No description available.

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Des modifications du gène PMP22 (Peripheral Myelin Protein 22) sont responsables de neuropathies du système nerveux périphérique : l’Hypersensibilité à la Pression (HNPP : Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy) lorsqu’il est délété, CMT1A (Charcot-Marie-Tooth type 1A) lorsqu’il est dupliqué et CMT1E ou HNPP lors de mutations ponctuelles. Cependant, le rôle de la protéine PMP22 dans ces neuropathies demeure obscur. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux partenaires d’interactions potentiels de PMP22 : l’intégrine α6β4 (un récepteur des laminines), pourrait être impliqué dans le CMT1A. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de rat transgénique portant des copies supplémentaires de PMP22 de souris. Chez ce modèle, nous avons mis en évidence des variations d’expression génique des intégrines, ainsi qu’une mauvaise localisation cellulaire de celles-ci. Ces variations des niveaux d’expression des intégrines sont les témoins d’un retard de la maturation des cellules de Schwann myélinisantes, expliquant la diminution de l’épaisseur des gaines de myéline, observée chez les rats CMT1A. Dans un second temps, nous avons étudié le cas particulier d’un patient sans expression de PMP22, en raison de deux mutations composites sur les deux allèles de PMP22. Nous avons observé que l’absence de PMP22 chez l’homme entraine une absence complète de myéline due à un blocage de l’initialisation de la myélinisation lors de la formation du mésaxone. Dans un troisième temps, nous avons effectué une étude comparative de modèles animaux et de patients atteints de CMT1A / 1E et d’HNPP permettant de valider l’utilisation de tels modèles dans l’étude de ses neuropathies. Enfin, nous nous sommes intéressés d’un point de vue informatique à la structure tridimensionnelle de différentes protéines dont PMP22 grâce à la dynamique moléculaire. Ce modèle tridimensionnel de PMP22 est le point de départ de l’étude des mutations ponctuelles ainsi que des interactions de PMP22 avec son environnement. Grâce aux animaux modèles et à l’étude de patients, nous avons montré le rôle indispensable de PMP22 dans l’initialisation de la myélinisation ainsi que son effet sur les intégrines dans le CMT1A. L’utilisation de modèles informatiques tridimensionnels créés de PMP22 permettra de comprendre les effets des mutations ponctuelles sur sa structure, et ses interactions. / Interactions study of PMP22 protein with integrins in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A pathogenesisChanges in the PMP22 gene (Peripheral Myelin Protein 22) are responsible for peripheral nervous system neuropathies: Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy (HNPP) when PMP22 is deleted, Charcot Marie Tooth disease subtype 1A (CMT1A) when PMP22 is duplicated and CMT1E or HNPP when point mutations are present on the PMP22 gene. However, the PMP22 role in these neuropathies remains unclear. Firstly, we studied one of the PMP22 interaction partner: the α6β4 integrin (a laminin receptor), which could be involved in the CMT1A. During this study, we used a transgenic rat model carrying supplementary copies of PMP22 gene from mouse. With this model, we showed variations of expression of integrins genes and a mislocalization of integrins proteins. These variations of integrins witnesses a delay in myelinating Schwann cells maturation, explaining the reduction of myelin sheath thickness observed on CMT1A rats. In a second time, we studied the case of a patient without PMP22 expression, carrying compound mutations one the two alleles of PMP22. We showed that the lack of PMP22 on human leads to a complete lack of myelin due to a blocking in mesaxon formation. In a third time, we conducted a comparative study of animal models and patients with CMT1A / 1E and HNPP. This study allows us to validate the use of such models in the study of neuropathies. Finally, thanks to computational tools we studied the three-dimensional structure of different protein, including PMP22 by using molecular dynamics. This three-dimensional model is the starting point of point mutations study as well as PMP22 interactions with its environments. With animal models and through the study of patients, we have demonstrated the indispensable role of PMP22 in myelin initiation as well as, its effect on integrins expression in CMT1A. The use of PMP22 three-dimensional computational model will help us to understand effects of point mutation on PMP22 structure and interactions.

