Los síndromes de Prader-Willi (SPW) y de Angelman (SA) son dos síndromes de desarrollo y conducta que ocurren con una frecuencia 1/15.000-20.000 recién nacidos. Resultan de la pérdida física o funcional de genes regulados por la impronta dentro de la región 15q11-q13. SPW está asociado con la perdida de expresión de alelos paternos, mientras que el SA está asociado con la perdida de expresión de alelo materno. Aproximadamente el 70% de los pacientes SPW presentan deleción en el cromosoma paterno, el 20-30% disomía uniparental materna y el 1% defecto de impronta. En los pacientes SA el 70% presentan deleción en el cromosoma materno, el 6% disomía uniparental paterna, el 2-7% defecto de impronta, el 4-10% mutación del gen UBE3A y en el 10-12% la etiología es desconocida. El diagnóstico citogenético molecular de estos síndromes se realiza normalmente usando la combinación de varias técnicas debido a que la base genética es compleja. Nuestro laboratorio en 1991 inició los estudios de citogenética, en 1993 los estudios de FISH, en 1994 el análisis de microsatélites y en 1996 el análisis de metilación. De nuestra experiencia proponemos un algoritmo de diagnóstico molecular. Se han analizado entre los años 1991-2000, 151 pacientes y seis líquidos amnióticos con sospecha de SPW y 147 pacientes y dos líquidos amnióticos con sospecha de SA procedentes del territorio español. Las técnicas empleadas han sido el estudio del cariotipo mediante bandas G, la hibridación in situ fluorescente, el análisis de microsatélites y el análisis de metilación con detección quimioluminiscente. El diagnóstico de SPW se ha confirmado en 40 pacientes, 28 causado por deleción, cinco por disomía uniparental, dos por defecto de impronta y en cinco no se ha determinado la etiología. El SA se ha confirmado en 47 pacientes, 39 por deleción, cuatro por disomía uniparental y en cuatro no se ha determinado la etiología. Quince pacientes con sospecha de SA y estudio molecular normal han presentado una clínica típica SA, por lo que han sido considerados candidatos a presentar una mutación en el gen UBE3A o ser pacientes de etiología desconocida.Las características clínicas de los pacientes han sido recogidas por médicos especialistas, correlacionándola con la etiología. Los pacientes SPW con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a los otros grupos en hipotonía neonatal, obesidad, hiperfagia, retraso del desarrollo, hipogonadismo, manos y pies pequeños, anomalías dentales, saliva viscosa, alteraciones de comportamiento y problemas de sueño. Solo se han observado diferencias en problemas de alimentación (93% vs 50%, p=0.070) entre deleción y disomía uniparental, y en facies característica (100% vs. 50%, p= 0.069) entre pacientes con deleción y defecto de impronta. Los pacientes SA con deleción no han presentado diferencias significativas respecto a las otras etiologías en retraso en el desarrollo y del lenguaje, ataxia, risa frecuente, aleteo de manos, hipermotricidad, poca atención, microcefalia, convulsiones, EEG anormal, occipital plano, boca ancha, babeo e hipopigmentación. Las frecuencias observadas han sido semejantes a las de estudios previos. En cambio, se han observado diferencias entre deleción y disomía uniparental en problemas de alimentación (100% vs. 0%, p=0.008), protusion de la lengua (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) y comunicación por gestos (23% vs. 75%, p=0.060). Estos resultados señalan que el dismorfismo facial y la comunicación por gestos son menos severos en los pacientes con disomía. Sin embargo, no podemos concluir que el fenotipo de estos pacientes sea menos severo que el de los pacientes con deleción.Este trabajo ha permitido un mayor conocimiento molecular y clínico de estos dos síndromes que ha llevado a que seamos centro de referencia y asesores de familias afectas. / Prader-Willi (PWS) and Angelman (AS) syndromes are distinct developmental and neurobehavioral syndromes that occur at a frequency of 1/15.000-20.000 live births. Both are a results of a loss of function of imprinted genes mapped to the chromosome region 15q11-q13. PWS is associated with a loss of expression of paternally derived alleles, whereas AS is associated with a loss of expression of maternal allele. The etiology is heterogeneous: approximately 70% of PWS patients present deletion in the paternal chromosome, 20-30% maternal uniparental disomy and 1% imprinting defect. In AS, 70% present deletion in the maternal chromosome, 6% paternal uniparental disomy, 2-7% imprinting defect, 4-10% mutation of the gene UBE3A and 10-12% have an unknown etiology. Molecular and cytogenetic diagnosis is currently performed using a combination of several techniques due to the complexity of the genetic basis of these syndromes. Our laboratory began in 1991 cytogenetics studies, in 1993 studies of FISH, in 1994 microsatellites analysis and in 1996 methylation analysis. Due to our experience an algorithm for molecular diagnostic was proposed. Between the years 1991-2000, we analyzed 151 patients and six amniocentesis with suspicion of PWS and 147 patients and two amniocentesis with suspicion of AS from Spain. The techniques used were G-banding karyotype, the fluorescent in situ hybridization (FISH), microsatellite analysis and methylation analysis with chemiluminescent detection. The diagnosis of PWS was confirmed in 40 patients, 28 with deletion, five with uniparental disomy, two with imprinting defect and in five the etiology was not been determined. AS diagnosis was confirmed in 47 patients, 39 with deletion, four with uniparental disomy and in four the etiology was not determined. Fifteen patients with suspicion of AS and normal molecular study had classical AS phenotype, and they were considered candidates to present a mutation in the gene UBE3A or unknown etiology. The clinical characteristics of the patients were registered by the specialist physician. The received information was correlated with the etiology. The PWS patients with deletion did not present significant differences from the other groups regarding neonatal hypotonia, obesity, hyperphagia, developmental delay, hypogonadism, small hands and feet, dental anomalies, viscous salivates, behavioural disorders and sleep disturbance. The only differences observed were in feeding problems (93% vs 50%, p=0.070) between deletion and uniparental disomy, and in facies characteristic (100% vs. 50%, p = 0.069) among patients with deletion and imprinting defect. AS patients with deletion did not present significant differences from the other etiologies in developmental delay, absent speech, ataxia, frequent laughing, flapping of hands, hypermotricity, little attention, microcephaly, seizures, abnormal EEG, occipital groove, macrostomia, drooling and hypopigmentation. The observed frequencies were similar to those of previous studies. On the other hand, differences were observed between deletion and uniparental disomy in feeding problems (100% vs. 0%, p=0.008), protruding tongue (73% vs. 0%, p=0.011), prognatia (57% vs. 0%, p=0.051) and communication through gestures (23% vs. 75%, p=0.060). These results point out that the facial dismorfism and communication by gestures are less severe in the patients with disomy. However, we cannot conclude that the phenotype of these patients is less severe than that of the patients with deletion. This work gave us a greater molecular and clinical knowledge of these two syndromes allowing us to become a reference and advisory centre for affected families.

