Desde el punto de vista metodológico esta tesis aporta, primero una mejora en la técnica de fusión heteróloga de ovocitos de hámster con esperma humano mediante el uso de ionóforo lo que mejora el proceso de capacitación espermática. En segundo lugar el uso de vinblastina, como agente antimitótico, es un hecho relevante que mejora sustancialmente la calidad de la extensión cromosómica y en consecuencia incrementa el número de complementos cromosómicos de mejor morfología para ser estudiados. Una tercera mejora importante ha consistido en un método original para el pintado de cromosomas enteros. Permite distinguir los complementos cromosómicos de ovocito de hámster de los complementos de pronúcleo masculino humano. Además, usando sondas de ADN marcadas con fluorescencia, específicas para los cromosomas preseleccionados, se han estudiado cromosomas humanos específicos. Esta aproximación metodológica mejorada hace posible estudiar con éxito la segregación meiótica en portadores de reorganizaciones cromosómicas equilibradas. Uno de ellos es la reorganización cromosómica compleja, 46, XY, -2, + der (2) t (2; 11) (q13; q23), - 11, + der (11) t (11; 22) (q23; q11.2), - 22, + der (22) t (2; 22) (q13; q11.2). Se analizaron un total de 208 complementos de esperma. La frecuencia de esperma que lleva una complemento normal o un complemento equilibrado era sustancialmente más baja que la frecuencia de espermatozoides desequilibrada siendo de 13,5% vs 86,5%, respectivamente, incluyendo 30 modos diferentes de segregación de ambos 4: 2 y 5: 1. Los resultados obtenidos en este estudio son compatibles con la formación, durante el proceso sináptico, de una figura hexavalente compleja que implica los cromosomas 2, 11 y 22. El comportamiento y la segregación de esta figura compleja explicarían la alta frecuencia (86,5%) de complementos desequilibrados observado en este portador. También se ha estudiado la segregación cromosómica de varios portadores de reorganizaciones cromosómicas. Tres portadores de translocacion recíproca (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) y un portador de inversión pericéntrica 47, XY, inv (7) (p13q36). En los portadores de translocaciones equilibradas se observaron todas los modos de segregación (alternante, adyacente-1, adyacente-2 y 3:1). No se ha observado relación entre la no disyunción de los cromosomas homólogos y las características particulares de la figura de emparejamiento, con la incidencia de eventos de recombinación meiótica en las regiones intersticiales de la estructura tetravalente. Además, en el caso del portador de la translocación recíproca 46XY, t (5; 7) (q21;q32) hay evidencia de un efecto intercromosómico, incremento de la frecuencia de aneuploidía en cromosomas no implicados en la translocación, con respecto a las muestras control. En cuanto a los portadores de inversiones pericéntricas analizados, el estudio de segregación cromosómica, proporciona una clara evidencia de una relación entre la incidencia de los productos de recombinación meiótica y la proporción entre el tamaño del segmento invertido respecto del tamaño total del cromosoma (tamaño en Mpb), más que con la longitud del fragmento invertido. Finalmente, cabe destacar la aplicabilidad de los resultados para desarrollar el conocimiento necesario para proporcionar un consejo genético apropiado a los portadores de reorganización cromosómicas equilibradas. / From the methodological point of view this thesis it provides, first the improvement of the heterologous fusion technique of hamster oocyte with human sperm by using ionophore improving the sperm capacitation process. Secondly using vinblastine, as antimitotic agent, improves the chromosomal morphology quality substantially, and consequently the number of complements good enough that can be studied increases. A third important improvement is an original method for painting whole chromosomes using FISH. It allows to distinguish both chromosomal complements, hamster oocyte chromosomes and human pronuclear male chromosomes. Moreover, using DNA probes labelled with fluorescence, specific to the preselected chromosomes, selected human chromosomes have been studied. This improved methodological approach enables study successfully meiotic segregation in carriers of balanced chromosomal rearrangements. One of them is the carrier of a complex chromosome rearrangement, 46,XY,-2, +der(2)t(2;11)(q13; q23),-11,+der(11)t(11;22)(q23;q11.2),-22, +der(22)t(2;22)(q13; q11.2). A total of 208 sperm complements were analyzed. The frequency of sperm carrying a normal or a balanced complement was substantially less frequent than the frequency of unbalanced sperm (13.5% vs 86.5% respectively) including 30 different segregation modes of both 4:2 and 5:1. The results obtained in this study are compatible with the formation, during the synaptic process, of a complex hexavalent figure involving chromosomes 2, 11, and 22. The behaviour and segregation of this complex figure would explain the high frequency (86.5%) of unbalanced complements observed in this carrier. Moreover sperm chromosome segregation studies in several carriers of balanced chromosome rearrangement are also performed: the following three reciprocal translocations (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) and the pericentric inversion 47, XY, inv (7) (p13q36). In the balanced translocation carriers the frequencies of alternate, adjacent-1, adjacent-2 and 3:1 segregation were detected. No relationship between the non-disjunction of homologous chromosomes and particular characteristics of the pairing figure such as the incidence of meiotic recombination events in the interstitial regions of tetravalent structure has been observed. Moreover, in the case of the carrier of t(9;17)(q12;p12) reciprocal translocation, evidence of an interchromosomal effect were observed, increased aneuploidy frequencies for chromosomes not involved in the translocation, in respect of control samples. Taking into account, the pericentric inversions carriers analysed, the chromosome segregation study provides a clear evidence of a relationship between the incidence of meiotic recombination products and the percentage of the inverted chromosome segment more tan with the length (size in Mpb) of the inverted chromosome segment. Finally, is worth noting the applicability of the results to develop the necessary knowledge, for proper genetic counselling to male carriers of balanced chromosomal rearrangements.

