Résumé : L’adénocarcinome colorectal est parmi les plus importants cancers au Canada en terme de mortalité et morbidité. Cependant, nous n’en connaissons encore que peu, entres autres sur les voies cellulaires importantes et les protéines présentant un potentiel comme biomarqueur. Cette étude fut divisée en deux sous-projets. Sous-projet A. Il n’y a présentement aucun biomarqueur permettant de prédire la réponse à la radiothérapie comme modalité de traitement pour le cancer colorectal. Le but de ce sous-projet était de mettre au point les méthodes permettant d’effectuer une étude prospective ou rétrospective par spectrométrie de masse sur la réponse à la radiothérapie en utilisant des échantillons de tissu de patient. Des échantillons de tissu de souris et de tissu humains anonymisés ont été utilisés pour évaluer la faisabilité d’une telle étude. Différentes techniques d’extraction protéique ont été évaluées. Les extraits totaux et fractionnements subcellulaires de tissu frais ont permis une analyse appropriée des protéines cellulaires. Il en était de même pour l’extraction totale de tissus fixés. Cependant, les protéines extraites suite à microdissection au laser de tissu fixé étaient inadéquates et en nombre insuffisant. Sous-projet B. Afin d’investiguer l’importance de fonctions, voies ou protéines dans différents types de cancer colorectaux, neuf lignées cellulaires de cancer colorectal et de côlon normal ont été fractionnées en quatre compartiments subcellulaires et analysées par spectrométrie de masse. Aucun groupe de recherche n’avait analysé jusqu’à présent plus de cinq lignées et plus d’un compartiment subcellulaire à la fois. Les résultats montraient que certaines voies canoniques et fonctions cellulaires étaient de haute importance dans plusieurs des lignées analysées, dont la voie de signalisation par eIF2. De plus, les régulateurs de transcription TP53, MYC et TGFB1, pouvant être responsables des caractéristiques cellulaires observées, ont été identifiés. En conclusion, ce projet nous a permis d’améliorer nos connaissances sur les caractéristiques moléculaires d’importance dans le cancer colorectal et de mettre au point des techniques qui pourraient permettre la découverte de nouveaux biomarqueurs. / Abstract : Colorectal adenocarcinoma is one of the most important cancers in Canada in terms of mortality and morbidity. However, we still know very little on its molecular features. This study was divided into two sub-projects. Sub-project A. At this time, no biomarker has the capacity of predicting a patient’s response to radiotherapy, which is a commonly used treatment of colorectal cancer. The goal of this section was to develop the methods to conduct a prospective or retrospective mass spectrometry study on the patient response to radiotherapy, through the use of human tissues. Mouse tissues and tissues of an anonymous patient were obtained in order to evaluate the feasibility of such a study. Different protein extraction techniques were evaluated. Total lysates and subcellular fractionations of fresh tissues allowed for a successful analysis of the samples. The same was true of total lysates of fixed tissues. However, proteins extracted from cells isolated through laser capture microdissection were insufficient in numbers and their types were inconsistent with the expected results. Sub-project B. In order to study the importance of proteins and cellular functions or pathways in different types of colorectal cancers. nine cell lines originating from colorectal carcinoma and from normal colon were fractionated according to four subcellular compartments and analysed through mass spectrometry. Until now, no research group had analysed, in a single study more than 5 cell lines as well as more than one subcellular compartment at once. Some cellular functions and canonical pathways were shown to be of high importance in many of the studied cell lines, such as the signalling through eIF2 pathway. Furthermore, the transcription regulators TP53, MYC and TGFB1were identified as potentially responsible for the observed proteomic characteristics. In conclusion, this study allowed for a better understanding of important molecular caracteristics of colorectal cancer and allowed for the optimization of techniques that may serve in the discovery of new biomarkers relative to the use of radiotherapy as a treatment.