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs) son un conjunto de enfermedades neurodegenerativas letales que afectan tanto animales como humanos. Están causadas por unas partículas proteicas denominadas “priones”, resultantes de la transformación de la proteína priónica celular (PrP(C)) a una forma patogénica denominada PrP(SC), que se acumula en el cerebro en forma de agregados e induce la transformación de más moléculas a expensas de la reducción de los niveles de PrP(C). Hasta el día de hoy, el estudio de las prionopatías se ha centrado en la bioquímica, toxicidad y transmisibilidad de PrP(SC). Sin embargo, la pérdida de la proteína endógena puede también contribuir al desarrollo de la enfermedad. A día de hoy, la función fisiológica de PrP(C) está aún por esclarecer, aunque los análisis realizados la involucran en procesos de: i) ciclo celular y proliferación, ii) homeostasis del cobre, iii) neuroprotección, iv) transmisión sináptica y v) señalización intracelular, entre otros. Esta Tesis Doctoral aborda la función de PrP(C) en la regulación del ciclo celular y la neuroprotección, ampliando los conocimientos existentes mediante la descripción de las vías moleculares implicadas en ambos procesos. Nuestros datos describen a PrP(C) como una proteína capaz de integrar gran variedad de señales extracelulares y generar respuestas a través de la modulación de diferentes vías de señalización asociadas. Hemos observado como la modulación transitoria de los niveles de PrP(C) en una línea celular de neuroblastoma produce cambios dosis-dependientes sobre los mecanismos de proliferación celular. Estas alteraciones son debidas a la interacción de la proteína con EGFR y la consiguiente activación de las vías ERK1/2 y AKT, que incluyen entre sus dianas a elementos reguladores del ciclo celular. PrP(C) también parece ejercer cierta influencia sobre la formación de filopodios en este tipo celular, regulando la dinámica del citoesqueleto de actina por su acción sobre las Rho GTPasas, concretamente, vía Cdc42-N-WASP. Por otro lado, el uso de un modelo in vivo de excitotoxicidad por KA nos ha permitido entrar en detalle en la función neuroprotectora de PrP(C). Se conoce que tanto la susceptibilidad incrementada de los ratones Prnp-knockout a agentes convulsionantes como el daño neurotóxico derivado a nivel del hipocampo, son debidos a la activación de la vía JNK3 de muerte celular. Sin embargo, nuestros resultados obtenidos in vivo de ratones Prnp0/0 Jnk3+/+ y Prnp0/0 Jnk30/0 describen por primera vez la participación de PrP(C) en la modulación de esta vía de señalización. Hemos descrito como la proteína priónica interactúa a nivel postsináptico con la subunidad GluR6/7 de los receptores de glutamato, bloqueando por un lado la formación del complejo trimérico GluR6/7-PSD-95-MLK3 que lleva a la activación de la vía JNK3 y, por otro, modulando la actividad del receptor, que es un factor determinante de la excitabilidad neuronal incrementada propia de un episodio epiléptico. Esta Tesis Doctoral supone, por lo tanto, un avance en el conocimiento de la función fisiológica de PrP(C) y, consecuentemente, en el estudio de la fisiopatología de la enfermedad priónica. La implicación de esta proteína en procesos proliferativos esenciales durante la neurogénesis así como en la regulación de la transmisión sináptica, deja entrever que PrP(C) es esencial para el desarrollo y mantenimiento de los circuitos neuronales. Probablemente, las alteraciones derivadas de la reducción de los niveles de PrP(C) se suman a los efectos neurotóxicos de la agregación de PrP(SC), dando lugar al desarrollo de la enfermedad. Asimismo, la descripción de los mecanismos moleculares y vías de señalización reguladas por PrP(C) también abre las puertas a la identificación de nuevas dianas terapéuticas para la prevención o tratamiento de las EETs. / Transmissible spongiform encephalopathies constitute a group of fatal neurodegenerative disorders affecting both animals and humans. The causative agents of these diseases are “prions”, which are defined as proteinaceous infectious particles that result from an abnormal conformational folding of the cellular prion protein (PrPC) into a pathogenic form called PrPSC. Although the role of PrPSC has been intensively studied, the physiological function of PrPC still remains unclear. Several evidences support the notion that PrPC plays a role in different cellular processes including: i) cell cycle and proliferation, ii) copper homeostasis, iii) neuroprotection, iv) synaptic transmission and v) intracellular signaling, among others. Here we expand previous data concerning PrPC function by describing the molecular mechanisms by which PrPC regulates cell proliferation in vitro and excitotoxic cell death in vivo. First, we describe how transient overexpression of PrPC in Neuro2a cells enhances cell cycle progression after mitogenic stimulation, while the opposite effect is observed when PrPC is silenced. These effects are due in part to the interaction of PrPC with the epidermal growth factor receptor (EGFR) in the cell membrane and the consequent downstream activation of ERK1/2 and protein kinase B (AKT) pathways. We also describe PrPC-dependent filopodia formation in Neuro2a cells through the modulation of AKT-Cdc42-N-WASP pathway. In a second study, we took advantage of the Prnp0/0Jnk3+/+ and Prnp0/0Jnk30/0 mice models to analyze the neuroprotective role of PrPC against kainate-induced epileptic seizures and cell death. Our results indicate that PrPC regulates kainate receptor-mediated neurotransmission through its interaction with the GluR6/7-PSD-95-MLK3 complex and the downstream modulation of JNK3 neurotoxic signaling. These new insights into the molecular functions of PrPC help us to understand the physiopathological events underlying prion disease and other related neurodegenerative pathologies.

