El tratamiento de Enriquecimiento Ambiental (EA) incrementa la estimulación y proporciona oportunidades más ricas y variadas de interacción con el entorno social y físico y ha demostrado ejercer una gran variedad de efectos a largo plazo a nivel neuroanatómico, neuroquímico y conductual en varias especies animales. El EA aumenta el tamaño de la corteza cerebral, incrementa las ramificaciones dendríticas y la neurogénesis hipocampal y mejora las capacidades cognitivas en una variedad de tareas. No obstante, aunque algunas investigaciones han descrito efectos diferenciales del EA en función del sexo, la gran mayoría de estudios que han evaluado los efectos del EA se han realizado con sujetos macho. Además, en humanos existen importantes diferencias de sexo en un gran número de psicopatologías, como la depresión, la esquizofrenia o la adicción a drogas, lo cual evidencia la necesidad de incluir a las hembras en los diseños experimentales. La presente tesis se propone estudiar los efectos del EA en ratas Sprague-Dawley de ambos sexos en pruebas que evalúan exploración y memoria social, reactividad emocional, mecanismos atencionales, aprendizaje y adicción a drogas a lo largo de dos bloques experimentales. El tratamiento se inició después del destete colocando a los animales en grupos de 9-12 individuos en jaulas de enriquecimiento durante 8 o 12 semanas, donde se cambiaban la configuración espacial y los objetos. Las ratas control se estabularon en grupos (2-3 individuos) en jaulas estándar. En el primer bloque experimental se realizaron dos estudios con el propósito de evaluar los efectos del EA en exploración social mediante la prueba de Discriminación Social; en reactividad emocional, mediante el Laberinto elevado en cruz, la respuesta de sobresalto ante un estímulo acústico y la respuesta del eje Hipotálamo-Pituitario-Adrenal en condiciones basales y en respuesta a la exposición a la prueba de la Tabla de agujeros; en mecanismos atencionales, mediante el paradigma de inhibición prepulso; y en aprendizaje espacial, mediante el laberinto Hebb-Williams. Los resultados de este primer bloque mostraron que el EA disminuyó la emotividad en machos y hembras como se observó por la mayor conducta en los brazos abiertos del laberinto elevado en cruz, la mayor exploración en la tabla de agujeros y la menor reactividad del eje HPA en comparación con los animales control. De manera inesperada, el EA disminuyó el porcentaje de inhibición prepulso en machos y hembras, resultado que contrastó con el efecto de mejora en la ejecución del laberinto Hebb-Williams que produjo el tratamiento en los mismos sujetos experimentales. En las pruebas de exploración y reconocimiento social, el EA mostró un efecto diferencial en función del sexo ya que aumentó la exploración y el reconocimiento social en los machos pero los disminuyó en las hembras. El segundo bloque experimental constituyó el tercer estudio, donde se evaluaron los efectos del EA en el consumo de cocaína mediante el paradigma de autoadministración intravenosa. Los resultados mostraron efectos de sexo y de tratamiento, de forma que las hembras se autoadministraron más cocaína que los machos, y el EA aumentó la autoadministración en machos y hembras de forma diferencial. Así, el EA afectó predominantemente a las hembras, quienes aumentaron la conducta de búsqueda de cocaína realizando un número mayor de respuestas en la palanca asociada a la droga. En conjunto, los resultados del presente trabajo indican que el tratamiento de EA produce efectos diferenciales en machos y hembras en función de las tareas evaluadas. / Environmental Enrichment (EE) increases stimulation and provides richer sensory, cognitive and motor stimulation through the interaction with the social and fisical environment and produces a wide range of neuroanatomical, neurochemical and behavioral effects in several animal species. Various studies have shown that EE increases brain weight and thickness, dendritic branching and length and also increases hippocampal neurogenesis and survival of newly generated neurons. With regard to cognitive function, it has been consistently shown that EE improved spatial learning in several tasks. But the results obtained from the experiments measuring the effects of EE treatment have been done mainly with male rats, though some results clearly showed sex differences in response to EE. Furthermore, a surge of findings from animals and humans have shown sex differences in several psychopathologies, as depression, esquizofrenia and drug addiction. The aim of the present thesis was to study sex differential effects of EE in Sprague-Dawley rats in tasks that measure social exploration and memory, emotional reactivity, sensoriomotor gating, spatial learning and drug addiction. The work has been divided in 2 experimental blocks: after weaning, rats were housed in groups of 9 -12 in enriched cages during 8 or 12 weeks, were the spatial configuration and objects were changed frequently. Control rats were housed in groups (2-3 animals) in standard cages. In the first experimental work we did two studies, where we studied social exploration in the Social discrimination test; emotional reactivity in the Elevated plus maze, Acoustic startle response and responsiveness of the hypothalamic-pituitay-adrenal (HPA) axis in response to the Hole board test; we measured attentional mechanisms through the prepulse inhibition paradigm; and spatial learning in the Hebb-Williams maze. The main results indicated that enriched animals appeared less emotional since they increase open arm activity, they showed more exploratory behavior in the hole board and less HPA reactivity than controls. EE showed a significant reduction of prepulse inhibition compared to control rats, in contrast with the improvement showed by the enriched rats in the Hebb-Williams maze. Furthermore, the EE effects in the patterns of social investigation were sex dependent, and EE treatment increased exploratory behavior and social discrimination in males and decreased social discrimination in females. In the second experimental block we performed the third study, where we evaluated the effects of EE on cocaine consumption by means of the intravenous self-administration paradigm. The results showed sex and treatment effects, females were more sensitivity to cocaine as shown by the greater amount of cocaine intake. EE increased self- administration in both male and female rats, but females were more affected than males as showed by the higher levels of infusions and the increase in the responses in the active lever. The results of the present thesis indicate that EE treatment produce differential effects in male and female rats in a task dependent manner.

No description available.

El PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) es un factor de crecimiento que activa la proliferación y migración de las células musculares lisas y que por consiguiente, presenta importancia fundamental en el desarrollo de la aterosclerosis. El PDGF de cadena -A y de cadena -B presentan distintas isoformas de cadena larga o corta que se diferencian según la presencia o ausencia de la secuencia codificada por el exón 6 de unión a glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son componentes glucídicos de los proteoglicanos que entre otras funciones median la actividad de los factores de crecimiento en la superficie de las células y en la matriz extracelular.En el trabajo de esta tesis doctoral nos planteamos los objetivos siguientes:- Caracterizamos la unión de las isoformas de PDGF a las diferentes especies de glicosaminoglicanos utilizando los clones de células CHO que presentan diferencias en la expresión de glicosaminoglicanos y en las hASMC (células musculares lisas provenientes de arteria humana). - Estudiamos el efecto de las diferentes isoformas de PDGF en la mitogénesis y migración en las hASMC. En este último punto, estudiamos el efecto de las isoformas de PDGF en cuanto a la inducción de la migración al azar (quimiocinesis) y la migración dirigida (quimiotaxis) hacia los factores de crecimiento.- Analizar la importancia de la interacción de las isoformas de PDGF con los glicosaminoglicanos en la activación de la mitogénesis y migración inducida por el PDGF en las hASMC. Con este fin, utilizamos la heparina como competidor soluble de la interacción con los glicosaminoglicanos e inhibidores de la sulfatación y de la síntesis de los glicosaminoglicanos.Los resultados de este trabajo nos permiten concluir que:- Las isoformas de PDGF de cadena larga (y principalmente el PDGF-A de cadena larga) que presentan la secuencia de unión a glicosaminoglicanos presentan mayor afinidad de unión a la membrana de las células CHO y hASMC.- Las isoformas de PDGF de cadena larga se unen a glicosaminoglicanos de tipo heparán sulfatos y a glicosaminoglicanos de tipo condroitín sulfatos. Las isoformas de PDGF de cadena corta se unen principalmente a heparán sulfatos.- El PDGF-B de cadena corta es la isoforma de PDGF que activa en mayor grado la mitogénesis, quimiotaxis y quimiocinesis en las hASMC.- La heparina y el clorato sódico (inhibidor de la sulfatación de los glicosaminoglicanos) inhiben de forma parcial y dependiente de concentración la mitogénesis de las hASMC activada por los factores del suero. La heparina también inhibe de forma parcial y dependiente de concentración la quimiotaxis de las hASMC inducida por los factores del suero.- La heparina inhibe en mayor grado la quimiotaxis que la mitogénesis de las hASMC activada por el PDGF-B de cadena corta.- La mitogénesis de las hASMC activada por las isoformas de PDGF se inhibe principalmente por el clorato sódico y beta-xilósido (inhibidores de la sulfatación y de las síntesis de glicosaminoglicanos respectivamente).En consecuencia, estos resultados sugieren que la secuencia codificada por el exón 6 de unión a glicosaminoglicanos presenta importancia en la inmovilización y retención de las isoformas de PDGF por parte de los glicosaminoglicanos de la superficie y de la matriz extracelular. Las isoformas de PDGF de cadena corta que no presentan la secuencia de unión a glicosaminoglicanos presentan mayor efecto inductor de la proliferación y migración de las células musculares lisas.

El pas per cada fase del cicle cel.lular està controlat per processos de fosforilació duts a terme pels enzims coneguts com a quinasses depenents de ciclines (CDKs). En les cèl.lules de mamífers, l'enzim CDK2 complexat amb la Ciclina A actua com a principal promotor del pas de la fase G1 a la fase S i de la progressió per la fase S del cicle cel.lular. Així doncs, el complexe Ciclina A-CDK2 s'uneix a diverses proteïnes reguladores en diferents moments durant la progressió del cicle cel.lular. Una d'aquestes proteïnes reguladores és p45(SKP2).La finalitat d'aquesta tesi ha estat analitzar el paper de 045(SKP2) en la progressió de la fase S del cicle cel.lular, més enllà de la seva important implicació en la ubiqüitinització de proteïnes. El projecte ha inclòs la identificació de noves interaccions proteiques de p45(SKP2) i la caracterització funcional d'aquesta interacció.

L’èxit de la transferència nuclear de cèl·lules somàtiques (SCNT) depèn de diversos factors que fan que tingui una eficiència baixa. D’una banda, l’extensa reprogramació nuclear que ha de tenir lloc per tal que el patró d’expressió del nucli somàtic transferit sigui substituït per un patró de tipus embrionari no sempre es dóna correctament. El tractament dels embrions clonats amb inhibidors de les desacetilases d’histones (HDACis) corregeix el seu estat hipoacetilat i hipermetilat, facilitant l’accés dels factors reprogramadors de l’oòcit al nucli transferit i afavorint així la reprogramació nuclear. En canvi, el paper positiu d’altres modificadors epigenètics, p. ex. les desmetilases d’histones (HDMs), és objecte de controvèrsia. D’altra banda, l’oòcit ha de patir una sèrie de manipulacions durant la SCNT que afecten la viabilitat dels embrions. En aquest sentit, s’ha vist que l’ús de latrunculina A (LatA) enlloc de citocalasina B com inhibidor de la polimerització d’actina millora el desenvolupament a terme dels embrions clonats tractats amb HDACis, però es desconeix el seu efecte sobre el desenvolupament in vitro i els embrions no tractats. A més, els embrions clonats són molt sensibles a les condicions de cultiu i actualment no es disposa de mètodes no invasius per a la predicció del seu potencial de desenvolupament que puguin incrementar les taxes d’èxit obtingudes. En aquesta tesi s’ha aconseguit millorar l’eficiència del clonatge