Les nerfs périphériques sont sujets à de nombreuses pathologies et l’étiologie des neuropathies périphériques (NP) est vaste (troubles métaboliques, infections, toxines, blessures physiques et mutations génétiques, ect.). Par exemple, les NP d’origine traumatique sont courantes et sont caractérisées par une dégénérescence dite Wallérienne des fibres nerveuses. Autre exemple, la maladie de Charcot-Marie-Tooth 1A (CMT1A) qui est la NP génétique héréditaire la plus fréquente. Elle est caractérisée par une surexpression de la protéine PMP22 impliquée dans le maintien de la gaine de myéline. Actuellement, il n’existe pas de traitement pharmacologique de ces deux affections des nerfs. Récemment, l’intérêt pour le rôle des antioxydants alimentaires, tels que la curcumine, a suscité de nombreuses recherches. Cette molécule est depuis longtemps utilisée en médecine asiatique pour ces propriétés thérapeutiques. Cependant, elle possède une très faible biodisponibilité et nécessite donc l’emploi de doses très élevées pour obtenir des effets bénéfiques. Dans une première étude, nos résultats ont montré que des faibles doses de curcumine administrées localement et en continu, améliorent la récupération fonctionnelle, les paramètres électrophysiologiques et histologiques, et l’expression des principales protéines de la myéline dans un modèle d’écrasement du nerf sciatique chez le rat. Ces effets bénéfiques ont été attribués aux propriétés antioxydantes de la curcumine. Dans une seconde étude, nos résultats ont montré qu’une faible dose de nanocristaux de curcumine (Nano-Cur), injectée en IP, améliorent le phénotype, les paramètres électrophysiologiques et histologiques dans un modèle transgénique de rat CMT1A. Dans cette étude, les effets positifs ont été attribués aux propriétés antioxydantes des Nano-Cur, couplés à l’activation de la voie de dégradation associée au réticulum endoplasmique, permettant la réduction de la surexpression nocive de PMP22 chez les rats CMT1A. L'ensemble de ces résultats démontrent que, l’administration de faibles doses de curcumine constitue un traitement prometteur dans la réparation des nerfs périphériques. / Peripheral nerves are subject to many pathologies and the etiology of peripheral neuropathies (PN) is vast (metabolic disorders, infections, toxins, physical injuries and genetic mutations, etc.). For example, PN of traumatic origin are common and are characterized by a called Wallerian degeneration of nerve fibres. Another example is Charcot-Marie-Tooth disease 1A (CMT1A), which is the most common hereditary genetic PN. It is characterized by an overexpression of the PMP22 protein involved in maintaining the myelin sheath. Currently, there is no pharmacological treatment for these two nerve disorders. Recently, interest in the role of dietary antioxidants, such as curcumin, has led to much research. This molecule has long been used in Asian medicine for its therapeutic properties. However, it has a very low bioavailability and therefore requires the use of very high doses to obtain beneficial effects. In a first study, our results showed that low doses of curcumin administered locally and continuously improve functional recovery, electrophysiological and histological parameters, and expression of major myelin proteins in a rat sciatic nerve crush model. These beneficial effects have been attributed to the antioxidant properties of curcumin. In a second study, our results showed that a low dose of curcumin nanocrystals (Nano-Cur), injected in IP, improves phenotype, electrophysiological and histological parameters in a transgenic model of CMT1A rats. In this study, the positive effects were attributed to the antioxidant properties of the Nano-cur, coupled with the activation of the endoplasmic reticulum associated degradation pathway, allowing the reduction of harmful overexpression of PMP22 in CMT1A rats. All these results show that the administration of low doses of curcumin is a promising treatment for peripheral nerve repair

Charcot-Marie-Tooth disease type 1A (CMT1A) is the most common subtype of congenital polyneuropathies of the peripheral nervous system and is currently incurable. It is characterised by an early onset in the first decades of life and a combination of motor and sensory symptoms. The disease is caused by a duplication of the peripheral myelin protein 22 (PMP22) gene. This is mainly expressed in Schwann cells, which produce the insulating myelin layer of the peripheral nerves. This overexpression leads to primary dysmyelination, demyelination and subsequent axonal loss. Clinically, CMT1A manifests as muscle weakness and atrophy of the extremities progressing from distal to proximal. In the CMT1A animal model, it has