Despite significant advances in cancer treatment, clinical response remains suboptimal and there is a continued requirement for improved chemotherapeutics. The attrition rate for new therapies is high, due principally to lack of in vivo efficacy and poor pharmacodynamics. Consequently better systems are required to determine in vivo preclinical efficiency and drug-target interactions. Engineering of cancer cells to express fluorescent or bioluminescent proteins, either endogenously or under the control of specific gene promoters, and their detection by noninvasive optical imaging has the potential to improve preclinical drug development. In this study, a panel of colorectal cancer cell lines were engineered to express fluorescent and luminescent proteins either constitutively or under control of gene-promoters for the DNA damage response gene p53 or the cell cycle regulator p21, both important pharmacodynamic sensors. These cell lines were characterised for their potential as in vivo models of primary and metastatic tumour therapy response, several showing significant potential. In addition to the development of these models, this study also addressed the pharmacokinetics of different luciferase substrates and identified optimal temporal and dose characteristics for each. Furthermore, a new application for bioluminescent imaging was developed and validated for use in preclinical evaluation of vascular disrupting agents, a new generation of cancer therapeutic. This study demonstrates that despite the dynamic and variable nature of fluorescent and bioluminescent imaging, reproducible results can be obtained if appropriate precautions are taken. The models developed herein will expedite cancer drug development whilst reducing and refining the use of animals in research.

O fator IX (FIX) da coagulação sanguínea é uma proteína dependente de vitamina K de grande valor farmacêutico no tratamento da Hemofilia B, o qual é baseado na administração do fator de coagulação derivado de plasma humano ou da proteína recombinante produzida em células murinas. A terapia baseada nestas abordagens apresenta alto custo e está associada às contaminações com vírus e príons, além do desenvolvimento de inibidores de FIX. Esses efeitos aumentam o risco de morbidade e mortalidade relacionadas às hemorragias. Neste trabalho, clonamos o cDNA do FIX em um vetor lentiviral e avaliamos a expressão da proteína recombinante em duas linhagens celulares humanas. A clonagem do cDNA do FIXh no vetor de expressão lentiviral 1054 foi confirmada através da análise com enzimas de restrição específicas obtendo-se as bandas esperadas de 1407 pb e 10054 pb visualizadas em gel de agarose. As linhagens celulares 293T e SK-Hep-1 foram transduzidas com o vetor lentiviral 1054-FIX gerado em nosso laboratório e as células que apresentaram maior expressão de EGFP foram selecionadas e separadas por citometria de fluxo. A quantificação da expressão de FIXrh foi realizada por ensaios de ELISA e cromogênico. A quantificação de FIXrh total foi de 500 ng/106 células para a linhagem 293T e 803 ng/106 células para a linhagem SK-Hep-1. A atividade biológica específica de FIXh nas células 293T e SK-Hep-1 foi 0,047 UI/106 células e 0,186 UI/106 células, respectivamente. Com o intuito de avaliar o perfil de produção de FIXrh ativo ao longo do tempo, foi realizado um acompanhamento de 180 dias, no qual foi observado que a linhagem SK-Hep-1 cessou a expressão de FIX, enquanto as células 293T mantiveram a expressão durante o período. O FIXrh foi caracterizado por western blot confirmando a presença de uma banda imunoreativa esperada de 57 kDa. As linhagens 293T e SK-Hep-1 apresentaram 7,67 e 17 cópias do vetor inserido/célula, respectivamente. Considerando a importância do processo de ?-carboxilação, foi realizada uma análise da expressão gênica dos genes envolvidos neste processo, tais como o VKORC1, ?-carboxilase e o inibidor calumenina, nas linhagens celulares. Os resultados demonstraram razões elevadas entre os genes VKORC1 e calumenina e VKORC1 e ?-carboxilase nas duas linhagens. A cinética de crescimento das células foi realizada por um período de 7 dias apresentando diferenças significativas entre as células SK-Hep-1 transduzidas e não transduzidas, enquanto que as células 293T não presentaram diferenças estatísticas no crescimento celular. A suplementação do meio de cultura com íons Ca+2 e Mg+2 foi testada para avaliar sua influência na expressão de FIXrh ativo. As células 293T apresentaram melhor desempenho nas concentrações de 0,5 mmol/L de Ca+2 e 1,0 mmol/L de Mg+2 e as células SK-Hep-1 no meio de cultura não suplementado. Nossos dados indicam que a linhagem hepática SK-Hep-1 é a melhor produtora de FIXrh funcional e as comparações realizadas entre os dois tipos celulares são importantes na caracterização do comportamento de linhagens geneticamente modificadas voltadas para a expressão