- Introducció Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by early synaptic and late neuronal loss, affecting more than 26 million people worldwide. Among patients affected with dementia, more than half suffer from Alzheimer’s disease. The biggest risk factor for developing Alzheimer's disease is age. β-amyloid (Aβ) plaques and neurofibrillary p-Tau tangles accumulates in the brains of elderly patients playing a central role in the pathogenesis of AD. During the last years the fruit fly, Drosophila melanogaster has increasingly been used as a model for neurodegenerative disease. Although the adult fly has a simpler nervous system than those of vertebrates, it is capable of higher-order brain functions, including aversive and appetitive learning, and recalling learned information from prior experiences. - Contingut de la investigació This work has been focused on modeling Alzheimer's Disease in Drosophila by expressing two human genes associated with AD (Aβ42 and Tau) in the fly central nervous system. This model displays AD-like neuropathological as well as behavioral symptoms. The main goal of developing such a model is to analyse and study the effect of new synthetic fatty acids molecules in the pathogenesis of AD. Additionally, the model organisms established in this study could provide tools that help to understand disease-specific processes resulting in neuronal loss. This study argues that Drosophila can be used to study the behavioural basis of human neurodegenerative diseases and may provide a model to identify novel therapeutic avenues for neurodegenerative diseases as Alzheimer’s disease. In this work also was studied the effect of membrane lipid therapy on cognitive decline of a transgenic model of Drosophila. This model overexpresses the human amyloid peptide of 42 amino acids (Aβ42), and human Tau protein that play a key role in the development of this disease. - Conclusió The treatment has been based on the use of DHA and its hydroxylated derivate OHDHA, ARA and its hydroxylated form OHARA and EPA and its hydroxylated form OHEPA at 1, 3, 10, 30, 100 and 250 μg/ml of standard food. After testing the transgenes expression in the F1 generation by PCR analysis and Western blot it was evaluated the toxicity of the compounds, and it was demonstrated that food supplementation with OHDHA, OHARA, OHEPA partially restored the loss of locomotor activity and increased the life-span of the flies expressing the human transgenes whereas the DHA, ARA, EPA, form had not significant effects. It has been observed that the concentrations of 30 and 100 μg/ml of hydroxylated form, including the mixtures of (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA), and 30 μg/ml of TGMs, LP183A1, LP183A2, was used, have led to cognitive improvement and have maintained or increased the lifespan with respect to the control group. In addition it was analyzed the lipid content from Drosophila heads by using gas chromatography and it was found that the food supplementation with either hydroxylated or non-hydroxylated compounds induced changes in the fatty acid profile of Drosophila. Furthermore it was discovered that the amount of short chain fatty acids (SCFA), from the heads of F1 treated with ARA, EPA and DHA was less than that from untreated F1 flies. Concerning the hydroxylated fatty acids, the reduction in the levels of short chain fatty acid (SCFA) was similar to that of the non-hydroxylated fatty acids. All food supplement tested induced an increase of long chain fatty acids (≥ 18C). ARA, EPA and DHA were present in the fatty acid profile of flies treated with the respective non-hydroxylated food supplements. This fact proves the absorption and incorporation of dietary PUFAs into the Drosophila body tissues. / - Introducció La enfermedad de Alzheimer (AD, del inglés Alzheimer's disease) es una patología neurodegenerativa caracterizada por una pérdida temprana de conexiones sinápticas y, de manera tardía, de neuronas. Esta enfermedad afecta a unos 40 millones de personas en todo el mundo. Entre las personas con demencia, más de la mitad sufren AD. El mayor riesgo para desarrollar la enfermedad de Alzheimer es la edad. De hecho, las placas β-amiloide (Aβ) y ovillos neurofibrilares de fosfo-Tau se acumulan en los cerebros de pacientes ancianos, jugando un papel central en la patogénesis de AD. Además, se han encontrado reducciones significativas en los niveles de los lípidos fosfatidiletanolamina y ácido docosahexaenoico (DHA) en el cerebro de pacientes con AD. Durante la última década, la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) se ha utilizado como modelo para enfermedades neurodegenerativas, debido a que puede ser utilizada para el análisis de conductas como el aprendizaje aversivo y apetitivo, así como su capacidad de utilizar la información aprendida de previas experiencias, aunque la mosca adulta presenta un sistema nervioso mucho más simple que el de vertebrados. - Contingut de la investigació La presente investigación se centra en la utilización de Drosophila como modelo de AD mediante la sobreexpresión de los genes humanos asociados con AD (Aβ42 y Tau) en el sistema nervioso central de la mosca. El principal objetivo de desarrollar este modelo es analizar y estudiar el efecto de ácidos grasos sintéticos novedosos en la terapia de la AD. Conjuntamente, los organismos modelo establecidos en este trabajo pueden constituir un sistema que permita la comprensión de los procesos específicos de la enfermedad que desencadena la pérdida neuronal. Con todo ello, el presente trabajo demuestra que se puede usar Drosophila para estudiar las bases comportamentales de las enfermedades humanas neurodegenerativas y puede suponer un modelo para identificar nuevas terapias para dichas enfermedades, tales como AD. Además, se ha estudiado el efecto de la terapia lipídica de membrana en el declive cognitivo del modelo transgénico de AD de Drosophila. - Conclusió Los tratamientos empleados se basan en el uso de DHA y su derivado hidroxilado OHDHA, ARA y su forma hidroxilada OHARA y EPA y su forma hidroxilada OHEPA, así como derivados de triacilgliceroles (triacilglicerol miméticos, TGM) a dosis crecientes y añadidos en la comida. Tras confirmar la expresión de los transgenes en la generación F1 de las moscas por PCR y western blot, se analizó la toxicidad de los distintos compuestos y se demostró que la suplementación de comida con OHDHA, OHARA, OHEPA restauró la pérdida de actividad locomotora, parcialmente, además, aumentó la vida media de las moscas expresando los transgenes humanos, mientras que DHA, ARA, EPA no presentaron efectos significativos. Se observó que las concentraciones de 30 y 100 μg/ml de las formas hidroxiladas, incluyendo las mezclas de (OHDHA+OHARA), (OHEPA+OHARA) y 30 μg/ml de TGMs, LP183A1, LP183A2, mejoraron la capacidad cognitiva y aumentaron la vida media con respecto al grupo control no tratado. También se analizó el contenido lipídico en membranas de la cabeza de moscas mediante cromatografía de gases y se observó que la suplementación de la comida, tanto con los compuestos hidroxilados como los no-hidroxilados estudiados, indujo cambios en el perfil de ácidos grasos de Drosophila melanogaster. Entre ellos, se observó una menor cantidad de ácidos grasos de cadena corta en cabezas de moscas F1 tratadas con ARA, EPA and DHA en comparación con moscas no tratadas. En cuanto a los ácidos grasos hidroxilados, presentaron un nivel similar en la reducción de los niveles de ácidos grasos de cadena corta. Además, todos los suplementos añadidos a la comida indujeron un aumento de los ácidos grasos de cadena larga (≥ 18C). Finalmente, se observó la presencia de ARA, EPA y DHA en el perfil de ácidos grasos de las moscas tratadas con el correspondiente ácido graso no-hidroxilado. Este hecho prueba la absorción e incorporación de los ácidos grasos poliinsaturados presentes en la dieta en los tejidos de la Drosophila.