de la soca de ratolí B6CBAF1 del 0-0,5 %, en embrions no tractats, al 3-5 % en embrions tractats amb la psamaplina A (PsA), un HDACi que no havia estat mai utilitzat en estudis de reprogramació nuclear, i/o la vitamina C (VitC), un antioxidant que a més s’ha descrit que actua com a cofactor de les HDMs amb domini Jumonji i de les proteïns de translocació deu-onze. A més, s’ha vist que la VitC incrementa significativament l’obtenció de cèl·lules mare embrionàries a partir dels embrions clonats. En canvi, no s’han pogut millorar els resultats prèviament obtinguts amb el HDACi àcid valproic (VPA), malgrat l‘increment de la concentració i durada del tractament testat. Així com s’ha vist que tant el VPA com la PsA milloren la reprogramació nuclear mitjançant un increment general dels nivells d’acetilació de les histones, no s’ha pogut detectar un efecte equivalent per a la VitC. D’altra banda, s’ha vist que la LatA millora les taxes de desenvolupament in vitro, sobretot en els embrions no tractats amb modificadors epigenètics. No obstant, aquest efecte no es tradueix en un millor desenvolupament a terme si la LatA no es combina amb un modificador epigenètic com la PsA o la VitC. Per tant, la LatA podria estar involucrada en la reprogramació nuclear i exercir un efecte sinèrgic amb els modificadors epigenètics en la SCNT. Finalment, els embrions clonats han estat monitoritzats amb un sistema de time-lapse que no perjudica el seu desenvolupament in vitro. S’ha demostrat que aquests embrions es desenvolupen més lentament que els fecundats a partir de la segona divisió, i que el tractament amb modificadors epigenètics afecta la cinètica de desenvolupament. En concret, quan els embrions clonats són tractats amb la PsA la seva divisió s’alenteix i el retard es manifesta abans. En canvi, quan són tractats amb la VitC es divideixen més ràpidament i són més semblants als embrions fecundats. S’ha pogut establir un model de predicció del potencial de desenvolupament de tots aquests embrions basat en el moment de la divisió cap a l’estadi de quatre cèl·lules, sol o combinat amb la durada de la compactació i/o la fragmentació per augmentar-ne la potència. La validació d’aquest model podria permetre la selecció dels embrions amb major potencial de desenvolupament abans de la seva transferència a femelles receptores. / Somatic cell nuclear transfer (SCNT) success depends on a wide range of factors which limit its efficiency. On one hand, the vast nuclear reprogramming that the somatic nucleus transferred must undergo for gene expression to change from a differentiated to an embryonic pattern is often defective. It is well known that treatment of SCNT embryos with histone deacetylase inhibitors (HDACis) corrects the hipoacetylation and hipermethylation of their genome, and this helps reprogramming factors in the ooplasm to gain access to the transferred nucleus, improving nuclear reprogramming. But the role of other epigenetic modifiers, such as histone demethylases (HDMs), is unclear. On the other hand, the manipulations performed on the oocyte during the SCNT protocol affect its viability. In this sense, the use of latrunculin A (LatA) instead of cytochalasin B for actin polymerization inhibition significantly improves the development to term of HDACitreated SCNT embryos. However, its effect on in vitro development and on untreated embryos is unknown. In addition, SCNT embryos are especially sensible to in vitro culture conditions and a non-invasive method for the prediction of their developmental potential, which could increase success rates, is lacking. In this thesis, the cloning efficiency of B6CBAF1 mice has been improved from 0-0.5 %, in untreated embryos, to 3-5 % in embryos treated with psammaplin A (PsA), an HDACis never used in nuclear reprogramming studies before, and/or vitamin C (VitC), an antioxidant reported ti act as a cofactor of Jumonji-domain-containing HDMs and ten eleven translocation enzymes. Both epigenetic modifiers have also proved to improve embryonic stem cell derivation from SCNT embryos. However, the cloning efficiency previously achieved treating SCNT embryos with the HDACi valproic acid (VPA) has not been improved, in spite of the increase of its concentration and exposure time tested. PsA and VPA have been shown to improve nuclear reprogramming through the increase of histone acetylation levels in SCNT embryos, but an effect of VitC on the nuclear reprogramming of SCNT embryos has not been detected. In addition, it has been shown here that LatA improves in vitro developmental rates, especially of those embryos non-treated with epigenetic modifiers. However, in order to improve full-term development, LatA has to be combined with an epigenetic modifier such as PsA or VitC. Thus, LatA could be involved in the nuclear reprogramming of SCNT embryos and might exert a synergistic effect with epigenetic modifiers. Finally, the development of SCNT embryos has been assessed with a time-lapse system that does not reduce their viability. We observed that SCNT embryos are delayed, from the second division, in comparison with fertilized embryos, and that the epigenetic modifier treatment has an effect on embryo kinetics. In particular, when embryos are treated with PsA the delay is more pronounced and appears earlier. In contrast, VitC accelerates the developmental kinetics of SCNT embryos, making them more similar to fertilized ones. A prediction model for the developmental potential of SCNT embryos (both untreated and treated) has been established, based on the time of division to the four-cell stage, alone or combined with compaction duration and/or fragmentation to increase prediction accuracy. The validation of this model would allow the selection of SCNT embryos with higher developmental potential prior to their transfer to recipient females.