Las biomembranas constituyen la estructura de separación fundamental en las celulas animales, y son importantes en el diseño de sistemas bioinspirados. Su simulación presenta desafíos, especialmente cuando ésta implica dinámica y grandes cambios de forma o se estudian sistemas micrométricos, impidiendo el uso de modelos atomísticos y de grano grueso. El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de un marco computacional para entender la dinámica de biomembranas inmersas en fluido viscoso usando modelos de campo de fase. Los modelos de campo de fase introducen un campo escalar contínuo que define una interfase difusa, cuya física está codificada en las ecuaciones en derivadas parciales que la gobiernan. Estos modelos son capaces de soportar cambios dramáticos de forma y topología, y facilitan el acoplamiento de distintos fenómenos físicos. No obstante, presentan desafíos numéricos significativos, como el alto orden de las ecuaciones, la resolución de frentes móviles y abruptos, o una eficiente integración en el tiempo. En esta disertación abordamos estos puntos mediante la combinación de una discretización espacial con métodos sin malla usando las funciones base locales de máxima entropía, y una formulación variacional Lagrangiana para acoplamiento elástico-hidrodinámico. La suavidad del método sin malla genera una aproximación precisa del campo de fase y puede lidiar fácilmente con adaptatividad local, la aproximación Lagrangiana extiende de manera natural esta adaptividad a la dinámica, y la formulación variacional permite una integración variacional temporal no linealmente estable y robusta. La implementación numérica de estos métodos en un entorno de computación de alto rendimiento ha motivado el desarrollo de un nuevo código computacional. Este código integra el estado del arte de las librerías en paralelo e incorpora importantes contribuciones técnicas para solventar cuellos de botella que aparecen con el uso de métodos sin malla en computación a gran escala. El código resultante es flexible y ha sido aplicado a otros problemas científicos en varias colaboraciones que incluyen flexoelectricidad, conformado metálico, fluidos viscosos o fractura en materiales con energía de superficie altamente anisotrópica. / Biomembranes are the fundamental separation structure in animal cells, and are also used in engineered bioinspired systems. Their simulation is challenging, particularly when large shape changes and dynamics are involved, or micrometer systems are considered, ruling out atomistic or coarse-grained molecular modeling. The main goal of this thesis is to develop a computational framework to understand the dynamics of biomembranes embedded in a viscous fluid using phase-field models. Phase-field models introduce a scalar continuous field to define a diffuse moving interface, whose physics is encoded in partial differential equations governing it. These models can deal with dramatic shape and topological transformations and are amenable to multiphysics coupling. However, they present significant numerical challenges, such as the high-order character of the equations, the resolution of sharp and moving fronts, or the efficient time-integration. We address all these issues through a combination of meshfree spacial discretization using local maximum-entropy basis functions, and a Lagrangian variational formulation of the coupled elasticity-hydrodynamics. The smooth meshfree approach provides accurate approximations of the phase-field and can easily deal with local adaptivity, the Lagrangian approach naturally extend adaptivity to dynamics, and the variational formulation enables nonlinearly-stable robust variational time integration. The numerical implementation of these methods in a high-performance computing framework has motivated the development of a new computer code, which integrates state-of-the-art parallel libraries and incorporates important technical contributions to overcome bottlenecks that arise in meshfree methods for large-scale problems. The resulting code is flexible and has been applied to other scientific problems in a number of collaborations dealing with flexoelectricity, metal forming, creeping flows, or fracture in materials with strongly anisotropic surface energy.