La selecció embrionària i la capacitat de predir el potencial d’implantació dels embrions humans és un factor determinant per l’èxit de les tècniques de fecundació in vitro (FIV), que permet reduir el número d’embrions a transferir minimitzant el risc d’embaràs múltiple. La pràctica més habitual per valorar la qualitat embrionària i dur a terme la selecció es basa en criteris morfològics i observacions en dia 1 (fecundació i divisió primerenca), dia 2 i 3 (divisió i fragmentació dels blastòmers) i en dia 5, o combinacions d’aquestes. Allargar el cultiu fins a blastocist, així com la determinació de la seva dotació cromosòmica, sembla una bona opció per seleccionar els embrions de millor qualitat, però malauradament no totes les pacients són bones candidates d’aquesta estratègia. El patró pronuclear s’ha associat amb el desenvolupament embrionari. En alguns països només poden criopreservar embrions fins a aquest estadi i per això n’és important la classificació. El nostre objectiu ha estat correlacionar la morfologia embrionària del zigot a l’estadi de 2 PN amb la utilització de les classificacions de pronuclis de Tesarik i Greco, 1999 (p0-5) i Scott et al., 2000 (z1-4), i la primera divisió embrionària a les 26h (EC), amb la morfologia de l’embrió en estadis posteriors de desenvolupament i la seva dotació cromosòmica. Primerament hem correlacionat els patrons de pronuclis (PN) amb la morfologia del zigot i de l’embrió. A l’utilitzar les classificacions de PN, hem observat una associació entre la sincronia en la polarització dels precursors nucleolars (NPB) i la bona qualitat embrionària. El patró p4 associat a un baix número de NPB s’ha correlacionat amb embrions multinucleats i embrions de baixa qualitat. No hi ha diferències en la taxa d’embaràs quan s’ha transferit al menys un embrió provinent d’un bon patró de PN o no. Per tal d’analitzar la relació entre la morfologia del zigot en 2PN segons les dues classificacions de PN i la dotació cromosòmica de l’embrió, s’han analitzat els embrions de 73 cicles de diagnòstic genètic preimplantacional (PGD) i cribatge d’aneuploïdies (PGS). No hi ha relació entre els patrons de PN i la dotació cromosòmica. No hem trobat correlació entre els PN i la morfologia embrionària. No hi ha relació entre euploïdia i qualitat embrionària, però sí quan distingim entre euploïdia, aneuploïdia i poliploïdia. El segon objectiu ha estat analitzar la correlació entre la divisió primerenca dels zigots i la qualitat embrionària i la dotació cromosòmica. S’han analitzat 595 embrions de 96 cicles de PGD/PGS. Hi ha diferències estadísticament significatives en la taxa d’embaràs per transferència quan s’ha transferit al menys un embrió EC o no. També hi ha diferències entre embrions EC, No PN o 2PN encara visibles a les 26h i la qualitat embrionària en dia 2 i la taxa de blastocist en PGS; no és així en PGD. En PGS i en PGD, els embrions EC tenen menys anomalies cromosòmiques que els embrions No PN i 2PN. Finalment, veiem que la valoració seqüencial de la morfologia oocitària, classificació de PN i morfologia embrionària permet seleccionar millor els embrions a transferir. Malgrat tot, en un programa de PGD/PGS la classificació de PN no pot predir ni la qualitat ni la dotació cromosòmica embrionària. Pel que fa la divisió primerenca, s’ha vist que està correlacionat amb la qualitat embrionària, el desenvolupament fins a blastocist i la dotació cromosòmica de l’embrió. / Several strategies have been proposed for the selection of embryos for uterine transfer in human assisted reproduction. The possibility of choosing adequate embryos with high implantation potential will allow the reduction in the number of embryos transferred. This will lead to a decrease in the percentage of multiple pregnancies and its complications. The scoring criteria of embryo selection are based on serial morphological observations conducted on day 1 (during the assessment of fertilization and early cleavage), on days 2 and 3 (based on cleavage and blastomere fragmentation), on day 5, or on combinations of these criteria. Extending the culture of embryos to the blastocyst stage may also be a good option to select high quality embryos, as well as the determination of the chromosome constitution of the embryo. Unfortunately, not all cases are good candidates and benefit from extended culture. Pronuclear morphology assessment has been extensively described as a method to score zygotes. Also, some countries are only allowed to freeze zygotes and the selection of embryos at this stage is thus necessary. The objective was to evaluate the usefulness of pronuclear patterns as described by Tesarik and Greco, 1999 (patterns p 0-5) and Scott et al., 2000 (Z1-4) as well as the occurrence of early cleavage at 26h as predictors of embryo morphology, implantation potential and chromosome constitution. The first purpose was to relate pronuclear patterns (PN) and zygote cytoplasmic appearance and embryo morphology. On this sense, the usefulness of PN classifications for embryo selection was assessed. We observed that synchrony on polarization and number of nucleolar precursor bodies (NPB) were associated with good quality embryos. Pattern 4 zygotes were associated with small number of NPB developed into multinucleated embryos and poor quality embryos. No significant differences were found in the pregnancy rate between transfer of at least one good prognosis PN pattern and transfer of poor prognosis PN patterns. In order to evaluate the usefulness of pronuclear patterns as predictors of embryo chromosome constitution, up to 73 preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening (PGD/PGS) cycles were analysed. The results show that the PN pattern using Tesarik’s and Scott’s classification systems is not related to the embryo developmental potential or its chromosome constitution. As regard to the relationship between PN pattern and embryo quality, the data obtained in the second study showed no correlation between both parameters. Although there were no significant differences when comparing the distribution of chromosomally normal and abnormal embryos with respect to embryo quality, such differences were observed when distinguishing between normal, aneuploid and polyploid embryos. The second objective was to analyse the correlation between early cleavage and embryo quality and chromosome constitution including 595 embryos from 96 PGS/PGD cycles. When clinical pregnancy rates per transfer were compared, statistically significant differences were observed between patients that had at least one early cleavage embryo and patients no EC. Statistically significant differences were found between EC, No PN and 2PN embryos at 26 h, good embryo quality at day 2 and in blastocyst rate in PGS cycles. These differences were not found in the PGD group. Early cleaved embryos exhibited less chromosome abnormalities than No PN and 2PN group in PGS and in PGD group. In conclusion, sequential assessment involving the evaluation of oocyte quality, the classification of PN patterns and embryo morphology allows a more accurate evaluation of embryos to be selected for transfer. Therefore, in the context of a PGD/PGS programme, the PN pattern cannot be used as a tool to predict embryo quality or chromosome status. Early cleavage has shown to correlate with embryo quality, with the capacity to develop up to blastocyst stage, as well as with euploid chromosome constitution.

En el nostre grup s’ha demostrat la interacció directa entre l’inhibidor de ciclines-CDKs p27 i l’acetiltransferasa PCAF. Aquesta interacció es produeix entre el domini HAT de PCAF i la regió que compren els aminoàcids 91-120 de p27. Aquesta regió conté un PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa), un domini característic d’interacció entre proteïnes. En aquest treball hem comprobat que PCAF acetila la lisina en posició 100 de p27 in vivo. L’acetilació de p27 afecta la seva estabilitat, afavorint-ne la seva trasnlocació del nucli al citoplasma, al inici de la fase G1, on serà degradada (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF és un co-activador transcripcional que actúa acetilant histones, factors de trasncripció i altres proteïnes. Per altra banda, recentment s’ha descrit que p27 actúa com a regulador transcripcional, bàsicament com a repressor transcripcional de la transcripció de determinats gens diana. Així doncs, com PCAF acetila p27, en aquest treball ens hem centrat en confirmar la col·laboració de p27 i PCAF en la regulació transcripcional dels seus gens diana. Per aconseguir aquest objectiu hem identificat els programes transcripcionals regulats per p27 i PCAF en cèl·lules humanes de càncer de còlon (HCT116), mitjançant experiments de ChIP-seq. Determinem que p27 i PCAF s’uneixen a regions diferents de la cromatina en els seus gens diana. Un cop identificats els gens diana comuns de p27 i PCAF, s’ha analitzat l’expressió de 14 d’aquests gens i hem pogut concloure que p27 i PCAF en regulen la seva transcripció de forma antagònica. p27 reprimeix i PCAF activa l’expressió de la majoria dels gens diana analitzats. Aquest efecte és degut a la unió de p27 i PCAF a elements reguladors de la transcripció en la cromatina. Hem descrit que p27 s’uneix a elements amb efecte activador de la transcripció en la cromatina dels seus gens diana, inhibint-los. Per contra, PCAF s’uneix a elements amb efecte silenciador sobre la transcripció del seus gens diana. Finalment hem demostrat la interacció de p27 i PCAF amb els factors de transcripció PAX en cèl·lules HCT116. / Our group has demonstrated the direct interaction between the cyclin-CDK inhibitor p27 and the acetyltransferase PCAF. This interaction occurs between the HAT domain of PCAF and the region comprising aa 91-120 of p27. This region of p27 contains a PRD (Proline Rich Domain, 91-96aa) a characteristic protein interacting domain. In this study we found that PCAF acetylates the lysine at position 100 of p27 in vivo. The acetylation of p27 affects its stability, promoting its translocation from the nucleus to the cytoplasm early in the G1 phase, where it will be degraded (Pérez-Luna et al., 2012). PCAF acts as a transcriptional coactivator by acetylating histones, transcription factors and other proteins. On the other hand, it has been reported that p27 acts as a transcriptional regulator, basically by repressing transcription of certain target genes. Therefore, since PCAF acetylates p27, in this thesis we focus on confirming the collaboration of p27 and PCAF in the transcriptional regulation of their target genes. To pursue this goal we have identified the transcriptional programs regulated by p27 and PCAF in HCT116 cells by ChIP -seq experiments. We found that p27 and PCAF binds to different regions of the chromatin of their target genes. Once the common target genes of p27 and PCAF were identified, their expression was analyzed. We concluded that p27 and PCAF regulate the transcription of their target genes antagonistically. p27 represses and PCAF activates the expression of most of their target genes, due to its binding to transcription regulatory elements in the chromatin. p27 binds to transcription activating elements, thus inhibiting the transcription of the target gene. On the contrary, PCAF binds to transcription silencing elements, thus activating the transcription of the target gene. Finally we demonstrated the interaction of p27 and PCAF with transcription factors PAX in HCT116 cells.