La línea de investigación presentada en esta tesis representa un primer acercamiento entre los estudios sobre Hidrología y Metabolismo Social. La línea nace de la observación de que el agua es evitada en los estudios que tratan el metabolismo y de que la ciencia del agua –si bien reconoce la necesidad de evolucionar hacia la interdisciplinariedad- todavía no ha conseguido conectar los análisis enfocados en la sociedad y en los ecosistemas. La contribución que se hace en este trabajo es precisamente la definición de un marco analítico –el Metabolismo Hídrico de los Socio-ecosistemas- donde se puede establecer esta conexión y que está formado por una propuesta conceptual y un set de herramientas metodológicas. El documento se divide en tres partes donde se discuten las novedades epistemológicas, metodológicas y formales del marco. La Parte I cubre las reflexiones epistemológicas relacionadas con el marco analítico. Éstas comienzan en el Capítulo 1 con la explicación de los restos a los que la ciencia del agua se enfrenta y que están relacionados con la necesidad de encontrar marcos analíticos que puedan proporcionar inputs relevantes para la gestión integrada de los recursos hídricos (GIRH). Al igual que para el caso de otros recursos, la GIRH requiere el establecimiento de una conexión analítica de las dinámicas sociales y de los ecosistemas. La analogía del metabolismo de la sociedad, como una de las piezas claves de la Ciencia de la Sostenibilidad, es una buena opción para establecer esta conexión. Sin embargo, el concepto de metabolismo necesita ser examinado de cerca antes de su uso combinado con otras concepciones de las relaciones entre el ser humanos y la naturaleza. Tras subrayas que el metabolismo de las sociedades y los ecosistemas son dos procesos distintos per conectados, en el Capítulo 2 se propone un esquema para la descripción de las relaciones metabólicas entre ellos. En el capítulo 3, este esquema es adaptado a las condiciones específicas del agua, usando algunos de los conceptos más relevantes en socio- y eco-hidrología. De esta forma, el metabolismo hídrico del socio-ecosistema es definido como el metabolismo del sistema agua-ser humano. La Parte II describe el marco metodológico. Como un marco ampliamente establecido que es capaz de tratar los problemas de escala y de integrar narrativas, el Capítulo 4 presenta el Análisis Integrado Multi-Escala del Metabolismo Social y de los Ecosistemas (MuSIASEM). MuSIASEM se ha seleccionado como raíz y ha sido adaptado al análisis de sistemas complejos agua-ser humano. Dado que el agua presenta importantes diferencias con respecto a los análisis previos en energía, esta adaptación requiere la inclusión de nuevas escalas de análisis –el ‘problemshed’ y el ‘watershed’- y nuevas definiciones del agua como metabolito –como flujo y fondo. En el capítulo 5 se señalan las diferencias y sinergias ente MuSIASEM el análisis de la huella hídrica –como una de las herramientas de la GIRH. En la Parte III se presentan cuatro casos de estudio con dos objetivos. En primer lugar, el Capítulo 6 analiza a sostenibilidad de los patrones metabólicos en el uso del agua en Punjab y Mauricio para testear la aplicación de MuSIASEM a los estudios de agua y para mostrar cómo este tipo de análisis de formaliza. En segundo lugar, el Capítulo 7 muestra como los métodos de contabilidad del agua del análisis de la huella hídrica complementan el análisis de flujos de agua en MuSIASEM, encontrando además una referencia para su contextualización. / The research line presented in this dissertation is a first attempt to provide a bridge for the communication between Hydrological studies and Social Metabolism. It was born from the observation that water is neglected in Social Metabolism and that current water science, while certain about the need of evolving towards a more interdisciplinary field, still faces challenges in the connection of social and ecosystem analyses. The contribution made here is the definition of an analytical framework –the Water Metabolism of Socioecosystems- where this connection can be established and which is formed by a conceptual proposal and a methodological toolkit. The document is divided in three parts where the epistemological, the methodological and the formal novelties of the framework are discussed. Part I covers the epistemological reflections related to the analytical framework. It begins in Chapter 1 with the explanation of the challenges faced by current water science and that relate to the need of finding analytical frameworks that contribute useful inputs to integrated management of the water resources (IWRM). As with the case of other resources, IWRM requires the analytical connection of the social and ecosystem dynamics. As a key piece within Sustainability Science the analogy of the metabolism of societies can be used to establish this connection. However, the metabolism concept needs a close examination before its joint use with other conceptions of the relations between humans and nature. After highlighting the need of considering the societal and ecosystem metabolism of socio-ecosystems as two separate but connected processes, a conceptual scheme is proposed in Chapter 2 to describe the metabolic relations between them. In Chapter 3, this scheme is adapted to the specifics of water using some of the most relevant concepts in socio- and eco-hydrology. In this way the water metabolism of socio-ecosystems is defined as the metabolism of the coupled water-human systems. Part II describes the methodological framework. In Chapter 4 the Multi-Scale Assessment of the Societal and Ecosystem Metabolism (MuSIASEM) is presented as an established framework able to deal with the scale issues and the integration of narratives. MuSIASEM is selected as a root and adapted to the analyses of coupled water-human systems. Since water presents some differences with the previous energy-focus analyses, its adaptation requires the inclusion of new scales of analysis –problemshed and watershed- and new definitions of water as a metabolite –as flow and fund. In Chapter 5 the differences and synergies between MuSIASEM and the water footprint analysis –as one of the tools of the IWRM- are highlighted. In part III four case studies are presented with two objectives. First, Chapter 6 assesses the sustainability of the metabolic patterns I Punjab and Mauritius in order to test the adaptation of MuSIASEM to water and to show how this type of analyses is made functional. Second, Chapter 7 shows how the water footprint accounting methods can complement the analysis of the water flows in MuSIASEM and how MuSIASEM, in turn an provide a space for their contextualization. Keywords: Agriculture, Complex Systems, Integrated Water Resources Management, Flow/Fund Model, Grammar, Multilevel Matrixes, MuSIASEM, Scale Issues, Socio-Ecological System, Social Metabolism, Virtual Water, Water, Water Footprint, New Water Culture.