de proteínas recombinantes heterólogas e abre novos caminhos para futuros estudos que visam o melhoramento da produção desse tipo de proteína. / Blood coagulation factor IX is a vitamin K-dependent protein, and it has become a valuable pharmaceutical in the treatment of Hemophilia B which is based on the plasma-derived coagulation factors or recombinant protein produced in murine cells. Coagulation therapy based on these approaches has high costs and is closely associated with prion and virus contamination besides the FIX inhibitors development. These effects increase the risk for bleeding-related morbidity and mortality. The purpose of this study was to clone hFIX into a lentiviral vector and evaluate the expression of the recombinant protein in two human cell lines. The cloning of the hFIX cDNA into 1054 lentiviral expression vector was confirmed by enzymatic restriction obtaining the expected 1407 bp and 10054 bp bands in agarose gel. The 293T and SK-Hep-1 cell lines have been stable transduced with 1054-FIX lentiviral vector generated in our laboratory and the cells with higher expression of EGFP were selected and separated by flow cytometry. The quantification of the expression of rhFIX was performed by ELISA and chromogenic assays. The concentration of total rhFIX was 500 ng/106 cells in 293T cell line and 803 ng/106 cells in SK-Hep-1 cell line. The biological activity of FIX secreted by 293T and SK-Hep-1 was 0,047 UI/106 cells and 0,186 UI/106 cells, respectively. In order to evaluate the active rhFIX production profile over time, we conducted a monitoring of 180 days, which was noted that the SK-Hep-1 cell line ceased FIX expression, while 293T cells maintained the expression during this period. rhFIX was characterized by western blot analysis confirming the presence of a expected 57 kDa immunereactive band. The 293T and SK-Hep-1 cell lines showed 7.67 and 17 integrated vector copies/cell, respectively. Considering the importance of the ?-carboxylation process, we performed a gene expression analysis of genes involved in this process, such as VKORC1, ?-carboxylase and calumenin, in cell lines. The results showed high ratios among the genes VKORC1 and calumenin and among VKORC1 and ?-carboxylase in both cell lines. The cell growth kinetics was performed by a 7-day period, showed significant differences between SK-Hep-1 transduced cells and non-transduced cells, whereas 293T cells showed no difference in cell growth. Enrichment of culture medium with Ca +2 and Mg +2 ions was tested to evaluate its influence on the expression of active FIX. 293T cells showed better performance in 0.5 mmol/L Ca+2 and 1.0 mmol/L Mg +2 concentrations and SK-Hep-1 cells in culture medium control. Our data indicate that transduced SK-Hep-1 cells are the best producer of functional rhFIX, and comparisons between these two cell lines are important in characterizing the behavior of genetically modified cell lines focused on the heterologous expression of recombinant proteins and opens new avenues for future studies aimed at improving the production of this type of protein.

NTRODUÇÃO: O melanoma é um câncer de alta mortalidade tanto na medicina quanto na veterinária, devido à baixa resposta às terapias utilizadas e à capacidade de evolução metastática da doença. Avanços no campo da oncologia têm mostrado que os agentes que têm como alvo componentes do sistema imunológico, bem como as terapias molecularmente dirigidas, são muito promissores no tratamento do melanoma. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores antitumorais. O aprimoramento no vetor adenoviral inclui a inserção do tripeptídeo RGD, que permite um amplo tropismo de transdução, e o uso de um promotor responsivo a p53 para controlar expressão do gene terapêutico. Visto que o melanoma canino pode ser um modelo experimental por se tratar de um câncer de ocorrência espontânea e de comportamento biológico semelhante ao melanoma humano, procuramos testar nossa abordagem, que chamamos AdRGD-PG, neste modelo. MÉTODOS: Para isso foram estabelecidas linhagens celulares de melanoma canino para a determinação da capacidade de transdução pelos vetores adenovirais. Em seguida foi realizado o sequenciamento dos exons 4 - 8 do gene TP53 e a avaliação da expressão de genes da via de TP53 induzidos por doxorrubicina e Nutlin-3. RESULTADOS: As quatro linhagens de melanoma canino estabelecidas possuem capacidade tumorigênica e de serem transduzidas pelos vetores adenovirais. Não foram identificadas alterações na sequência do TP53 na região avaliada e a doxorrubicina promoveu aumento da expressão dos transgenes dirigidos pelo promotor PG e a ativação de genes da via de TP53. CONCLUSÕES: A funcionalidade desta plataforma adenoviral aprimorada abre oportunidades para estudos da transferência gênica, incluindo da combinação p19ARF/IFN-beta, nas linhagens estabelecidas. Com o sucesso destas análises, teremos