La presència de dos o més nuclis en una cèl·lula embrionària es defineix com a multinucleació i va ser descrita per primera vegada en embrions humans cultivats in vitro per Tesarik i col.laboradors al 1987 (Tesarik et al., 1987). Es considera que un embrió és multinucleat quan s’ha observat més d’un nucli en alguna de les seves cèl·lules en qualsevol moment del seu desenvolupament. Aquesta característica embrionària es considera patològica i s’associa a mal pronòstic reproductiu. La multinucleació pot generar-se per errors en el procés de divisió mitòtica o per fragmentació del nucli i pot donar lloc patrons de multinucleació diferents: binucleació (2 nuclis) o multi/micronucleació (>2 nuclis). Diversos autors han descrit una associació entre multinucleació i morfologia embrionària compromesa que es tradueix en una menor capacitat de desenvolupament d’aquests embrions quan es cultiven fins a l’estadi de blastocist (Alikani et al., 2000; Yakin et al., 2005). A més, aquests embrions exhibeixen una constitució cromosòmica anormal amb més freqüència. Per tot això, i malgrat s’han descrit naixements sans a partir de la transferència d’embrions multinucleats, la transferència d’aquests embrions en els cicles de Fecundació in vitro sol realitzar-se només quan no n’hi ha d’altres disponibles. En el nostre treball s’han analitzat les característiques de 763 cicles de FIV-ICSI amb i sense embrions multinucleats a la cohort. S’han comparat les característiques dels cicles i de les pacients dels dos grups. En segon lloc, s’han analitzat les característiques de 1312 embrions multinucleats. S’ha determinat la seva incidència, el moment d’aparició de la multinucleació i els patrons de multinucleació. S’ha analitzat els paràmetres morfocinètics dels embrions multinucleats comparant-los amb els d’embrions sense signes de multinucleació i s’ha avaluat la capacitat de desenvolupament fins a blastocist dels embrions multinucleats. S’han analitzat els resultats clínics dels embrions multinucleats que han estat transferits. A partir de les dades obtingudes de 199 cicles de Screening genètic preimplantacional s’ha determinat la constitució cromosòmica dels embrions multinucleats i s’ha comparat amb l’observada en embrions sense multinucleació Els nostres resultats han mostrat que, tot i les millores recents del cultiu in vitro, la multinucleació embrionària segueix essent un fenomen freqüent en els cicles de FIV. (23.6%). En els cicles de FIV, el nombre d’oòcits recuperats en la punció fol·licular s'associa a presència de multinucleació, però la presència d’embrions multinucleats en una cohort no té un efecte negatiu en el pronòstic del cicle. La tecnologia de monitorització dinàmica de la morfologia embrionària incorporada als laboratoris de reproducció assistida darrerament possibilita una millor detecció de la multinucleació i ha mostrat que embrions amb aquestes característiques mostren una morfocinètica alterada. Amb aquest treball, s’ha confirmat una menor capacitat per assolir l’estadi de blastocist i una major incidència d’anomalies cromosòmiques dels embrions multinucleats, tot i que els embrions multinucleats euploides que assoleixen l’estadi de blastocist tenen la mateixa capacitat d'implantació que els blastocists euploides no multinucleats. Per últim, s’ha pogut concloure que el cultiu dels embrions multinucleats fins a l'estadi de blastocist permet la selecció dels potencialment viables. / Abnormalities in the number of nuclei in cells from cleaving human embryos was demonstrated as early as 1987 (Tesarik et al., 1987) and it is known as multinucleation. Errors in the mitotic process or nuclear fragmentation can both lead to multinucleation. This phenomenon has been correlated with impaired cleavage, high rate of chromosomal abnormalities, diminished embryo developmental potential, lower implantation, clinical pregnancy and birth rate. In our study, we analyzed the characteristics of ICSI cycles with and without multinucleated embryos. Second, morphokinetic characteristics and developmental ability of multinucleated and non-multinucleated embryos were compared. And finally, data from 199 preimplantation genetic screening cycles was used to analyze the chromosomal constitution of multinucleated embryos. Our results have shown that although recent improvements in culture conditions have been introduced in assisted reproduction laboratories, multinucleation is still a common phenomenon in IVF cycles. Patients with multinucleated embryos had a higher number of oocytes retrieved when compared with patient without multinucleated embryos. Nevertheless, the presence of multinucleated embryos does not compromise the reproductive outcome of the ICSI cycle. Dynamic evaluation of embryo development performed with time-lapse technology allowed a better detection of the multinucleation phenomenon, and altered morphokinetics has been detected in these embryos. Data obtained has confirmed a diminished developmental ability to reach the blastocyst stage as well as increased incidence of chromosomal abnormalities has been confirmed from our results. Nevertheless, euploid blastocysts derived from multinucleated embryos have high implantation potential. Culture of multinucleated embryos to the blastocyst stage allows the selection of those potentially viable.