La conexión GABAérgica septohipocámpica es un elemento crucial para el correcto funcionamiento del hipocampo y, en concreto, para determinados procesos de aprendizaje y memoria. La exquisita especificidad de contacto de este componente es la piedra angular que determina su función, pero los datos existentes sobre los mecanismos que rigen la selección de diana y sinaptogénesis de estos axones son escasos. Aunque esta conexión desempeña un papel elemental en procesos cognitivos que están afectados durante el envejecimiento y en la enfermedad de Alzheimer, en el momento en que iniciamos este proyecto había un sorprendente vacío en la literatura sobre el estado de la vía GABAérgica septohipocámpica en estas situaciones. Hemos establecido el modelo in vitro del desarrollo de la conexión septohipocámpica, mediante cultivos organotípicos que constan de septum, hipocampo y corteza entorrinal obtenidos de animales neonatales. La conexión septohipocámpica se forma en nuestro modelo in vitro manteniendo la exquisita especificidad de contacto de su componente GABAérgico. Hemos comprobado, mediante el uso de tejido proveniente de ratones knock-out para Semaforina 3C y mediante la aplicación de ectodominios bloqueantes de los receptores de Semaforina 3C, que esta molécula es prescindible para el proceso de sinaptogénesis específica de los axones GABAérgicos septohipocámpicos in vitro. Utilizando el cultivo puesto a punto también hemos demostrado que las aferencias de corteza entorrinal a hipocampo no son necesarias para que la conexión se forme de manera específica. Se ha llevado a cabo un análisis exhaustivo de la inervación y complejidad de las sinapsis de la conexión GABAérgica septohipocámpica sobre diferentes tipos de interneuronas del hipocampo de ratones wild-type a diferentes edades (2, 8 y 18 meses), así como de ratones de la cepa transgénica J20 (modelo murino de enfermedad de Alzheimer) a 2 y 8 meses de edad. Los resultados de estos experimentos muestran que durante el envejecimiento normal, en ratones wild-type de 18 meses, se produce una disminución tanto en el número de fibras GABAérgicas septohipocámpicas como en la complejidad de sus contactos sinápticos. Estos déficits de la conexión GABAérgica septohipocámpica se producen de manera acelerada en ratones J20, modelo de enfermedad de Alzheimer. En esta cepa transgénica, los déficits histológicos observados van acompañados de alteraciones funcionales: disminución en la potencia de los ritmos theta y gamma hipocámpicos. El análisis del estado funcional del hipocampo de ratones J20 demuestra que la sinapsis CA3-CA1 funciona normalmente en los animales transgénicos J20, aunque con alteraciones sutiles en la facilitación sináptica a corto plazo. Los procesos de potenciación a largo plazo (LTP) de esta sinapsis están aumentados en el modelo de EA. En un paradigma de condicionamiento operante de autoestimulación, en que los animales pueden autoadministrarse estímulos eléctricos reforzantes en el septum medial, los animales J20 presentan peor aprendizaje y ejecución de la tarea. Hemos demostrado que, en animales WT, este refuerzo operante se correlaciona con una disminución de la respuesta obtenida en la sinapsis CA3-CA1. Los transgénicos J20 no presentan tal disminución, especialmente durante los primeros días del test, y por tanto muestran peor aprendizaje y ejecución del paradigma de refuerzo operante, como se observa en nuestros resultados. En estos mismos animales, además, la inducción de LTP afecta negativamente la ejecución de la tarea reforzante ya adquirida, seguramente porque la excesiva respuesta de la sinapsis una vez potenciada cancela esa disminución de la respuesta en CA3-CA1 que es necesaria para que tenga lugar el refuerzo operante. / The septohippocampal connection is a crucial element for some learning and memory processes which are affected during aging and in Alzheimer’s disease. The GABAergic component of this pathway displays an exquisite target selection, contacting only the interneurons of the hippocampus, but the mechanisms responsible for this target selection are poorly known. In this work we have created an organotypic in vitro model of the septohippocampal connection, which has allowed us to demonstrate that neither Semaphorin 3C nor the entorhinal input to the hippocampus are factors needed for the establishment of proper contacts of the GABAergic septohippocampal pathway. The in vitro model created here also serves as a tool for studying developmental and degenerative processes of the nervous system. We have carried out an exhaustive analysis of the innervation and synapse complexity of the GABAergic septohippocampal pathway in wild-type mice during the aging process and in a mouse model of Alzheimer’s disease (J20 line). Our results show that both the number and complexity of the GABAergic septohippocampal contacts decrease during aging, and this process is accelerated in the J20 Alzheimer’s mouse model. In this transgenic strain, the histological deficits are accompanied by functional alterations: a diminution in the theta and gamma rhythms of the hippocampus. The function of the CA3-CA1 synapse of the hippocampus is normal in the J20 mice, except for subtle alterations in the short-term synaptic plasticity. The long-term potentiation processes (LTP) of this synapse are increased in the Alzheimer model. In an operant conditioning paradigm in which mice can self-stimulate the septohippocampal connection, transgenic mice of the J20 line show poorer learning and performance of the task than do wild-type mice. In nontransgenic mice, the reward in this task correlates with an increase in the CA3-CA1 response which J20 transgenic mice lack, possibly explaining their poorer performance.

