concluded that ezetimibe had no effect on the mean change in serum 25OHD after a single oral dose of cholecalciferol, in healthy and young adults.

Base teórica: Suplementos dietéticos são comumente empregados para prevenir e tratar a deficiência de vitamina D, apesar disso, o mecanismo de absorção intestinal da vitamina D é pouco compreendido até o momento. Objetivo: Avaliar o impacto do ezetimibe na absorção da vitamina D em indivíduos saudáveis e, com isso, determinar se o transportador de colesterol Niemann–Pick C1-Like 1 participa deste processo. Métodos: Ensaio clínico randomizado, controlado e duplo-cego (ClinicalTrials.gov: NCT02234544), realizado no Hospital de Clínicas de Porto Alegre, onde 51 médicos residentes foram randomizados para ezetimibe 10 mg ou placebo por cinco dias. No quinto e no décimo nono dias, foram coletadas, em jejum, amostras de sangue para dosagem de 25-hidroxicolecalciferol (25OHD), hormônio paratireoidiano (PTH), cálcio e albumina. Após a primeira coleta de sangue, todos os participantes receberam uma dose única oral de 50.000 UI de colecalciferol com um lanche contendo 15 gramas de gordura. Níveis plasmáticos de 25OHD foram dosados pelo imunoensaio Diasorin Liaison®. Medidas foram comparadas por regressão linear múltipla e corrigidas pelo teste de Bonferroni. Resultados: Níveis séricos basais de 25OHD foram <30 ng/mL e <20 ng/mL em, respectivamente, todos e 82,3% dos participantes. Quatorze dias após dose única de colecalciferol 50.000 UI, a média (DP) das variações de 25OHD foi similar entre o grupo que recebeu ezetimibe e o grupo placebo, respectivamente, 8,7 (3,7) ng/mL versus 10,0 (3,8) ng/mL, p = 0,26, após ajuste para IMC e 25OHD basal. A média dos níveis séricos de 25OHD, PTH, cálcio e albumina permaneceram semelhantes em ambos os grupos. Conclusão: Conclui-se que o ezetimibe não influenciou a variação nas médias de 25OHD após consumo de dose única de colecalciferol 50.000UI, nestes jovens saudáveis. / Background: Oral supplements are important to prevent and treat vitamin D deficiency. Despite the growing number of prescriptions, vitamin D's absorptive mechanisms are not clearly elucidated. Objective: By evaluating the effect of ezetimibe on vitamin D absorption, we aimed to determine if the cholesterol transporter Niemann–Pick C1-Like 1 transporter contributes to it. Methods: This randomized, double-blind, placebo-controlled trial (ClinicalTrials.gov NCT02234544) was developed in a South Brazilian University Hospital. Fifty-one medical students were randomized to ezetimibe 10 mg/day for 5 days or placebo. On the fifth and 19th days, blood samples for 25-hydroxycholecalciferol (25OHD), parathyroid hormone (PTH), calcium, and albumin were collected. After the first blood sample collection, all participants received a single oral 50,000 IU cholecalciferol dose during a 15 g-fat meal. Serum 25OHD levels were measured by the immunoassay Diasorin Liaison®. Measurements were compared in a general linear model adjusted for multiple comparisons by the Bonferroni test. Results: Before cholecalciferol administration, 25OHD was <30 ng/mL and <20 ng/mL, respectively, in all and in 82.3% of the participants. Fourteen days after a single 50,000 IU oral dose of cholecalciferol, mean (SD) changes in serum 25OHD were similar in both groups, after adjustment to BMI and 25OHD levels, before cholecalciferol administration (p = 0.26): 8.7 (3.7) ng/mL in the ezetimibe group, versus 10.0 (3.8) ng/mL in the placebo group. Mean serum 25OHD, PTH, calcium and albumin levels remained similar in both groups. Conclusion: We concluded that ezetimibe had no effect on the mean change in serum 25OHD after a single oral dose of cholecalciferol, in healthy and young adults.