Aquesta tesi descriu l’ús de quantum dots (QDs) en el desenvolupament de noves eines per aplicacions biològiques. S’han utilitzat QDs comercials d’estructura core/shell de CdSe/ZnS amb propietats òptiques i electroquímiques úniques gràcies a les quals s’han desenvolupat diversos sensors òptics i electroquímics per detectar proteïnes, cèl·lules i ADN. Primerament es va descriure un protocol utilitzant QDs en immunocitoquímiques per visualitzar proteïnes intracel·lulars com la β-tubulina (proteïna de microtúbuls), la GM130 (proteïna de l’aparell de Golgi o la EEA1 (proteïna d’endosomes). L’ús de QDs va aportar una considerable estabilitat i robustesa a la tècnica, demostrant que podien ser usats rutinàriament com a marcadors òptics en immunocitoquímiques. Posteriorment es van utilitzar com a marcadors duals òptics/electroquímics per detectar cèl·lules apoptòtiques. Els QDs es van conjugar amb Annexina-V (AnnV), proteïna de reconeixement de la fosfatidilserina, que es transloca a la superfície externa de la membrana cel·lular en cèl·lules apoptòtiques. El marcador resultant va permetre l’adquisició d’imatges qualitatives utilitzant microscòpia confocal, l’obtenció d’imatges d’alta resolució utilitzant microscòpia electrònica de rastreig i la mesura quantitativa de cèl·lules apoptòtiques utilitzant citometria de flux. A més, la voltametria d’ona quadrada es va aplicar per desenvolupar un innovador biosensor electroquímic que permetia detectar cèl·lules apoptòtiques de manera ràpida, semiquantitativa i econòmica. Aquest treball va provar la versatilitat dels QDs, convertint-los en una eina única per fer estudis complets d’un estat biològic específic en cèl·lules vives, com ara l’apoptosi. Després, l’enfoc es va posar cap al desenvolupament d’un dispositiu per testar fàrmacs basat en l’ús de QDs i microfluídica utilitzant la mateixa estratègia de marcatge (QD-AnnV). Una sèrie de microcanals interconnectats es van dissenyar amb diferents geometries per dur a terme diverses funcions: el primer per preparar diferents concentracions de camptotecina (fàrmac pro-apoptòtic model), el segon per conjugar els QDs amb l’AnnV i, l’últim, per cultivar les cèl·lules i detectar l’efecte de la camptotecina en aquestes. L’ús de la microfluidica no només va fer els experiments més robustos, donat que tots els passos eren gairebé automatitzats, sinó que va fer el procés més econòmic, ja que la despesa de reactius era menor. L’exitosa detecció en chip de cèl·lules apoptòtiques va demostrar que la combinació d’eines innovadores, com els QDs i la microfluídica, pot donar lloc a una nova generació de plataformes de “punt de cura” (point of care) per testar fàrmacs. Finalment, els QDs es van utilitzar, conjugats amb estructures d’ADN en forma de forquilla anomenades Molecular beacons (MBs), per detectar àcids nucleics. Els MBs estaven modificats amb una molècula extintora de manera que, quan els QDs es conjugaven amb els MBs, la seva fluorescència s’apagava. Aquesta estratègia es va utilitzar per detectar seqüències d’ADN que, quan hibridaven amb els QD-MBs, feien obrir l’estructura de forquilla, fent recuperar la fluorescència dels QDs. A més, aquest procés es va integrar en un canal microfluídic transparent que permetia seguir en temps real tots els esdeveniments: la immobilització dels QDs al canal, la conjugació dels QDs amb els MBs i la hibridació amb l’analit a detectar. Per tant es pot concloure que, els QDs, a més de poder reemplaçar els fluoròfors orgànics, poden ser combinats amb mètodes electroquímics i altres tecnologies com la microfluídica, generant un ventall de biosensors i dispositius versàtils i alternatius. / This PhD thesis describes the use of quantum dots (QDs) in the development of new tools for biological applications. Commercial CdSe/ZnS core/shell QDs with unique optical and electrochemical properties have been used to develop a variety of optical and electrochemical sensors for the detection of proteins, cells and DNA. An optimized protocol to use QDs in immunocytochemistries is described to visualize intracellular proteins such as β-tubulin (microtubules protein), GM130 (golgi apparatus protein) and EEA1 (endosomes protein). The use of QDs provided a considerable stability and robustness to the technique, proving that they can be routinely used as optical labels in immunocytochemistry. In addition, QDs have been successfully used as dual optical/electrochemical labels to detect apoptotic cells. QDs were conjugated with Annexin-V (AnnV), a protein specific to phosphatidilserine, which is translocated to the outer surface of the plasma membrane in apopototic cells. The resulting label (QD-AnnV) provided excellent fluorescence images using confocal microscopy, high resolution images using scanning electron microscopy and a quantitative measurement of apoptotic cells using flow cytometry. Furthermore square wave voltammetry was applied to develop a novel electrochemical biosensor for a fast, semiquantitative and cheap detection of apoptotic cells. This work has proved the versatility of the QDs, making them a unique tool to be used for a complete study of a biological state of cells, such as apoptosis. Later on efforts were put towards the development of a device based on the use of QDs and microfluidics for drug screening using the same labeling strategy (QD-AnnV) and detecting apoptosis as well. Interconnected microchannels were designed with different geometries to perform specific tasks: the first one to prepare different concentrations of camptothecin (the pro-apoptotic drug used as model for drug screening), the second to carry out the conjugation of QDs with AnnV, and the last to culture the cells and detect the effect of the drug on them. The use of microfluidics did not only made the experiments more robust, since all the steps were mostly automated, but also more economic as less amount of reagents were required.. The successful fluorescence detection of apoptotic cells in the chip demonstrated that the combination of novel tools, such as QDs and microfluidics, allows for a new generation of point of care platforms for drug screening. Finally, QDs were also used for the detection of nucleic acids. QDs were conjugated with specific hairpin structures of DNA so called molecular beacons (MBs). MBs were modified with a quencher so, when QDs were conjugated to them, their fluorescence was turned off. This strategy was used to detect specific DNA targets which, while hybridized with the QDs-MBs hybrids, opened the hairpin structure making the fluorescence of QDs recovery from their quenching state. Furthermore, we integrate all this process in a transparent microfluidic channel, which let us monitor in real time all the steps, from the immobilization of QDs on the channel surface, followed by the conjugation with MBs and up to the hybridization of the target analyte. Thus, QDs are not only able to replace organic dyes as fluorescent labels, but they can also be combined with electrochemical methods and microfluidics, generating whole new alternatives in biosensing and drug screening.