um importante modelo experimental a ser utilizado no desenvolvimento de novas terapias para o melanoma / INTRODUCTION: Melanoma is a cancer of high mortality both in human and veterinary medicine due to the poor response to therapies and the metastatic evolution of the disease. Advances in the field of oncology have shown that agents that target immune system components, as well as molecularly targeted therapies, are very promising for the treatment of melanoma. Our group has developed viral vectors for gene transfer of antitumor factors. The improvement in the adenoviral vector includes the insertion of the RGD tripeptide, which allows a broad transduction tropism, and the use of a p53 responsive promoter to control therapeutic gene expression. Canine melanoma may be considered as an experimental model since it is a spontaneous cancer with biological behavior similar to human melanoma, thus we aim to test our approach, which we call AdRGD-PG, in this model. METHODS: For this purpose, canine melanoma cell lines were established before determining the transduction capacity of adenoviral vectors. Next, sequencing of exons 4-8 of the TP53 gene and evaluation of the expression of genes in the TP53 pathway upon induction with doxorubicin and Nutlin-3 were performed. RESULTS: The four established canine melanoma lines have tumorigenic capacity and are transduced by the adenoviral vectors. No changes were identified in the TP53 sequence in the assessed region and doxorubicin promoted increased expression of the transgenes directed by the PG promoter as well as activation of the TP53 pathway genes. CONCLUSIONS: The functionality of this improved adenoviral platform opens up opportunities for gene transfer studies, including the p19ARF / IFN-beta combination, in the established cell lines. With the success of these analyses, we have an important experimental model to be used in the development of new therapies for melanoma

Les poissons sont parmi les modèles aquatiques les plus utilisés pour l’évaluationdes dangers des substances chimiques avant leur mise sur le marché européen(REACh (Registration, Evaluation, Autorisation and Restriction of CHemicals)).Actuellement, cette réglementation ainsi que la directive européenne sur la protectiondes animaux utilisés à des fins scientifiques (2010/63/UE) promeuvent la mise enplace de méthodes alternatives en expérimentation animale. Ces méthodes ont pourbut de remplacer les modèles animaux chaque fois que cela est possible, de réduirele nombre d’animaux utilisés en expérimentation et d’optimiser la méthodologieappliquée aux animaux. Cette thèse vise à comparer la sensibilité de deux de cesoutils alternatifs, les lignées cellulaires et les tests embryo-larvaires poissons, enutilisant des toxiques modèles puis mettre en oeuvre ces outils pour évaluer la toxicitéde mélanges environnementaux de polluants : microplastiques et hydrocarbures(pétrole Arabian Light). Les composés modèles (B(a)P, Cd, MMS, PCB126) ont permisde valider trois biomarqueurs : la production d’espèces réactives de l’oxygène surlignées cellulaires de poissons, le test micronoyaux par cytométrie en flux et lechallenge infectieux sur larves de Médaka. Ces biomarqueurs associés à des analyseschimiques, biochimiques et physiologiques ont permis d’évaluer la toxicité demélanges environnementaux d’hydrocarbures (extrait aqueux de pétrole Arabian =WAF) et de microplastiques. Les WAF présentent une toxicité sur les lignéescellulaires de poissons (induction de l’activité EROD, génotoxicité) ainsi que surembryons et larves de Médaka (comportement, biométrie, EROD, génotoxicité). Lespoissons comme les cellules sont particulièrement sensibles au WAF de l’ArabianLight. La contamination aux microplastiques (MP) environnementaux a révélé unetoxicité des contaminants associés au MP sur les lignées cellulaires et les larves depoisson. L’ingestion de particules de plastiques par les larves a induit des effets létauxet sublétaux (biométrie, comportement et EROD). L’ingestion des particules plastiquespar les larves a été confirmée par microscopie biphotonique. Cette étude a permisd’évaluer la sensibilité et la complémentarité de ces outils in vitro pour l’évaluation desdangers et des risques associés aux substances chimiques. / Fish are among the most widely used aquatic model for assessing the chemicalthreat before they are placed on the European market (REACh (Registration,Evaluation, Authorization and Restriction of CHemicals)). Currently, this regulation aswell as the European directive on the protection of animals used for scientific purposes(2010/63/EU) promote the establishment of alternative methods in animal testing.These methods are intended to replace animal models whenever possible, to reducethe number of animals used in experiments and to optimize the methodology appliedto animals. This thesis aims to compare the sensitivity of two