Orientador: Flávio Henrique Caetano / Coorientadora: Karen Cristiane Martinez de Moraes / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Banca: Solange Aparecida Rossini de Oliveira / Resumo: Devido ao crescente impacto ambiental que grande parte de corpos d'água no Brasil vem sofrendo, tornam-se cada vez mais necessários estudos sobre as alterações causadas nesses ambientes. Dentre as substâncias contribuintes de tais alterações, destacam-se os detergentes biodegradáveis, que têm sido alvo de diversos trabalhos e, em específico, o alquilbenzeno sulfonato linear (LAS), o qual representa um dos surfactantes aniônicos mais utilizados do mercado. Em se tratando de meio aquático, já é sabida a importância das brânquias para trocas gasosas, alimentação e osmorregulação, bem como biomarcador. Lembrando que os rastros branquiais fazem parte das brânquias e que desempenham um papel importante na retenção e deglutição do alimento e, assim como os filamentos branquiais, na osmorregulação; e também a importância do fígado como principal órgão no processo de detoxificação de xenobióticos, e por isso está sujeito a alterações, uma vez que este normalmente acumula concentrações mais elevadas de substâncias tóxicas (MADUENHO et al., 2008). Este projeto pleiteou investigar as prováveis alterações morfofisiológicas (histológicas, histoquímicas e ultramorfológicas) nos rastros branquiais e no acúmulo de grânulos de lipofuscina no fígado em Prochilodus lineatus (curimbatá), quando em contato direto e constante ao contaminante. Este estudo visou também realizar uma análise molecular de expressão do gene relacionado ao acúmulo de lipofuscina e então avaliar a sensibilidade e a relevância de tais efeitos no envelhecimento precoce do fígado. Os resultados demonstram efeitos morfológicos que afetam parâmetros fisiológicos após exposição ao LAS, detectados logo nos primeiros dias de tratamento. Dentre estes, destacam-se alterações estruturais do epitélio, variação das células de muco, ambas acometidas nos .. (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Global pollution has been affecting the most of our water bodies and therefore it has turned our attention to the importance of more studies about disturbances in these environments. Among the substances that contribute to such changes, we highlight the biodegradable detergents, which have been foccus of several works and, specifically, the Linear Alkylbenzene Sulfonate (LAS), which represents one of the most commonly used anionic surfactants on the market. Concerning to aquatic environment, it is already known the importance of gills for gas exchange, feeding, osmoregulation and biomarker as well. Regarding that gill rakers belong to gills and play an important role in retention and food swallowing and, like the gill filaments, in osmoregulation; also the importance of the liver like the main organ in xenobiotic detoxification process, and therefore it is subjected to changes, since this usually accumulates higher concentrations of toxic substances (MADUENHO et al., 2008). Our project aimed to investigate the likely morphophysiological alterations (histological, histochemical and ultra-morfphological) in gill rakers and the lipofuscin accumulation in Prochilodus lineatus (curimbatá), when in direct and constant contact to contaminants. We also wished to accomplish molecular analysis of gene expression related to lipofuscin accumulation and then evaluate sensitivity and importance of such effects in liver premature aging. Results show morphological alterations affecting physiological parameters after exposure to contaminant, immediately detected during the beginning of treatment. Among them, we stand out structural changes in epithelium, variation in mucus cells, both them affected in gill rakers and also in lipofuscin accumulation in the liver together with gene expression enlargement, further worsening according to increased exposure time and to higher surfactant concentration / Mestre

Resumo: O câncer de próstata e a hiperplasia prostática benigna são as duas principais afecções do sistema genital masculino após a quinta década de vida. Além de aspectos étnicos, etários, genéticos, estudos sobre a contaminação ambiental por agentes químicos carcinogênicos, dos hábitos alimentares e do estilo de vida vêm adquirindo importância no entendimento das causas destas afecções. A exposição a contaminantes ambientais, tais como o cádmio e a ingestão de bebidas contendo cafeína têm sido associados com o aparecimento do câncer de próstata e com a hiperplasia prostática benigna, respectivamente. Além disso, existem evidências experimentais de que a exposição da próstata em períodos críticos da sua morfogênese e de rápido crescimento a disruptores endócrinos pode gerar alterações permanentes que levarão ao aparecimento de afecções nos indivíduos adultos e idosos. Neste sentido, por exemplo, a partir da puberdade é comum os homens adquirirem o hábito de fumar e/ou de ingerir bebidas estimulantes, estando, portanto, expostos ao cádmio, presente na fumaça do cigarro, e/ou a cafeína, presente nas bebidas. Desta forma, este trabalho avaliou os efeitos, isolados e combinados, do cádmio e da cafeína, em baixas concentrações, sobre a morfologia e fisiologia da próstata de ratos púberes. Para isto, ratos Wistar com 60 dias de idade foram divididos em quatro grupos (n=15), os quais receberam, via oral, na água de beber, pelo período de 30 dias: Água, Cádmio (10ppm), Cafeína (10mg/l) ou Cafeína+Cádmio, e as próstatas dorsolaterais e ventrais foram processadas histologicamente e foram feitas análises morfológicas, citoquímicas para fibras de colágeno, morfométricas e imunocitoquímicas. Também foram determinadas as concentrações plasmáticas de cádmio e testosterona e intra-prostática de cádmio no... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The prostate cancer and the benign prostate hyperplasia are the main male genitourinary system diseases after the fifty. Besides ethic, age and genetic aspects, studies about environmental contamination, diet and life stile have also emerged as important factors involved in the etiology of these diseases. The exposure to cadmium and the intake of caffeine-containing beverage have been associated with appearing of the prostate cancer and benign prostate hyperplasia, respectively. Furthermore, there are experimental evidences that prostate exposures to endocrine disruptors during a critic period of its morphogenesis and growth may influence the onset of late-life disease. In this sense, for example, from puberty on, many males became smokers and/or start to intake energetic beverage or even yet coffee, thus being exposed to cadmium, from cigarettes and/or to caffeine, from beverage. So, here we investigated the effects of cadmium and caffeine, isolated or combined, in low doses, on rat prostate morphology during puberty. For this, male Wistar rats (n=60), 2 months-old, were divided into four experimental groups (n=15), that received by drinking water and during 30 days: tap water, cadmium (10ppm), caffeine (10ppm), cadmium plus caffeine. The prostatic lobes ventral and dorsolateral were dissected out, weighted and processed for histology. It were made morphological and morphometrical analyses; cytochemistry for collagen and reticular fibers and immunocytochemistry for Ki-67. It were also determined the plasma concentrations of testosterone and cadmium and the ventral lobe intraprostatic concentration of cadmium. The plasma and intraprostatic concentrations of cadmium were increased in the animals treated with cadmium and cadmium plus caffeine. In the conditions of this experiment, the exposure to these two agents did not alter significantly neither the prostatic... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sérgio Luis Felisbino / Coorientador: Antônio Francisco Godinho / Banca: Sebastião Roberto Taboga / Banca: Patrícia Aline Boer / Mestre