En la presente Tesis Doctoral se describe la síntesis, caracterización y evaluación biológica de EM1, un nuevo tipo de análogo del Calcitriol, forma hormonal de la vitamina D3. EM1 presenta como principales características, una cadena lateral modificada como un alquinilfosfonato que, restringe la libertad conformacional de la misma y limita la acción de la 24-hidroxilasa, responsable del catabolismo de dicha hormona. Además muestra una actividad biológica destacable ya que posee, por un lado, efectos antiproliferativos in vitro en varias líneas celulares cancerosas, y por otro, muestra ser selectivo ejerciendo su acción antiproliferativa sólo en la línea celular cancerosa de Sarcoma de Kaposi. Así mismo, en lo que se refiere a la actividad calcémica, principal limitación de los aná-logos con potencial aplicación terapéutica, EM1 no presentó efectos hipercalcemiantes in vivo en ratones, tanto en la dosis efectiva in vitro como en dosis superiores. El perfil biológico relevante de EM1 fue evaluado en el Laboratorio de Biología Básica del Cáncer, dirigido por los Dres. María Marta Facchinetti y Alejandro Curino (INIBIBB, Bahía Blanca), donde se aborda además el estudio de los mecanismos de acción de dicho análogo así como ensayos en modelos animales de experimentación en cáncer. Se describe la estrategia utilizada para la selección y construcción de la cadena lateral, tanto en su longitud como en la metodología con la que se incorpora la funcionalidad de fósforo. La cadena lateral se sintetiza en 5 pasos con un rendimiento global exce-lente (40%), y resulta ser un carbono más corta originando el triple enlace a través de métodos reproducibles y con buenos rendimientos; como ser la reacción de Corey-Fuchs para ge-nerar el alquinilfosfonato que emula la posición C25 del calci-triol. Por otra parte, se detallan los métodos elegidos para la preparación de los precursores del biciclo CD, como el diol de Inhoffen y del óxido de fosfina correspondiente al anillo A, así como el tipo de acoplamiento que permite construir el sistema triénico de dicho análogo a través de la reacción de Wittig-Horner, constituyendo un método eficiente y convergente para la síntesis de este tipo de análogos. Se estudiaron modifi-caciones estructurales sobre el sistema del alquinilfosfonato, mediante reacciones de reducción y de carbocupración en presencia o ausencia del sistema triénico, con el propósito de evaluar la posibilidad de generar bibliotecas de análogos que permitan realizar estudios que relacionen estructura con actividad. Por otra parte, se describen los estudios realizados para encontrar nuevas herramientas sintéticas que permitan acceder a las subunidades de la vitamina D, como ser el sistema triénico o la cadena lateral, empleando nanopartículas metálicas. En particular, las nanopartículas de titanio genera-das a través del sistema TiCl4-Li-areno(cat.), resultan ser eficientes en reacciones de homoacoplamiento de compuestos carbonílicos, permitiendo obtener sistemas olefínicos cíclicos, alicíclicos, y poliolefínicos conjugados. La metodología empleada presentó limitaciones en los acoplamientos cruzados para una serie de compuestos carbonílicos, por lo que no pudo aplicarse en forma directa para la construcción del sistema triénico de la vitamina. Finalmente, se describe la cicloadición 1,3-dipolar de azidas y alquinos terminales catalizada por na-nopartículas de cobre preparadas in situ a través del sistema CuCl2-Liareno(cat.), para rendir 1,2,3-triazoles con excelente regioselectividad. Este sistema fue aplicado exitosamente para el desarrollo de una nueva metodología que permite incorporar un triazol y un fosfonato, constituyendo un nuevo tipo de cadena lateral híbrida. El amplio espectro de aplica-ción, las condiciones suaves de reacción y la purificación sencilla de los productos de reacción, cubren los requeri-mientos de la denominada click chemistry, una herramienta sumamente útil en química medicinal. / The structural modifications on the alkynylphosphonate moiety were studied by reduction and carbocupration reactions, both in the presence and in the absence of the triene system, with the goal of generating small libraries of analogues to carry out structureactivity studies.On the other hand, it is described the development of new synthetic tools to approach the vitamin D main subunits, based on the use of metal nanoparticles (NPs). For example, titanium nanoparticles generated in situ from the TiCl4-Li-arene(cat.) system, showed to be effective in the homocoupling of a series of carbonyl compounds leading to the corresponding cyclics and alicyclic alkenes, as well as conjugated polyolefin products. The main drawback of this methodology being the poor selec-tivity in the corresponding crosscoupling reactions, making it impossible to be applied for the construction of the vitamin D triene system. Finally, it is described the application of the 1,3-dipolar cicloaddition reaction between azides and termi-nals alkynes catalysed by in situ generated CuNPs from the CuCl2-Liarene(cat.) system, which led to the corresponding 1,2,3-triazoles with excellent yield and regioselectivity. This reactive system was successfully applied in the development of a new methodology to incorporate a triazole and a phos-phonate unit, building a new type of hybrid side chain. The remarkable advantages of this new methodology, such as its wide applicability, mild reaction conditions and simple purifi-cation of the reaction products; fulfil the requirements of the click chemistry, an extremely useful tool in medicinal chemistry.