of these alternative tools,cell lines and fish embryo-larval tests, using model toxicants. Then, these tools wereused to evaluate the toxicity of environmental mixtures of pollutants: microplastics andhydrocarbons (Arabian Light oil). The model compounds (B(a)P, Cd, MMS, PCB126)valid three biomarkers: reactive oxygen species (ROS) production on fish cell lines,micronucleus assay by flow cytometry and infectious challenge on Medaka larvae andjuveniles. These biomarkers combined with chemical, biochemical and physiologicalanalyzes have assessed toxicity of environmental mixtures of hydrocarbons (aqueousextract of Arabian oil = WAF) and microplastics. WAF are toxic to fish cell lines (ERODactivity induction and genotoxicity) as well as to Medaka embryos and larvae (behavior,biometrics, EROD, genotoxicity). Fish like cells seem to be particularly susceptible toArabian Light WAF. Contamination with environmental microplastics (MP) hasrevealed a toxicity of MP-associated contaminants on cell lines and fish larvae. Theingestion of plastic particles by the larvae induced lethal and sublethal effects(biometrics, behavior and EROD). The ingestion of the plastic particles by the larvaewas confirmed by two-photon microscopy. This study assessed the sensitivity andcomplementarity of these in vitro tools for assessing hazards and risks associated withchemicals.

Na etapa inicial do desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação do metabolismo e da toxicidade é fundamental para definir seu potencial emprego como candidato a fármaco. Nestes estudos, diversos modelos in vitro são empregados, dentre eles linhagens de hepatoma humano. Entretanto, uma grande limitação ao uso deste modelo in vitro é a baixa expressão das enzimas do sistema citocromo P450. O carotenóide bixina, componente majoritário do anato (urucum), apresentou em estudos in vivo, a capacidade de induzir algumas isoformas do sistema citocromo P450, com a vantagem de apresentar baixa toxicidade. Neste trabalho, a fração lipossolúvel do anato (bixina) e hidrossolúvel (norbixina) foram avaliadas como indutores do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano. Ensaios de MTT, empregando as linhagens HepG2, C3A e SK-HEP-1 indicaram que bixina e norbixina em concentrações abaixo de 0,22 mM são seguras quanto à citotoxicidade. A expressão dos genes CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 e 3A4 foi avaliada, através de ensaios de RT-PCR em tempo real, em linhagens de hepatoma humano submetidas a tratamento com os compostos bixina e norbixina. Os resultados mostraram que células HepG2 e C3A tratadas com bixina nas concentrações de 0,05 e 0,1 mM, por períodos de 24 e 48 horas, apresentaram aumento de expressão da CYP 1A1 e CYP 1A2. Porém, a exposição de células HepG2 e C3A ao composto norbixina não resultou em aumento de expressão das isoformas avaliadas neste estudo. Os resultados deste trabalho indicaram o potencial emprego de bixina como agente indutor das CYPs 1A1 e 1A2, em linhagens de hepatoma humano utilizadas como modelo in vitro, para estudo de compostos cuja metabolização envolva uma destas vias, entretanto, estudos adicionais são fundamentais, a fim de avaliar a ação deste composto sobre outras isoformas do sistema citocromo P-450, bem como outros sistemas enzimáticos. / In the early development stage of the new drugs, the pharmacological and toxicological properties are critical to define the potential use of the candidate drug. During this stage, several in vitro models systems are employed, including human hepatoma cell lines. However, the main limitation of the use of cell lines as in vitro model is the low expression level of cytochrome P450 enzymes. A carotenoid knowed as bixin, the main pigment in the annatto (urucum), it has been reported to induce some isoforms of cytochrome P450 in rats, with the advantage of its low toxicity. In this work, the oil-soluble (bixin) and aqueous soluble extracts (norbixin) were evaluated as inducers of the cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines (HepG2, C3A, SK-HEP-1). The results of MTT assays showed that bixin concentrations below 0.22 mM were not cytotoxic in HepG2, C3A and SK-HEP-1 cell lines. Expression changes in CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 and 3A4 were evaluated, by real time RT-PCR and the results showed that the exposition to 0,05 mM and 0,1 mM bixin, for 24 and 48 hours of treatment, lead to an increase in CYP 1A1 and CYP 1A2 expression level. By contrast, the cytochrome P450 isoforms were not affected by the exposition to norbixin. In conclusion, this work indicated the potential use of bixin induced hepatoma cell lines as in vitro model for studies of biotransformation and toxicity of drugs involving CYP 1A, however, further studies are necessary to evaluate the effect of bixin on the other cytochrome P450 isoforms as well as other enzymatic systems.