Orientador: Helenice de Oliveira Florentino Silva / Banca: Diana Rodrigues de Pina / Banca: Maria do Socorro Nogueira Rangel / Resumo: Um planejamento para radioterapia é considerado ótimo quando todos os parâmetros envolvidos sejam eles físicos ou biológicos, foram investigados e adequados individualmente para cada paciente. Neste tipo de planejamento, a grande preocupação é com a irradiação do tumor com o mínimo dano possível aos tecidos saudáveis da região irradiada, principalmente aos órgãos de riscos. O planejamento ótimo para radioterapia pode ser auxiliado pela Programação Linear e existe uma ampla literatura abordando este assunto, mas, a maioria das formulações matemáticas publicadas não contemplam um cenário do ponto de vista de aplicações práticas, pois não incorporam determinados fatores que são de extrema importância para a construção de um planejamento real, como exemplos a atenuação do feixe de radiação e a beterogeneidade na composição dos tecidos irradiados. Assim, este trabalho apresenta uma metodologia para correção de heterogeneidade na composição dos diferentes tipos de tecidos irradiados baseado nas proporções entre seus diferentes coeficientes de atenuação linear. Esta metodologia tem como objetivo tornar as simulações de planejamentos otimizados mais próximos dos planejamentos reais e desta forma, possibilitar um estudo mais amplo e confiável, faznedo com que modelos de programação linear possam ser utilizados como ferramentas auxiliares na criação de planejamentos reais para radioterapia / Abstract: Planning for radiotherapy is considered optimal when all the parameters involved, physical or biological, have been investigated and are appropriate for each patient. In this type of planning, the major concern is with the irradiation of the tumor with the minimum possible damage to healthly tissues of the irradiated region, especially the organs at risk. The optimal planning for radiation therapy can be aided by Linear Programming and there is a wide literature addressing this subject. However, most published mathematical formulations do not contemplate a scenario in terms of practical applications. They do not incorporate certain factors that are extremely important for building a real planning, as examples there are attenuation of the radiation beam and the heterogeneous composition of the irradiated tissue. This work presents a methodology for correction of heterogeneity in the composition of different types of tissuers irradiated based on the proportions among their different linear attenuation coefficient. This methodology aims to make the simulations of optimized planning closer to the real planning and thus enable a more comprehensive and reliable, allowing the use of linear programming models as aids in the creation of real planning for radiotherapy / Mestre

Caulobacter crescentus é uma bactéria gram-negativa que dá origem a duas células filhas a cada divisão celular, a célula móvel e a célula talo, que se distinguem por sua morfologia, programa de desenvolvimento e capacidade de replicação do DNA. O gene alkB de C. crescentus foi identificado num clone que contém os genes de choque térmico dnaK e dnaJ (Gomes et al, 1990). Em E. coli, o gene alkB mostrou estar envolvido, juntamente com os genes alkA e ada, no reparo de lesões do DNA causadas por agentes alquilantes (Teo et al, 1986). O gene alkB de E coli forma um operon com o gene ada, sendo que o gene ada precede o gene alkB. A expressão de ambos os genes é induzida por doses não letais de agentes alquilantes, a nível de transcrição. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de nucleotídeos do gene alkB de Caulobacter crescentus mostrou uma identidade de 42,5 % com a proteína AlkB de E. coli (Kondo et al, 1986). Ao contrário do que ocorre em E.coli, este gene não faz parte de um operon com o gene ada e sua expressão não é induzida por agentes alquilantes. Através do ensaio de proteção à nuclease S1 foi demonstrada a existência de um único início de transcrição para este gene. Para medir o nível de expressão do gene alkB foi construída a fusão de transcrição alkB-placZ/290, onde o vetor repórter de transcricão (placZ/290) (Gober & Shapiro, 1992) contendo o gene da (β-galactosidase sem o seu promotor foi ligado ao fragmento Sall/Stul (0,3 kb) que contém apenas a região promotora do gene alkB. Observou-se que a transcrição do gene alkB é regulada durante o ciclo celular de Caulobacter crescentus, apresentando níveis máximos na célula talo. Verificou-se ainda, através do experimento de dupla sincronia, que a proteína AlkB de C. crescentus sintetizada na célula prédivisional é segregada tanto para a célula móvel como para a célula talo, não apresentando um padrão polar de expressão. A resposta adaptativa a agentes alquilantes foi demonstrada em C. crescentus pela detecção de um aumento na sobrevivência aos efeitos letais dos agentes alquilantes em células pré-tratadas com baixas doses destes agentes e pela identificação de uma proteína induzida por agentes alquilantes utilizando anticorpos monoclonais anti-Ada de E. coli. / Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium that yields two different progeny cells at each division cycle, the swarmer cell and the stalked cell, which differ in structure, developmental program and ability to replicate DNA. The alkB gene in Caulobacter crescentus was identified in a clone which contains also the heat shock genes dnaK and dnaJ (Gomes et al, 1990). In Escherichia coli the alkB gene has been shown to be involved, with alkA and ada, in the pathway for repair of DNA alkylation damage (Teo et al, 1986). The E. coli alkB gene forms an operon with the ada gene, being downstream of it. The addition of the alkylating agent MMS to E. coli cultures induces the expression of both ada and alkB, at the level of transcription. The aminoacid sequence deduced from the nucleotide sequence of the C. crescentus alkB gene has shown 42,5% identity with the AlkB protein of E. coli (Kondo et al, 1986). Contrary to what happens in E. coli, the alkB gene of Caulobacter cescentus does not form an operon with the ada gene and its expression is not induced by alkylating agents. S1 nuclease protection assays have shown the presence of a single start of transcription for the alkB gene. To investigate the expression of the alkB gene during the cell cycle of the bacterium, its regulatory region was fused to a promoterless lacZ gene present in the vector placZJ290 (Gober & Shapiro, 1992), and β-galactosidase activity and synthesis, directed by the alkB gene promoter, were determined. It was observed that expression of the alkB gene is cell cycle controlled in Caulobacter. The placZJ290 transcriptional fusion with alkB, expressed in predivisional cells did not display a polar pattern of segregation in Caulobacter crescentus. β-galactosidase synthesized in predivisional cell was partitioned in equal amounts to both cell types after cell division. An adaptive response to alkylation damage has been demonstrated in C. crescentus. The response was detected by the increased resistance to cell killing of pretreated cells with low doses of methylating agents, followed by exposure to higher doses of these agents, and by cross-reactivity of an inducible protein of 39 kDa with E. coli anti-Ada monoclonal antibodies.