Al SNC, la neuroinflamació és un procés desencadenat per varies circumstàncies incloent infeccions, toxicitat, lesió traumàtica o autoimmunitat i sempre implica la ràpida activació de les cèl·lules glials, en particular astròcits i micròglia. Com a major component del sistema immunitari al SNC, la micròglia juga un paper fonamental regulant la neuroinflamació. Un cop activada, la micròglia es transforma, prolifera, migra i secreta molècules immunomoduladores com les citoquines. A la mateixa vegada, les citoquines poden influenciar el fenotip microglial. Així, la IL-6 pot ser un potent inductor i modulador de l’activació microglial, mentre que la IL-10 pot reprimir el fenotip pro-inflamatori de la micròglia. Un dels models millor caracteritzats de lesió de nervi perifèric es la lesió del nervi facial (FNA), caracteritzada per la degeneració neuronal retrògrada, l’activació glial i el reclutament limfocític. Per entendre el paper de la IL-6 i la IL-10 en la regulació de la resposta inflamatòria després de FNA, utilitzem dos soques de ratolins transgènics, GFAP-IL6Tg i GFAP-IL10Tg, que produeixen les citoquines IL-6 i IL-10, respectivament, sota el promotor de GFAP en astròcits. Els nostres resultats demostren que després de FNA, la IL-6 té un lleu efecte atenuant l’activació astroglial, però indueix importants efectes en termes d’activació micròglia, que correlacionen amb una major mort neuronal. Així, trobem que la IL-6 augmenta la densitat microglial i modifica l’expressió de moltes molècules relacionades amb la comunicació cel·lular. La IL-6 produeix una baixada en les molècules d’adhesió microglial, les quals poden afectar la manera com la micròglia es comunica amb les neurones axotomitzades. Remarcablement, la IL-6 indueix menor formació de clústers microglials, qüestionant la noció de que aquests clústers corresponen a llocs de neurones degenerant-se i micròglia fagocítica. També, demostrem que la IL-6 provoca un augment en el nombre de limfòcits-T infiltrats al nucli facial. Tot i que la infiltració de limfòcits-T, especialment els Th2, es considera neuroprotectora en WT, podem especular que la IL-6 indueix el reclutament de limfòcits-T no-neuroprotectors i, per tant, es modificaria la supervivència neuronal. Malgrat els efectes detrimentals en supervivència neuronal als 21 dies, la IL-6 no continua augmentant la mort neuronal 7 setmanes desprès de FNA però sembla que empitjora la regeneració funcional efectiva a aquest temps. Per una altra banda, la IL-10 augmenta la supervivència neuronal comparada amb el WT, correlacionant amb canvis en la resposta microglial i immunitària. Remarcablement, la IL-10 provoca una major formació de clústers de micròglia, demostrant de nou que no hi ha correlació entre el nombre de clústers i la quantitat de mort neuronal. A més, la IL-10 disminueix l’expressió de molècules associades amb la fagocitosis microglial al principi de la lesió. Aquests resultats, conjuntament amb l’observat amb els animals GFAP-IL6Tg, ens duen a proposar que els clústers de micròglia poden tenir unes altres funcions, més enllà de la fagocitosis de residus neuronals. En aquest sentit, la IL-10 incrementa l’expressió de molècules coestimuladores en la micròglia dels clústers, senyalant aquestes estructures com a llocs d’interacció amb els limfòcits-T. Demostrem també que la IL-10 provoca un major reclutament de limfòcits-T al nucli facial, tot i que el mecanisme pel qual els limfòcits-T promouen la supervivència neuronal no ha estat encara aclarit. Malgrat els efectes beneficiosos en supervivència neuronal a 21 dies, la IL-10 no té efectes en aquesta ni en la regeneració funcional efectiva 7 setmanes desprès de FNA. En resum, els resultats obtinguts en la present tesis mostren que la producció dirigida en astròcits de IL-6 i IL-10 modula la resposta neuroinflamatòria orquestrada desprès de FNA i influencien la supervivència neuronal i la regeneració del nervi. / In the CNS, neuroinflammation is a process triggered by a variety of circumstances including infection, toxicity, traumatic injury or autoimmunity and as hallmark always involves the quick activation of glial cells, in particular astrocytes and microglia. As the prime component of the CNS immune system, microglia plays a major role regulating neuroinflammation. Once activated, microglial cells transform, proliferate, migrate and release immunomodulatory molecules like cytokines. In turn, cytokines can strongly influence microglial phenotype. In this sense, IL-6 can be a potent inducer and modulator of microglial activation while IL-10 can downregulate the pro-inflammatory phenotype of microglia. One of the most-well described models of peripheral nerve injury is facial nerve axotomy (FNA), characterized by retrograde neuronal degeneration, glial activation and lymphocyte recruitment. To understand the role of IL-6 and IL-10 in the orchestration of the inflammatory response after FNA, we used two transgenic mice, GFAP-IL6Tg and GFAP-IL10Tg, which produce the cytokines IL-6 and IL-10, respectively, under the GFAP promoter in astrocytes. Our results showed that after FNA, IL-6 elicited a slight effect on attenuating astroglial activation, but induced intensive effects in terms of microglial activation that correlated with a higher neuronal death. Thus, we found that IL-6 increased microglia density and modify the pattern of expression of several molecules related with cellular cross-talk. IL-6 produced a drop in microglial adhesion molecules, which may affect how microglia communicate with the lesioned motorneurons. Importantly, IL-6 led to less microglial cluster formation, calling in question the assumption that these clusters correspond just to places of dying neurons and phagocytic microglia. Also, our findings showed that IL-6 produced an increase in the number of infiltrated T-cell within the lesioned facial nucleus. Although infiltration of T-cells, specifically Th2 lymphocytes, has been reported to play a neuroprotective role in WT, we can speculate that IL-6 induced the recruitment of non-neuroprotective T-cells and therefore modify the outcome of lesioned motor neurons. Despite its detrimental effects in neuronal survival at 21 days, IL-6 did not continue increasing neuronal death 7 weeks after axotomy but seemed to impair effective functional regeneration at this time-point. On the other hand IL-10 promoted an increase in neuronal survival, in front to WT, correlating with changes in microglial and immune responses. Remarkably, IL-10 led to increased microglial clusters formation, showing again no correlation between the number of microglial clusters and the amount of neuronal death. Moreover, IL-10 decreased the expression of molecules associated with microglial phagocytosis during early time-points. These findings, together with the observations in GFAP-IL6Tg animals, lead us to propose that microglial clusters may have another functions rather than phagocytosis of neuronal debris. In this sense, IL-10 increased co-stimulatory molecule expression in clustering microglia, pointing to these clusters as locations of interaction with recruited lymphocytes. We showed that also IL-10 promoted the recruitment of T-cells into the facial nucleus, yet the mechanism by which infiltrated T-cells contribute to enhanced neuronal survival has not been yet elucidated. Despite its beneficial effects on neuronal survival at 21 days, IL-10 was not able to increase neither neuronal survival nor functional regeneration 7 weeks after FNA. In summary, the results obtained in the present thesis show that astrocyte-targeted production of IL-6 and IL-10 modulates the neuroinflammatory response orchestrated after FNA and influence the neuronal survival and nerve regeneration.