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura. O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular. / Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line. Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.

Liu, Kan. / "November, 2010"--Abstract. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 116-129). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Na etapa inicial do desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação do metabolismo e da toxicidade é fundamental para definir seu potencial emprego como candidato a fármaco. Nestes estudos, diversos modelos in vitro são empregados, dentre eles linhagens de hepatoma humano. Entretanto, uma grande limitação ao uso deste modelo in vitro é a baixa expressão das enzimas do sistema citocromo P450. O carotenóide bixina, componente majoritário do anato (urucum), apresentou em estudos in vivo, a capacidade de induzir algumas isoformas do sistema citocromo P450, com a vantagem de apresentar baixa toxicidade. Neste trabalho, a fração lipossolúvel do anato (bixina) e hidrossolúvel (norbixina) foram avaliadas como indutores do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano. Ensaios de MTT, empregando as linhagens HepG2, C3A e SK-HEP-1 indicaram que bixina e norbixina em concentrações abaixo de 0,22 mM são seguras quanto à citotoxicidade. A expressão dos genes CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 e 3A4 foi avaliada, através de ensaios de RT-PCR em tempo real, em linhagens de hepatoma humano submetidas a tratamento com os compostos bixina e norbixina. Os resultados mostraram que células HepG2 e C3A tratadas com bixina nas concentrações de 0,05 e 0,1 mM, por períodos de 24 e 48 horas, apresentaram aumento de expressão da CYP 1A1 e CYP 1A2. Porém, a exposição de células HepG2 e C3A ao composto norbixina não resultou em aumento de expressão das isoformas avaliadas neste estudo. Os resultados deste trabalho indicaram o potencial emprego de bixina como agente indutor das CYPs 1A1 e 1A2, em linhagens de hepatoma humano utilizadas como modelo in vitro, para estudo de compostos cuja metabolização envolva uma destas vias, entretanto, estudos adicionais são fundamentais, a fim de avaliar a ação deste composto sobre outras isoformas do sistema citocromo P-450, bem como outros sistemas enzimáticos. / In the early development stage of the new drugs, the pharmacological and toxicological properties are critical to define the potential use of the candidate drug. During this stage, several in vitro models systems are employed, including human hepatoma cell lines. However, the main limitation of the use of cell lines as in vitro model is the low expression level of cytochrome P450 enzymes. A carotenoid knowed as bixin, the main pigment in the annatto (urucum), it has been reported to induce some isoforms of cytochrome P450 in rats, with the advantage of its low toxicity. In this work, the oil-soluble (bixin) and aqueous soluble extracts (norbixin) were evaluated as inducers of the cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines (HepG2, C3A, SK-HEP-1). The results of MTT assays showed that bixin concentrations below 0.22 mM were not cytotoxic in HepG2, C3A and SK-HEP-1 cell lines. Expression changes in CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 and 3A4 were evaluated, by real time RT-PCR and the results showed that the exposition to 0,05 mM and 0,1 mM bixin, for 24 and 48 hours of treatment, lead to an increase in CYP 1A1 and CYP 1A2 expression level. By contrast, the cytochrome P450 isoforms were not affected by the exposition to norbixin. In conclusion, this work indicated the potential use of bixin induced hepatoma cell lines as in vitro model for studies of biotransformation and toxicity of drugs involving CYP 1A, however, further studies are necessary to evaluate the effect of bixin on the other cytochrome P450 isoforms as well as other enzymatic systems.