Estudou-se quantitativamente e qualitativamente a citologia, os teores de imunoglobulinas, e a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino contra a Escherichia coli enterotoxigênica (ECET), analisando-se a influência da opsonização prévia destas células. Para tal finalidade foram utilizadas 53 vacas da raça Holandesa, das quais realizou-se a colheita de um total 212 amostras de colostro obtidas antes da primeira e segunda ordenha. As amostras positivas (n=41) ao exame bacteriológico do leite foram excluídas desta pesquisa. Para a análise citológica quantitativa e qualitativa do colostro, foram utilizadas as técnicas de microscopia direta e citocentrifugação, respectivamente. As dosagens das imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) foram realizadas por meio da técnica de imunodifusão radial, utilizando-se Kits comerciais. Para a avaliação da atividade bactericida indireta dos fagócitos e verificação da influência da opsonização prévia da ECET, foram realizados os seguintes ensaios: utilizando somente suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares em meio de cultura (Grupo Controle - C); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET não opsonizada (Grupo NO); suspensão de fagócitos mononucleares e polimorfonucleares adicionados a suspensão de ECET previamente opsonizada com 10% de sobrenadante de colostro bovino delipidado (Grupo O). A atividade bactericida indireta dos fagócitos foi mensurada por meio da quantidade de nmoles de peróxido de hidrogênio liberado por estas células, nos ensaios C, NO e O. Após as avaliações dos resultados das determinações realizadas, conclui-se que: (1) o colostro bovino de segunda ordenha apresenta maior quantidade de células/mL, que aquele de primeira ordenha; (2) a predominância celular demonstrada com o uso das técnicas de microscopia direta e de citocentrifugação foi de células mononucleares; (3) colostro bovino de segunda ordenha possui maior quantidade de neutrófilos polimorfonucleares, quando comparada àquela da primeira ordenha, utilizando as técnicas de microscópica direta e de citocentrifugação, para a contagem dos tipos leucocitários; (4) os tipos celulares predominantes no colostro bovino de primeira e segunda ordenha foram macrófagos/células epiteliais, seguidos por linfócitos, neutrófilos e eosinófilos, respectivamente, utilizando a técnica de citocentrifugação para diferenciação celular; (5) o colostro bovino de primeira ordenha possui maiores teores de imunoglobulinas das classes G e M, que o da segunda ordenha, havendo predomínio da IgG, sobre a IgM e IgA independente da ordem de ordenha. (6) os fagócitos do colostro bovino de primeira ordenha apresentaram maior atividade celular avaliada pela liberação de peróxido de hidrogênio, que os da segunda ordenha; (7) a estimulação antigênica com ECET não foi suficiente para aumentar a atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino; (8) a opsonização da ECET com soro colostral não determinou diferenças significativas na atividade bactericida dos fagócitos do colostro bovino, mensurada pela quantidade de peróxido de hidrogênio liberado por estas células; (9) existe correlação positiva entre os teores de imunoglobulinas da classe M e a quantidade de peróxido de hidrogênio liberado pelos fagócitos do colostro bovino; (10) o comportamento quantitativo observado para as imunoglobulinas e células do colostro bovino, considerando a ordem das ordenhas, sugere que os anticorpos teriam função prioritária na imunidade do neonato, enquanto o aumento de neutrófilos estaria voltado aparentemente para a proteção da glândula mamária. / Bovine collostrum citology, immunoglobulin content and bactericidal activity of phagocytes against enterotoxigenic Escherichia coli were studied qualitatively and quantitatively, analyzing the influence of previous opsonization of the bacterium. In order to achieve this aim, 53 Holstein cows were used to obtain 212 collostrum samples before the first and second milkings. Samples positive (n=41) in the bacteriological examination of milk were excluded from the trial. Direct microscopy and cytocentrifugation were used in the quantitative and qualitative cytological analysis of collostrum, respectively. Immunoglobulin (IgG, IgM and IgA) contents were determined by means of radial immunodiffusion using commercial kits. Indirect bactericidal activity of phagocytes and assessment of the influence of ETEC previous opsonization were carried out as follows: using only a suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes in culture medium (Control group - C); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to a suspension of non-opsonized ETEC (NO group); suspension of mononuclear and polymorphonuclear phagocytes added to an ETEC suspension previously opsonized with 10% of supernatant of delipidated bovine collostrum (O group). Indirect bactericidal activity of phagocytes was measured by means of the amount of hydrogen peroxide nmoles released by these cells in assays C, NO and O. After results were evaluated, it was concluded that: (1) bovine collostrum obtained in the second milking showed more cells/mL than first milking collostrum; (2) the predominance of mononuclear cells was determined by both direct microscopy and cytocentrifugation; (3) bovine collostrum obtained in the second milking showed