Per tal de protegir les cèl·lules germinals de sofrir inestabilitat genòmica, diversos mecanismes de control s’encarreguen de que la progressió de la meiosis sigui correcte. En mamífers, els espermatòcits que presenten defectes de recombinació o de la formació de la vesícula sexual pateixen un bloqueig a l’estadi de paquitè. Estudis previs del nostre laboratori descriuen que la via complex MRE11-ATM-CHK2 activa l’arrest dependent de recombinació en presència de trencaments de doble cadena (DSBs) no reparats. L’objectiu d’aquest treball ha estat identificar si els membres de la família p53, els quals són possibles substrats de ATM i CHK2, participen en l’activació del arrest depenent de recombinació. En una aproximació genètica, hem obtingut ratolins doble mutants portadors d’una mutació de un membre de la família p53 (p53, Tap63 o p73) en un fons defectiu per Trip13. La mutació de Trip13 causa defectes de recombinació, el qual activa l’arrest depenent de recombinació en els espermatòcits a l’estadi de paquitè. Per tant, hem estudiat com l’absència d’algun membre de la família p53 afectava aquest fenotip d’arrest el espermatòcits Trip13mod/mod. Els nostres resultats demostren que tant la deficiència de p53 com Tap63, però no p73, permeten que els espermatòcits progressin més enllà i arribin a l’estadi de paquitè tardà tot i acumular nombrosos DSBs no reparats. Addicionalment, l’absència de p53 o Tap63 resulta en una disminució del nombre d’espermatòcits apoptòtics a l’estadi de paquitè primerenc. Així, els nostres resultats indiquen que p53 i TAp63 són responsables d’activar l’arrest dependent de recombinació en els espermatòcits de ratolí. Tot i així, els espermatòcits doble mutants encara presenten un bloqueig a l’estadi de paquitè. Per tal d’estudiar si els espermatòcits doble mutants arresten a causa de l’activació de l’arrest depenent de la correcta formació de la vesícula sexual, hem analitzat la funcionalitat del MSCI en els mutants Trip13. Per tant, el fet de saltar-se l’arrest dependent de recombinació ens ha permès elucidar el paper de TRIP13 en el silenciament meiòtic, de manera que al fallar la vesícula sexual es desencadena l’apoptosi i bloqueig dels mutants Trip13. Aquests resultats infereixen que el bloqueig depenent de recombinació i el depenent de la correcta formació de la vesícula sexual, són mecanismes que s’activen per mecanismes genèticament separats. A partir de l’observació que TRIP13 és necessari per implementar el silenciament del MSCI, he dut a terme un anàlisis exhaustiu de la transcripció en els mutants de Trip13. Els nostres resultats de marcatge de RNA amb EU i activació de la RNA polimerasa II fosforilada (S2) suggereixen que la expressió de RNA en els espermatòcits mutants per Trip13 es troba incrementada en els estadis inicials de la meiosis. Addicionalment, la seqüenciació del RNA ha permès observar que els gens dels cromosomes sexuals i gens pre-meiòtics es troben sobre expressats en els mutants de Trip13, suggerint que TRIP13 és necessari per mantenir l’expressió d’aquests gens a nivells baixos. En conjunt, els resultats presentats en aquest treball contribueixen a entendre com els mecanismes de control regulen diversos passes crucials de la progressió de la profase meiòtica en els espermatòcits de mamífer. / In order to protect germinal cells from genomic instability, surveillance mechanisms ensure that meiosis occurs properly. In mammals, spermatocytes that display recombination or sex body defects experience an arrest at pachytene stage. Previous studies from our lab described that the MRE11 complex-ATM-CHK2 pathway activates the recombination-dependent arrest in the presence of unrepaired double strand breaks (DSBs). In this work we aimed to identify if p53 family members, which are putative targets of ATM and CHK2, participate in the activation of the recombination-dependent arrest. As a genetic approach, we bred double mutant mice carrying a mutation of a member of the p53 family (p53, TAp63, p73) in a Trip13 defective background. Trip13 mutation causes recombination defects, which activate the recombination-dependent arrest in pachytene-stage spermatocytes. Thus, we studied how the absence of p53 family members affected the arrest phenotype of Trip13mod/mod spermatocytes. Our data showed that p53 and TAp63 deficiency, but not p73, allowed spermatocytes to progress further into late pachynema, despite accumulating numerous unrepaired DBSs. In addition, lack of p53 or TAp63 resulted in a decrease of apoptotic spermatocytes at early pachytene stage. Therefore, our results indicate that p53 and TAp63 are responsible to activate the recombination-dependent arrest in mouse spermatocytes. Even though, double mutant spermatocytes still arrested at pachytene stage. To study if double mutant spermatocytes were arresting due to the activation of the sex body deficient arrest we analyzed MSCI functionality in Trip13 mutants. Thus, by bypassing the recombination-dependent arrest has allowed us to elucidate a role for TRIP13 protein in meiotic silencing, which consequently triggers apoptosis in double mutants at late pachytene stage due to sex body impairment. These results infer that the recombination-dependent and the sex-body deficient arrest are activated by two genetically separated mechanisms. From the observation that TRIP13 is required to implement MSCI silencing, we performed an exhaustive analysis of transcription in Trip13 mutants. Our results suggested that RNA expression in Trip13 mutants was increased in early meiotic stage spermatocytes, assessed by EU-labeling RNA and phosphorylated(S2)-RNA polymerase II. Moreover, RNA sequencing data highlighted the observation that sex chromosome genes and pre-meiotic genes are overexpressed in Trip13 mutants, suggesting that TRIP13 is required to maintain the expression of these genes at low levels. Overall, the data presented in this work contributes to the understanding on how surveillance mechanisms control several crucial steps of meiotic prophase progression in mammalian spermatocytes.

Des de la preocupació envers els riscos derivats dels programes de cribratge mamogràfic en la població i la impossibilitat d’analitzar-los de manera completa a partir d’estudis epidemiològics, es va analitzar la capacitat de les cèl·lules epitelials mamàries humanes de fer front als trencaments de cadena doble induïts pel mamògraf. Els resultats mostren que després de rebre una dosi de raigs X de 20 mGy, equivalent a la dosi estàndard rebuda per la superfície de la mama en una exploració mamogràfica, les cèl·lules epitelials mamàries (HMECs) envellides in vitro presenten un nombre major de trencaments de cadena doble (DSBs) que les cèl·lules més joves. Els nostres estudis apunten a una resposta ineficient del dany en les cèl·lules envellides a causa d’una mobilització incompleta i endarrerida de les proteïnes de reparació en els punts de trencament. Aquesta resposta ineficient es tradueix en un retard important en la reparació dels trencaments de cadena doble en les cèl·lules de population doublings (PD) més avançats, que dóna lloc a un augment de la inestabilitat genètica. Mitjançant la posta a punt d’una tècnica automatitzada i molt sensible de seguiment de la fosforilació de H2AX, un dels primers esdeveniments que tenen lloc en la senyalització dels DSBs, es va poder determinar també l’eficiència de la resposta al dany en cèl·lules BPECs de diferents donants transduïdes amb hTERT. Aquest segon estudi va permetre establir, tot i que de manera molt preliminar, que la lentitud en la reparació dels DSBs, no només apareixia a mesura que augmentaven el nombre de passes en cultiu, com havíem vist en les HMECs, sinó que també augmentava amb l’edat de la donant. Per l’establiment d’aquesta tècnica es va tenir en compte la rellevància de la fase del cicle cel·lular en el recompte dels foci de γH2AX deguda als canvis en el patró de marcatge de la histona al llarg d’aquest. Un cop avaluades les cinètiques d’aparició i desaparició de foci d’histona fosforilada, tant en HMECs com en BPECs es va observar que la re-expressió de la telomerasa i el conseqüent allargament dels telòmers no evitava que les cèl·lules presentessin una DDR (DNA Damage Response) alentida a PDs avançats. Aquests resultats ens va conduir a realitzar una revisió exhaustiva de la bibliografia per explorar quins factors, a banda de l’escurçament telomèric, podrien jugar un paper important en la relació entre envelliment i radiosensibilitat. Entre aquests, s’ha vist que l’estrès oxidatiu que pateixen les cèl·lules amb l’envelliment té un paper molt rellevant, tant pel seu rol com a agent nociu i generador de trencaments en el DNA com en relació a l’oxidació que té lloc en altres estructures cel·lulars. Per altra banda, també tenen lloc un seguit de canvis en l’organització nuclear relacionats amb l’envelliment, com la reestructuració de la heterocromatina, la pèrdua de funcionalitat de la lamina A o la manca d’integritat dels porus nuclears. En la revisió es va fer molta incidència en les relacions entre aquests canvis en l’organització nuclear i el detriment de la DDR observat en varis estudis i en el nostre. La conclusió més destacada és que s’observa una relació multifactorial entre la radiosensibilitat i l’edat. Fent palès des de diferents assajos que la capacitat de les cèl·lules de fer front al dany en el DNA es veu reduïda amb l’envelliment i que aquesta reducció podria contribuir a explicar l’augment dels riscos carcinogènics de l'exposició a radiacions en edats més avançades revelats pels estudis epidemiològics. Davant d’un augment en l’esperança