Els micromaterials i nanomaterials presenten unes propietats fisicoquímiques úniques i controlables, les quals han permès la creació d’eines innovadores per tal d’afrontar alguns dels reptes que presenten diferents branques de la ciència i tecnologia, incloent la medicina moderna. El creixement exponencial de la microtecnologia i nanotecnologia en els últims anys ha generat la necessitat de conèixer millor el comportament dels micromaterials i nanomaterials en ambients fisiològics, especialment a nivell cel·lular, per tal d’assegurar un desenvolupament segur i eficient. En aquest context, l’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la interacció entre diferents tipus de micropartícules i cèl·lules. Amb aquesta finalitat, es van dur a terme tres treballs diferents. Primer, s’ha avaluat l’impacte del recobriment de micropartícules amb lípids i polímers catiònics en la seva internalització en cèl·lules no fagocítiques HeLa. En concret, s’ha observat que la utilització de PEI a una concentració de 0.05 mM presenta el millor balanç entre eficiència d’internalització i citotoxicitat. En segon lloc, s’ha analitzat si la modificació de la superfície de les micropartícules té un efecte diferent segons la línia cel·lular utilitzada. En concret, s’ha observat que les cèl·lules epitelials mamàries tumorals (SKBR-3) i no tumorals (MCF-10A) mostraven diferències significatives, tant pel que fa a la eficiència d’internalització de micropartícules com als mecanismes d’endocitosi involucrats. Finalment, s’ha demostrat que els xips intracel·lulars compostos de polisilici, crom i or, són bons candidats per a la seva utilització en aplicacions biològiques, ja que presenten una alta biocompatibilitat i són capaços de desenvolupar diferents funcions mitjançant la seva bifuncionalització. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi posen de manifest la importància de determinar la citotoxicitat, l’eficiència d’internalització, la localització intracel·lular i l’efecte de la línia cel·lular a l’hora de dissenyar nous microsistemes i nanosistemes per tal de maximitzar la seva eficiència i minimitzar els efectes adversos. / Los micromateriales y nanomateriales presentan propiedades fisicoquímicas únicas y controlables que han permitido la creación de herramientas innovadoras para abordar algunos de los mayores retos que presentan distintas ramas de la ciencia y tecnología, incluyendo la medicina moderna. El crecimiento exponencial de la microtecnología y nanotecnología durante los últimos años ha generado la necesidad de comprender el comportamiento de los micromateriales y nanomateriales en ambientes fisiológicos, especialmente a nivel celular, para conseguir un desarrollo eficiente y seguro. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis ha sido estudiar las interacciones entre diferentes tipos de micropartículas y células. Para ello, se han llevado a cabo tres estudios diferentes. Primero, se ha evaluado el impacto del recubrimiento de micropartículas con lípidos y polímeros catiónicos en la internalización de estas en la línea celular no fagocítica HeLa. Se ha determinado que utilización de PEI a una concentración de 0.05 mM presenta el mejor balance entre internalización y citotoxicidad. En segundo lugar, se ha analizado si la modificación de la superficie de las micropartículas tenía un efecto diferente según la línea celular utilizada. Concretamente, se ha observado que las células epiteliales mamarias tumorales (SKBR-3) y no tumorales (MCF-10A) presentaban diferencias significativas con respecto a la eficiencia de internalización y a los mecanismo de endocitosis involucrados. Finalmente, se ha demostrado que los chips intracelulares compuestos de polisilicio, cromo y oro, son buenos candidatos para su utilización en aplicaciones biológicas, ya que muestran una alta biocompatibilidad y son capaces de desempeñar distintas funciones mediante su bifuncionalización. En conjunto, los resultados de esta tesis ponen de manifiesto la importancia de determinar la citotoxicidad, eficiencia de internalización, localización intracelular y el efecto de la línea celular de los nuevos microsistemas y nanosistemas para maximizar su eficiencia y minimizar sus efectos adversos. / The unique and controllable physico-chemical properties of micro- and nanomaterials have allowed the creation of ground-breaking approaches to overcome some of the major challenges of different branches of technology and science, including modern medicine. The fast advances in micro- and nanotechnology have lead to an increasing demand for understanding the behaviour of micro- and nanomaterials within the physiological environments as well as their interactions at the bio-interface, including the cellular level, for an efficient and safe development. In this scenario, the present Thesis aimed to provide an integrated understanding about microparticle interactions with cells. First, we assessed the impact of cationic lipids and polymer coating of microparticles on their uptake by non-phagocytic (HeLa) cells. We found that non-covalently conjugated PEI at a 0.05 mM concentration offers the best balance between uptake efficiency and cytotoxicity. Second, we observed that surface modified microparticles were differently uptaken by tumoral (SKBR-3) and non-tumoral (MCF-10A) human breast epithelial cells, not only in terms of uptake efficiency but also of their endocytic pathways. Third, we demonstrated that polysilicon-chromium-gold multi-material intracellular chips (MMICCs) are suitable for biological applications due to their biocompatibility and capability of developing multiple functions through their bi-functionalization using orthogonal chemistry. Collectively, our results highlight the importance of assessing cell-particle interactions, in terms of cytotoxicity, uptake, intracellular location and cell type effect of newly designed micro- and nanomaterials, not only with respect to the target cells but also the neighbouring cells, in order to ensure their safety and efficiency.