greater quantity of polymorphonuclear neutrophils than that of the first milking, as determined in cell type counts by direct microscopy and cytocentrifugation; (4) cell types predominating in bovine collostrum of the first and second milking were macrophages / epithelial cells, followed by lymphocytes, neutrophils and eosinophils, respectively, using cytocentrifugation for cell differentiation; (5) first milking bovine collostrum showed greater levels of immunoglobulins G and M than that of the second milking, with a predominance of IgG compared with IgM and IgA, no matter the milking order; (6) phagocytes in first milking collostrum showed greater cell activity than those in the second milking collostrum, as evaluated by hydrogen peroxide release; (7) antigenic stimulation of ETEC was not enough to increase bactericidal activity of phagocytes in bovine collostrum; (8) ETEC opsonization with collostral serum did not lead to significant differences in bactericidal activity of bovine collostrum phagocytes, as measured by the amount of hydrogen peroxide released by these cells; (9) there was a positive correlation between the contents of immunoglobulin M and the amount of hydrogen peroxide released by phagocytes in bovine collostrum; (10) quantitative behavior observed for immunoglobulins and cells of bovine collostrum considering the milking order, suggest that antibodies would have a essential function in neonate immunity, whereas the increase in neutrophils would apparently be linked to mammary gland protection.

Orientadores : Luiz Carlos Zeferino, Adhemar Longatto Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-10-31T16:58:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guedes_AnaClaudia_M.pdf: 514325 bytes, checksum: 291835bed8beca40051446dd83381195 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho da técnica convencional de colheita e confecção do esfregaço cervicovaginal , utilizando espátula de Ayre e escova, com a técnica que utiliza material coletado com escova (Cervex Brush®) e preservado em meio líquido à base de álcool para a confecção do esfregaço. Este foi um estudo prospectivo, comparativo, descritivo e randomizado, constituído de 301 mulheres encaminhadas para os Ambulatórios de Patologia Cervical do Hospital Maternidade Leonor Mendes de Barros e do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher, no período de junho a dezembro de 2001, alocadas de forma randomizada em dois grupos. Os critérios de inclusão foram mulheres com exame citológico prévio alterado, teste positivo para HIV, pesquisa biomolecular ou sorológica positiva para HPV e qualquer condição clínica suspeita para neoplasia do colo uterino. Foram excluídas as mulheres com diagnóstico de carcinoma invasor e submetidas a histerectomias. O padrão-ouro foi considerado o diagnóstico histológico mais grave, com espécimes coletados por biópsia, cirurgia de alta freqüência e/ou conização a bisturi frio. As variáveis em estudo foram: diagnóstico citológico; qualidade do esfregaço; exame colposcópico; diagnóstico histológico e diagnóstico microbiológico. A associação dos diagnósticos neoplásicos e da qualidade da amostra com as técnicas convencionais e em meio líquido foi analisada com o teste exato de Fisher e medida por valores estimados de odds ratio, com seus respectivos intervalos de confiança de 95%. Os resultados mostraram que as duas técnicas são semelhantes na detecção de lesões pré-neoplásicas do colo uterino, na qualidade do esfregaço, na concordância citoistológica. Observou-se diferença no motivo da limitação dos esfregaços, sendo mais freqüente na técnica convencional o esfregaço hemorrágico/purulento e na técnica em meio líquido, a ausência de células endocervicais. Houve diferença também no diagnóstico microbiológico, sendo que a técnica convencional fez mais diagnóstico de cocos e lactobacilos e a técnica em meio líquido de Gardnerella / Abstract: The purpose of the study was to compare liqüid-based cytology to the conventional Papanicolaou smears, in a high-risk population for cervical intraephitelial neoplasia. This study was prospective, comparative, descritive, randomized. A total of 301 women were included, during the period from june to december 2001. Were included women with abnormal conventional smears, HIV positive, HPV DNA positive or any suspicious clinical condition for cervical cancer. Cytologic diagnosis based on the two techniques, categorized according to the Bethesda System, were compared to a "gold standard" final case diagnosis, the histologic diagnosis. Cytologic diagnosis, specimen adequacy, colposcopy, histologic diagnosis and microbiologic diagnosis were evaluated and compared. For the statistical analysis, differences in the rates of disease detection and in specimen adequacy between the two preparation methods were assessed statistically using Fisher¿s exact test. The comparison of the results between conventional smears and liqüid-based revealed no significant statistically differences in all diagnostic categories. The diagnosis of satisfactory specimen for evaluation but limited by cylindrical endocervical cells or squamous metaplasia absent was higher in liqüid-based and the specimen limited by obscuring blood and obscuring inflammation was higher in conventional smears / Mestrado / Tocoginecologia / Mestre em Tocoginecologia