de vida es fa cada cop més necessari tenir en compte l’envelliment alhora d’establir polítiques de radioprotecció. / Concerned about the risks of mammography screening and in order to overcome the limitations of the epidemiological studies, we analyzed the ability of human mammary epithelial cells to cope with mammogram-induced DNA damage. Our results show that an X-ray dose of 0.02 Gy, which is the standard dose received by the breast surface per two-view mammogram X-ray exploration, induces an increase in the DNA double-strand breaks number to in vitro aged–but not to young–human mammary epithelial cells. Our studies point to an ineffective DDR (DNA damage response) of aged cells due to both delayed and incomplete mobilization of repair proteins to DNA strand breaks. This inefficient response results in an important delay in double-strand break disappearance in cells of Population doublings (PD) advanced, causing an increased genetic instability. By setting up an automated and highly sensitive method of phosphorylated histone (γH2AX) foci scoring, an early step in DSB repair pathway, we determined the DDR efficiency of the Breast primary epithelial cells (BPECs) transduced with hTERT, obtained from several donors. The establishment of this method provided us with the insight that the delay in the DDR observed as the number of population doublings progressed was also relevant when comparing only the donor’s age. To establish this technique we took into account the importance of the cell cycle phase in the γH2AX foci counting since the phosphorylated histone staining pattern changes through the cycle. Once evaluated the kinetics of appearance and disappearance of foci of the γH2AX foci in both HMEC and BPECs we proved that the re-expression of hTERT on these cells did not avoid the DDR’s delay on the in vitro aged cells. These results drove us to perform an exhaustive review of the literature to explore what factors, in addition to telomeric shortening, are playing an important role in the relationship between aging and radiosensitivity. Among these, the oxidative stress that the aged cells suffer has a significant role, both as an agent that generates harmful breaks in DNA and in relation to corrosion that induces to other relevant cellular structures. On the other hand, there are several the age-related changes in the nuclear organization such as the restructuring of the heterochromatin, loss of functionality of the laminate or lack of integrity of the nuclear pores. In the review we tried to highlight the relationship between these changes in the nuclear organization and the deterioration of the DDR observed in several studies and in ours. The most important conclusion is that there is a multifactorial relationship between radiosensitivity and age. It seems clear that the ability of cells to cope with DNA damage is reduced with aging and such reduction could help to explain the increased carcinogenic risks of radiation exposure at older ages revealed by epidemiological studies. Challenged with an increase in life expectancy is ever more necessary to consider aging while establishing radiation protection policies.

Les motoneurones espinals requereixen factors neurotròfics per a la seva supervivència i diferenciació. L’efecte fisiològic dels factors neurotròfics és mediat per l’activació de diferents vies de senyalització i factors de transcripció entre els quals es troba la via NF-kB. S’ha relacionat la desregulació de l’activació d’aquesta via amb diferents patologies neuronals. S’ha proposat NF- kB com a diana terapèutica en diferents malalties neurodegeneratives. En el present estudi hem analitzat els mecanismes intracel·lulars involucrats en l’activació de la via NF-kB i la seva implicació en la supervivència de les motoneurones induïda pels factors neurotròfics. Els nostres resultats demostren l’habilitat dels factors neurotròfics de fosforil·lar el complex IKKs a través de l’activació de la via PI3K/Akt i d’induir la translocació nuclear de RelA. Per altra banda, s’ha demostrat que únicament l’activació de la via canónica d’NF-kB té un efecte regulador sobre la supervivència de les motoneurones. El bloqueig de la via canònica causa mort apoptòtica. Aquelles motoneurones que degeneren al inhibir la via es poden rescatar mitjançant la sobre-expressió de la proteïna Bcl-xL o bé inhibint la proteïna Bax. No obstant, els factors neurotròfics també activen la vía no canònica d’NF-kB tot hi que sense implicació en la supervivència. A les motoneurones, la inhibició de la via canònica comporta un augment de la proteïna pro-apoptótica Bim, la disminució de la proteïna Survival Motor Neuron (SMN) i del factor de transcripció CREB. La reducció dels nivells de proteïna SMN causa la malaltia neurodegenerativa hereditària Atròfia Muscular Espinal (AME), que afecta específicament a les motoneurones espinals. En el nostre laboratori hem desenvolupat un model in vitro d’AME. La reducció dels nivells d’SMN causa degeneració neurítica i mort de les motoneurones. Aquests dos processos es poden bloquejar amb la sobreexpressió de la proteïna Bcl-xL. En conclusió, el nostre treball demostra la implicació de la via NF-kB en la supervivència de les motoneurones i aporta nous avenços per a comprendre l’AME. / Las motoneuronas espinales requieren de los factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. El efecto fisiológico de los factores neurotróficos esta mediado por la activación de distintas vías de señalización y factores de transcripción entre los cuales está la vía NF-kB. La desregulación en la activación de esta vía se ha relacionado con distintas patologías neuronales. Se ha propuesto a NF-kB como una diana terapéutica en distintas enfermedades neurodegenerativas. En el presente estudio hemos analizado los mecanismos intracelulares involucrados en la activación de la vía NF-kB y su implicación en la supervivencia de las motoneuronas inducida por los factores neurotróficos. Nuestros resultados demuestran la habilidad de los factores neurotróficos de fosforilar el complejo IKKs a través de la activación de la vía PI3-K/Akt y de inducir la translocación nuclear de RelA. Por otro lado, se ha demostrado que únicamente la activación de la vía canónica de NF-kB tiene un efecto regulador sobre la supervivencia de las motoneuronas. El bloqueo de esta vía induce muerte celular apoptótica. Las motoneuronas que van a degenerar por la inhibición de la vía NF-kB, se pueden rescatar mediante la sobre-expresión de la proteína Bcl-xL o mediante la inhibición de la proteína Bax. Sin embargo, los factores neurotróficos también activan la vía no-canónica de NF-kB aunque sin implicación en la supervivencia. En las motoneuronas, la inhibición de la vía canónica conlleva el aumento de los niveles endógenos de la proteína pro-apoptótica Bim y la reducción de la proteína Survival Motor Neuron (SMN) y del factor de transcripción CREB. La reducción de los niveles de proteína SMN causa la enfermedad neurodegenerativa hereditaria Atrofia Muscular Espinal (AME), que afecta específicamente a las motoneuronas de la médula espinal. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo in vitro de AME. La disminución de los niveles de SMN causa la degeneración de las neuritas y la muerte de las motoneuronas. Estos dos procesos pueden ser bloqueados por sobre-expresión de la proteína Bcl-xL. En conclusión, nuestro trabajo demuestra la implicación de la vía NF-kB en la supervivencia de las motoneuronas y aporta nuevos avances para la comprensión de la AME. / The Spinal cord motoneurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation. The physiological effect of neurotrophic factors is mediated by activation of different signaling pathways and transcription factors including NF-kB. Deregulation in the activation of this pathway has been associated with different neural pathologies. NF-kB has been proposed as a therapeutic target in several neurodegenerative diseases. In this study we analyze the intracellular mechanisms involved in the activation of NF-kB pathway and its involvement in motor neuron survival induced by neurotrophic factors. Our results demonstrate the ability of neurotrophic factors to phosphorylate the IKKs complex through the PI3-K/Akt pathway activation and induce a nuclear translocation of RelA. On the other hand, it has been analysed the involvement of different forms of NF-kB activation pathway on motoneuron survival and the results demonstrate that only the canonical pathway has regulatory effects on the motoneuron survival. The blockade of this pathway induces apoptotic cell death. Motoneurons that will degenerate by inhibition of NF-kB, can be rescued by overexpression of Bcl-xL protein or by inhibiting Bax protein expression. However, neurotrophic factors also activate non-canonical pathway of NF-kB but this pathway does not modulate motoneuron survival. In motoneurons, inhibition of the canonical pathway leads to increased levels of the endogenous pro-apoptotic protein Bim and reduction of the Survival Motor Neuron Protein (SMN) and the transcription factor CREB. Reduced levels of SMN protein cause the hereditary neurodegenerative disease Spinal Muscular Atrophy (SMA), which specifically affects spinal cord motorneurons. In our laboratory, we developed an in vitro model of SMA. The decreased levels of SMN cause neurite degeneration and motorneuron death. These two processes can be blocked by overexpression of Bcl-xL protein. In conclusion, our study shows the involvement of NF-kB in the survival of motor neurons and provides new advances in the understanding of the SMA pathology.