Els models de malalties són una eina bàsica per la comprensió de les malalties humanes. Actualment, la majoria de la informació de la que disposem de malalties humanes es basa en models animals. Tot i això, els models animals difereixen molecular i fenotípicament dels humans, i no sempre reprodueixen fidelment la malaltia humana. En les últimes dècades, les cèl·lules mare humanes s’han establert com una opció molt interessant en el camp de la modelització cel·lular. En aquest treball hem volgut caracteritzar les cèl·lules mare embrionàries com a models per a l’estudi de la inestabilitat de la repetició de trinucleotids a la distròfia miotonica tipus 1 (DM1) i la malaltia de Huntington (HD). Així mateix, hem volgut estudiar la inactivació del cromosoma X amb la intenció de fer servir linees cel·lulars com a models per l’estudi del desenvolupament embrionàri humà. A la primera part d’aquest treball, hem observant una inestabilitat de repeticions de trinucleotids significativa al locus de la malaltia DM1 de les cèl·lules mare estudiades. La diferenciació d’aquestes cèl·lules va estabilitzar el número de repeticions. L’estabilització de les repeticions va ser concomitant amb la regulació a la baixa de l’expressió de gens involucrats en els mecanismes de reparació cel·lular. Posteriorment a la publicació del nostre article, altres grups varen reproduir els nostres resultats, però en aquest cas utilitzant cèl·lules mare induïdes. Els estudis recolzen la reproductibilitat dels nostres resultats, suggerint que poden ser extrapol·lats a altres linees de cèl·lules mare arreu del mon. Referent a la mutació de HD, varem trobar que era estable en totes les condicions estudiades, en cèl·lules indiferenciades, diferenciades a progenitors d’os, teratomes i progenitors neurals. Aquests resultats estan en concordancia amb els resultats obtinguts per altres grups que descriuen un baix nombre de repeticions al locus de HD. Per altra banda, varis grups han descrit la presencia de inestabilitat de les repeticions en cèl·lules diferenciades a la linea neural. La discrepància entre els nostres resultats i aquests últims podria ser deguda a la obtenció de cèl·lules neurals menys madures en el moment del nostre estudi. A la segona part d’aquesta tesis hem estudiat la inactivació del cromosoma X en 23 línies femenines de cèl·lules mare pluripotents. Vàrem observar una ràpida progressió de les cèl·lules de dependència de XIST en la inactivació del cromosoma X cap a un estat d’adaptació al cultiu que es caracteritza per un estadi de inactivació independent de l’expressió de XIST i amb una erosió de la metilació. També describim un patró d’inactivació esbiaixat en la majoria de les línies estudiades, contrari al patró aleatori observat en cèl·lules femenines adultes. A més a més, aquest patró és independent de XIST, de l’origen del cromosoma X i d’aberracions cromosòmiques. Aquests resultats suggereixen que el patró esbiaixat observant esta dirigit provablement per l’activació o repressió d’al·lels específics que es troben en el cromosoma X i que li confereixen a la cèl·lula un avantatge respecte a les altres cèl·lules. En conclusió, les cèl·lules mare pluripotents semblen ser un bon model in vitro per a l’estudi d’ambdues malalties, DM1 i HD, ja que presenten el mateix patró d’inestabilitat de la repetició del trinucleotid que s’observa in vivo. Cal remarcar també la depencia Overall, hPSC appear to be a good in vitro model for the study of both DM1 and HD TNR instability, as the repeat follows in vitro the same patterns as found in vivo, including its dependency of the MMR machinery, particularly in the case of DM1. However, our results on the study of the X chromosome inactivation (XCI) state suggest caution when using hPSC as early human developmental research models. The eroded state of XCI found in many of the hPSC lines, and the frequency of skewed XCI patterns suggests that these cells are not a good proxy to early embryonic cells, at least what XCI is concerned. Conversely, they may still provide an interesting model to study gene function and mechanisms implicated. / Disease modelling is an essential tool for the understanding of human disease. Currently, much of the information we have on human diseases is based on animal models. However, animal models differ molecularly and phenotypically from humans, and are not always suitable to reproduce with fidelity human diseases. In the past decades, human pluripotent stem cells (hPSC) have emerged as an interesting option in the field of cellular modelling, this development recently having taken up much momentum. In this work, we aimed at characterizing hPSC as models for the study of Myotonic dystrophy type 1 (DM1) and Huntington’s disease (HD) trinucleotide repeat (TNR) instability and to investigate the status of the X-chromosome inactivation with an eye on using these cells as models for early human development. In the first part of our work, we observed a significant TNR instability for the DM1 locus in hESC, and that differentiation resulted in a stabilization of the repeat. This stabilization was concommitant with a downregulation of the mismatch repair (MMR). Our results were later replicated in hiPSC by other researchers, showing their reproducibility and suggesting they may be extrapolated to other hPSC lines worldwide. Regarding the HD repeat, we found it was very stable in all conditions studied, both in undifferentiated hESC and cells differentiated into osteogenic progenitor-like cells, teratoma cells and neural progenitors. This is in line with other studies showing that hESC show very limited TNR in the HD locus. On the other hand, some groups have now reported some instability of this locus in cells differentiated into the neuronal lineage. The instability seen in neuronal lineage in later studies, not in our study, is probably explained by the use of hPSC derived neurons more similar to the cells showing in vivo instability than the ones we were able to generate at the time of the study. In the second part of the thesis we studied the X-chromosome inactivation in 23 female hPSC lines. We found that hPSC rapidly progress from a XIST-dependent XCI state to a culture-adapted, XIST-independent XCI state with loss of repressive histone modifications and erosion of methylation. We also report a remarkably high incidence of non-random XCI patterns, and that this skewing of the methylation patterns is independent from the transition to the XIST-independent XCI state, the origin of the X chromosome or chromosomal aberrations. These results suggest that XCI skewing is possibly driven by the activation or repression of a specific allele on the X chromosome, conferring a growth or survival advantage to the cells. Overall, hPSC appear to be a good in vitro model for the study of both DM1 and HD TNR instability, as the repeat follows in vitro the same patterns as found in vivo, including its dependency of the MMR machinery, particularly in the case of DM1. However, our results on the study of the X chromosome inactivation (XCI) state suggest caution when using hPSC as early human developmental research models. The eroded state of XCI found in many of the hPSC lines, and the frequency of skewed XCI patterns suggests that these cells are not a good proxy to early embryonic cells, at least what XCI is concerned. Conversely, they may still provide an interesting model to study gene function and mechanisms implicated.