been shown that a reduction in the number of macrophages can have a positive effect on the course of the disease. A more detailed understanding of the role of this cell type, in particular their heterogeneity, as demonstrated for example after acute nerve lesions, is currently still lacking for CMT1A, but might be a promising therapeutic target. Our research group showed in preliminary work that the Schwann cell pathology - contrary to the clinical picture - is more pronounced proximally than distally. Based on this, we have taken into account both a temporal as well as a spatial component in our analysis. In this study, we show that in our genetic mouse model of CMT1A disease, there is a ubiquitous increase in macrophage number in peripheral nerves during postnatal development. In addition, we found evidence that this increase may be cell-subgroup specific. In contrast, a more nerve-specific finding was observed at an adult time point. Here, the increase in macrophage density was more pronounced in proximal nerves, such as the primarily motoric ventral root. Moreover, we found an internerval variability in the number of macrophages expressing phagocytosis markers and antigen-presenting MHCII molecules. The results of this study suggest a connection between the proximally pronounced histopathology and an altered interaction of macrophages. They suggest that there are diverse macrophage subpopulations that have adapted to their specific niche according to the environmental conditions in the different peripheral nerves. This hypothesis is supported by the fact that we also found heterogeneity between the nerves of wild-type animals. Within the scope of this project, we have developed the methodological basis to further clarify and confirm the diversity of macrophages in CMT1A. By taking into account the properties of specific macrophage subgroups, this might enable a more precise search for therapeutic targets that act at the site of the pathology itself in the future.:Acronyms 4 Introduction 9 1. The peripheral nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Macrophages in the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.1. Peripheral nerve macrophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. Peripheral neuropathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4. Charcot-Marie-Tooth disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6. Macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Research questions and aim of this project 25 Materials and Methods 27 1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.1. Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2. Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.3. Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4. Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.5. Apparatus, laboratory equipment and consumables . . . . . . . . . . . . 33 1.6. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2. Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1. Mouse procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.2. Histological analysis of diseased and non-diseased mouse peripheral nerves 38 2.3. Spatial analysis of diseased and undiseased mouse peripheral nerves . . . 42 2.4. Fluorescence Activated Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Results 47 1. Quantification of macrophages in CMT1A along the proximo-distal axis . . . . . 47 1.1. PMP22-tg mice have increased numbers of nuclei . . . . . . . . . . . . . 48 1.2. Peripheral nerves of PMP22-tg mice display a heterogenous macrophage response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 1.3. Characterisation of nerve macrophages in WT at different time points . . 55 1.4. There are no differences in the density of macrophages along the proximodistal axis within one nerve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2. Macrophage characterisation in 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.1. There is a lack of increase in total volume of CX3CR1+ macrophages in nerves of P18 PMP22-tg mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.2. There are no significant differences in spatial properties . . . . . . . . . . 61 3. Inflammatory profile of macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1. There are no changes in the expression of the lysosomal marker CD107b in 6mo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 3.2. DECTIN1 expression is altered in nerve macrophages at 6 months . . . . 66 3.3. The ventral roots of P18 PMP22-tg mice have a higher quantity ofMHCII objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.4. Macrophages in VR have higher MHCII+ content . . . . . . . . . . . . . 