Las neuronas tanto in vivo como in vitro requieren factores neurotróficos para su supervivencia y diferenciación. En concreto, las motoneuronas(MNs) responden a diferentes factores neurotróficos, entre los que se encuentran la familia de ligandos del GDNF y la familia de las neurotrofinas. Estas células no sólo sobreviven en presencia de estos factores, sino que la propia actividad neuronal y por consiguiente la despolarización de membrana también promueve su supervivencia, incrementando los niveles de calcio intracelular ([Ca2+]i) y activando diferentes vías de señalización.En este trabajo se estudia el papel del calcio y la calmodulina (CaM) en la regulación de la vía de supervivencia PI3K/PKB, en un modelo de MNs deembrión de pollo tratadas con GDNF. Los resultados obtenidos demuestran que GDNF promueve incrementos moderados en la [Ca2+]i que pueden resultar en la activación de la CaM. El tratamiento con antagonistas de la CaM inhibe laactivación de la Pl3K y PKB in vitro, bloqueando la supervivencia inducida por GDNF. El mecanismo por el cual la CaM ejerce este efecto está pococaracterizado. Tanto la PI-3K como la PKB, proteína que actúa por debajo en la vía de señalización de la PI-3K, son importantes mediando la supervivencia por factores neurotróficos. De hecho, se ha demostrado que GDNF promueve lasupervivencia neuronal a través de la activación de esta vía. Experimentos de inmunoprecipitación demuestran una interacción in vitro entre la subunidad reguladora de la PI-3K y CaM. Esta interacción es independiente de factor neurotrófico, pero se bloquea con el tratamiento con quelantes de calcio como EGTA. De estos resultados se concluye que los cambios producidos en [Ca2+]i inducidos por GDNF, promueven la supervivencia neuronal a través de un mecanismo que implica una regulación directa de la PI-3K por la CaM.Como segundo objetivo de este estudio, analizamos el papel de la quinasa regulada por calcio/CaM la CaMKIV en la supervivencia neuronal. Tras el clonaje y la caracterización de la CaMKIV de pollo (gCaMKIV), demostramos que la forma constitutivamente activa de la gCaMKIV es capaz de fosforilar a PKB, lo que se traduce en la supervivencia de las MNs en ausencia de factoresneurotróficos. Por contra, el bloqueo de la expresión endógena de la gCaMKIV,utilizando RNAs de interferencia, reduce el porcentaje de supervivencia mediado por GDNF y por la despolarización de membrana. Experimentos deinmunoprecipitación han demostrado una interacción in vitro entre la subunidad p85 de la PI-3K y la CaMKIV.En conclusión, se describe por primera vez, como GDNF induce incrementos en [Ca2+]i, activando CaM, que se encuentra unida a la PI-3K. Además, CaMKIV se puede unir a CaM y juntas regular la vía PI-3K/PKB promoviendo la supervivencia. Estos resultados aportan parte de las claves moleculares que regulan la supervivencia de estas neuronas, pudiendo así aplicar estos conocimientos para la comprensión y las posibles estrategias terapeúticas relacionadas con las enfermedades donde hay una degeneración de las MNs. / Neurons require neurotrophic factors for their survival and differentiation both in vivo and in vitro. In particular, motoneurons respond to a series of neurotrophic factors such as the family of the neurotrophins and the Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) Family Ligands (GFLs). Moderate increases of intracellular calcium concentration induced by either the activation of tropomyosin receptor kinase (Trk) receptor for neurotrophins or by neuronal activity, regulate neuronal survival.In the present report we wanted to establish the role of calcium and calmodulin in the activation of phosphatidylinositol 3-kinase (PI 3-K) pathway by GDNF. Our results demonstrate that GDNF treatment promotes moderate increases of intracelullar calcium concentration by mobilizing this cation from internal stores, resulting in the activation of calmodulin.The effects of [Ca2+]i increase after membrane depolarization are mainly mediated by calmodulin (CaM). We show that CaM antagonists inhibit PI 3-kinase and PKB activation as well as motoneuron survival induced by GDNF. It has been reported that (PI 3-K) and its downstream target protein kinase B (PKB) play a central role in cell survival induced by neurotrophic factors; in fact,GDNF promotes neuronal survival through the activation of the PI 3-kinase/PKB pathway. We also demonstrate that endogenous calcium/CaM associates with the 85-kDa regulatory subunit of PI 3-kinase (p85). This interaction is neurotrophic factor-independent, but it can be abolished with calcium chelators like EGTA.The second part of this work is focused on the analysis of proteins activated by calcium. We wanted to analyze the role of calcium and calmodulinrelated kinase, CaMKIV in cultured motoneurons. This work allowed us to cloneand characterize the Gallus gallus CaMKIV (gCaMKIV). We further demonstrate that the active form of gCaMKIV is able to phosphorylate PKB in the absence of neurotrophic factors and this activation can be blocked by PI3-kinase inhibitors.In addition, the active form of gCaMKIV promotes motoneuron survival in the absence of neurotrophic factors. Moreover, reduction of endogenous levels of CaMKIV by RNA interference results in a decrease of motoneuron survivalinduced by GDNF. A physical interaction between CaMKIV and the PI3-kinase regulatory subunit has been demonstrated by pull-down experiments.In conclusion, this study demonstrates that GDNF is able to promote increases in intracellular calcium concentration that leads to the activation of calmodulin thus regulating PI3-kinase pathway through interaction with p85 subunit. Moreover, CaMKIV is able to interact with calmodulin proposing a suitable model of cooperative effects in the regulation of motoneuron survival pathways.Therefore, these results will contribute to the understanding of the molecular basis for the regulation of MNs survival, thus contributing to the knowledge for prevention of MNs associated neuropathologies.