Estudos funcionais in vitro são essenciais para a compreensão do papel de miRNAs, pequenas moléculas de RNA que desempenham papel importante na regulação gênica, no câncer. Neste estudo analisamos a viabilidade de linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço (CECP), queratinócitos orais provenientes de culturas primárias e queratinócitos imortalizados, como modelos para estudos funcionais de miRNAs previamente identificados como desregulados nesse tipo de carcinoma: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA- 196a. Com este fim avaliamos inicialmente a expressão dos quatro miRNAs em todos os tipos celulares propostos através de reações em cadeia da polimerase em tempo real específicas. As linhagens celulares de carcinoma epidermoide de boca foram previamente caracterizadas quanto ao seu perfil de sequências de DNA do tipo STR (do inglês Short Tandem Repeats ou repetições curtas em sequência) com o objetivo de confirmar a identidade da linhagem. Foram realizados ensaios para a super-expressão e inibição da expressão destas quatro moléculas na linhagem SCC25 e em queratinócitos orais derivados de cultura primária e, uma vez constatado o sucesso da transfecção, avaliamos, para cada caso, a expressão de alvos (mRNAs) validados na literatura. O impacto destas intervenções em proliferação celular, um importante processo desregulado em câncer, também foi avaliado. Os resultados apontam diferenças significativas na expressão dos miRNAs entre linhagens celulares passíveis de serem utilizadas como modelos para estudos funcionais em carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço. Ressaltam-se diferenças entre linhagens de carcinoma de língua e de faringe, bem como diferenças expressivas entre a linhagem de queratinócitos orais imortalizados e queratinócitos orais normais provenientes de culturas primárias. Conclui-se que cada modelo celular possui características particulares que os tornam mais ou menos adequados para um determinado estudo. A inibição da expressão de genes alvo em função da super-expressão do miRNA regulador foi observada apenas em parte das situações avaliadas. Este resultado decorre do fato que um alvo é regulado por diferentes miRNAs, bem como por diversos outros fatores genéticos e/ou epigenéticos, que podem variar de acordo com modelo estudado. Este resultado ressalta o fato de que seleção cuidadosa das linhagens é fundamental para conclusões precisas em estudos funcionais. A super- expressão de miRNA-10b e miRNA-196a afetou significativamente a progressão do ciclo celular tanto em SCC25 quanto em queratinócitos orais em cultivo, sugerindo um possível papel em CECP relacionado ao controle da proliferação celular. / Functional in vitro studies are fundamental for the comprehension of the role of microRNAs, small noncoding RNA molecules that function as posttranscriptional regulators, in cancer. The aim of this study was to determine the applicability of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human oral keratinocytes as models for functional studies of microRNAs previously identified as deregulated in squamous cell carcinomas of the head and neck: miRNA-1, miRNA-7, miRNA-10b e miRNA-196a. The expression level of the four microRNAs was assessed in cell lines and in primary cultures of oral keratinocytes using specific real-time polymerase chain reactions. The identity of oral squamous cell carcinoma cell lines was confirmed by means of STR (Short Tandem Repeats) profiling. We performed gainof- function and loss-of-function experiments in a HNSCC cell line, SCC25, as well as in normal human keratocytes. After successful transfection, we evaluated the expression of selected target genes. Significant differences in microRNA gene expression were observed between squamous cell carcinoma cell lines, particularly between cells lines from distinct sub-sites, and between primary culture of human keratinocytes and the immortalized keratinocyte cell line. Thus, each cell model possesses a characteristic phenotype; while one may be useful for a particular study, it may be inappropriate for another. The down-regulation of selected target genes was not observed after the over-expression of all miRNAs studied, an expected result since gene targets might be regulated by more than one microRNA, as well as by genetic and epigenetic mechanisms which are not common among all cell types. There is, therefore, an imperative for cautious selection of suitable cell lines for functional studies in cancer. Finally, the over-expression of miR-10b and miR-196a clearly interfered with cell cycle progression, suggesting a possible role in cell proliferation control for these molecules in HNSCC.