Las neoplasias mieloproliferativas (NM) son enfermedades clonales originadas en una célula madre hematopoyética caracterizadas por la proliferación de células maduras de una o varias líneas mieloides y que presentan cierto riesgo de progresión a leucemia aguda o a presentar fallo medular debido a la aparición de mielofibrosis, durante la evolución de la enfermedad. En el año 2005 se describió la mutación JAK2V617F que se detecta en el 95% de la Policitemia Vera (PV) y en el 60% de la Trombocitemia Esencial (TE) y la Mielofibrosis Primaria (MFP). Posteriormente, se describieron otros marcadores moleculares implicados en vías de señalización (LNK, SOCS, CBL), en procesos epigenéticos (TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, EZH2) o en la maquinaria del splicing del ARN mensajero (SF3B1, SRSF2, U2AF1). En general, estos marcadores se observan en bajos porcentajes en las NM y ninguno es específico de estas enfermedades. Más recientemente, a finales del año 2013, se reportó la presencia de mutaciones en el gen CALR en un 49-84% de las TE y un 67-88% de las MFP JAK2V617F negativas, convirtiéndose en el segundo marcador molecular más frecuente de las NM. Desde su descubrimiento, la mutación JAK2V617F ha sido un criterio para el diagnóstico de las NM clásicas (PV, TE, MFP). Dada su elevada frecuencia, las mutaciones en CALR ya se han propuesto como futuro criterio diagnóstico a incluir en las próximas guías de clasificación de la OMS, mientras que el papel a nivel diagnóstico de otros marcadores es más limitado. Sin embargo, existen varios estudios que reportan que la presencia de alteraciones adicionales a JAK2 o CALR pueden tener un papel en la progresión de la TE o la PV a mielofibrosis o leucemia aguda mieloide. El objetivo principal del trabajo fue identificar si la detección de una hematopoyesis clonal puede tener un papel en la transformación de las NM. Los dos primeros trabajos se basaron en el estudio de una cohorte de pacientes, principalmente con TE JAK2V617F negativos. Lo resultados mostraron que la presencia de alteraciones en nuevos marcadores moleculares como TET2, ASXL1, IDH1/2 y c-CBL son infrecuentes en este grupo de pacientes. También se observó que en la TE JAK2V617F negativa, la detección de clonalidad hematopoyética mediante el análisis del patrón de inactivación del cromosoma X, analizando el polimorfismo del gen HUMARA, se asocia a mayor riesgo de transformación mielofibrótica. Además, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos, se observó cierta tendencia a la asociación entre presentar alteraciones distintas a JAK2V617F y la transformación de la enfermedad. En el tercer trabajo, se realizó un estudio mutacional de nuevos marcadores, en una cohorte de pacientes con mielofibrosis post-trombocitémica (MF post-TE) y mielofibrosis post-policitémica (MF post-PV) y se comparó con el de los pacientes con NM en fase crónica. Los resultados mostraron que la presencia de mutaciones en los genes del spliceosoma son infrecuentes en la TE y PV en fase crónica, y que existe un perfil de mutaciones de los genes de la maquinaria del splicing distinto entre los pacientes con MFP y los pacientes con MF post-TE o MF post-PV. De forma similar, en el grupo de TE y PV con mielofibrosis secundaria, no se pudo demostrar significación estadística entre la presencia de mutaciones adicionales a JAK2 y el riesgo de transformación mielofibrótica. Aun así, cabe destacar que la incidencia de mutaciones era superior en los pacientes evolucionados respecto a los de fase crónica, acorde también a lo descrito en la literatura. / Myeloproliferative neoplasms (MPN) are clonal diseases originated from a hematopoietic stem cell characterized by proliferation of mature cells of one or more myeloid lineages and presenting a risk of progression to acute leukemia or bone marrow failure due to the appearance of myelofibrosis, during the evolution of the disease. In 2005, the JAK2V617F mutation was described in 95% of Polycythemia Vera (PV) and 60% of Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF) patients. Later, other molecular markers involved in cell signaling pathways (LNK, SOCS, CBL), epigenetic processes (TET2, ASXL1, IDH1, IDH2, EZH2) and in the splicing machinery of messenger RNA (SF3B1, SRSF2, U2AF1) were described. In general, these markers are found in MPN in low percentages and none of them is specific for these diseases. More recently, in late 2013, the presence of mutations in the CALR gene were reported in 49-84% of ET and 67-88% of PMF JAK2V617F negative, becoming the second most frequent molecular marker in MPN. Since its discovery, the JAK2V617F mutation has been a criterion for the diagnosis of classical MPN (PV, ET, PMF). Given its high frequency, mutations in CALR have already been proposed as a diagnostic criteria to be included in the next guide of the MPN WHO’s classification, while the diagnostic relevance of other markers is more limited. However, several studies have reported that the presence of additional alterations to JAK2 or CALR may have a role in the progression of ET and PV to MF or LAM. The main objective of this work was to identify whether the detection of a clonal hematopoiesis may have a role in the transformation of a MPN. The first two works were based on the study of a cohort of patients, mainly with JAK2V617F negative ET. Results showed that the presence of alterations in new molecular markers as TET2, ASXL1, IDH1/2 and c-CBL are infrequent in this group of patients. In addition, it was also observed that the detection of clonal hematopoiesis, by analyzing the X chromosome inactivation pattern (analyzing the HUMARA gene polymorphism), in JAK2V617F negative ET, is associated with an increased risk of myelofibrotic transformation. Moreover, although results were not statistically significant, a tendency to association between the presence of additional alterations to JAK2V617F and transformation of the disease was also observed. In the third study, a mutational study of multiple genes was performed in a cohort of patients with post-thrombocythemic myelofibrosis (post-ET MF) and post-polycythemic myelofibrosis (post-PV MF) and compared with that of patients with chronic phase MPN. Results showed that the presence of mutations in the spliceosome genes are uncommon in ET and PV in chronic phase, and that it exists a different mutational profile in the splicing machinery genes between PMF patients and post-ET MF or post-PV MF patients. Similarly, in the group of ET and PV patients who evolved to MF, statistical significance between the presence of additional mutations to JAK2 and the risk of myelofibrotic transformation could not be demonstrated. However, it was noted that the incidence of mutations in patients with secondary myelofibrosis was higher than in patients with ET or PV in chronic phase, accordingly to what has been previously described.