69 3.5. The Npero in PMP22-tg mice displays a specific switch in the antigen presenting cell type via MHCII at P18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4. Establishing a protocol for nerve macrophage isolation for downstream transcriptomic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1. Isolating cells from peripheral nerve tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.2. Isolating macrophages using FACS-analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Discussion 77 1. Macrophage increase in different nerves and at different disease stages is more diverse than previously known . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2. CX3CR1+ macrophage subpopulation stays quantitatively stable and is spatially unchanged . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3. Inflammation markers display a diverse pattern in nerve macrophages . . . . . . 86 4. Macrophage separation enables subpopulation-specific analyses . . . . . . . . . . 89 5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Abstract 94 Zusammenfassung 95 References 97 A. Appendix i A.1. List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.2. List of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.3. Macros in Fiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii A.4. Macros in Imaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v A.5. Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x A.6. Copyright of figures taken from publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii B. Selbstständigkeitserklärung (Declaration of independence) xx C. Curriculum Vitae xxi D. Acknowledgements xxii / Die Charcot-Marie-Tooth-1A (CMT1A) Erkrankung ist die, derzeit unheilbare, häufigste Subform der angeborenen Polyneuropathien des peripheren Nervensystems. Sie zeichnet sich durch einen frühen Beginn bereits in den ersten Lebensdekaden und kombiniert motorisch-sensorische Symptome aus. Ursächlich ist eine Duplikation des peripheren Myelinprotein 22 (PMP22) Gens, welches vornehmlich in Schwannzellen exprimiert wird, die die isolierende Myelinschicht der peripheren Nerven produzieren. Diese Überexpression führt zu primärer Dysmyelinisierung, Demyelinisierung und nachfolgenden axonalen Verlusten. Klinisch äußert sich CMT1A durch eine von distal nach proximal fortschreitende Muskelschwäche und -atrophie der Extremitäten. Im CMT1A Tiermodell zeigte sich, dass eine Verringerung der Makrophagenanzahl den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen kann. Ein genaueres Verständnis der Rolle dieser Zellen, insbesondere deren Heterogenität, wie etwa nach akuten Nervenläsionen nachgewiesen, fehlt derzeit noch für CMT1A, könnte jedoch einen vielversprechenden therapeutischen Ansatzpunkt darstellen. Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe zeigten eine – konträr zum klinischen Bild – proximal stärker ausgeprägte Schwannzellpathologie. Hieran anknüpfend berücksichtigt unsere Analyse neben einer zeitlichen auch eine räumliche Komponente. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir in peripheren Nerven des genetischen CMT1A Mausmodells eine ubiquitäre Erhöhung der Makrophagenanzahl in der postnatalen Entwicklung. Zusätzlich fanden wir Hinweise, dass diese Erhöhung Zell-subgruppenspezifisch sein könnte. Zu einem adulten Zeitpunkt zeigte sich indes ein Nerven-spezifischeres Bild. Hier war die erhöhte Makrophagendichte in proximalen Nerven, etwa der primär motorischen vorderen Nervenwurzel, stärker betont. Überdies fanden wir eine internervale Variabilität der Anzahl an Makrophagen, die Phagozytosemarker und antigenpräsentierende MHCII-Moleküle exprimierten. Unsere Ergebnisse lassen einen Zusammenhang zwischen der proximal betonten Histopathologie und einer veränderten Interaktion von Makrophagen vermuten. Sie legen nahe, dass es diverse Subpopulationen gibt, die sich entsprechend biologischer Nischen an die jeweiligen Gegebenheiten der peripheren Nerven angepasst haben. Diese These wird unter anderem dadurch unterstützt, dass sich auch die Nerven der Wildtyp Tiere heterogen zeigten. Zur weiteren Abklärung und Bestätigung der Diversität von Makrophagen in CMT1A, haben wir im Rahmen dieser Arbeit die methodischen Grundlagen entwickelt. Dies könnte es in Zukunft ermöglichen, unter Berücksichtigung der Eigenschaften spezifischer Makrophagen-Subgruppen, gezielter nach therapeutischen Ansatzpunkten zu suchen, die am Ort der Pathologie selbst wirken.:Acronyms 4 Introduction 9 1. The peripheral nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2. Macrophages in the PNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.1. Peripheral nerve macrophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3. Peripheral neuropathies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4. Charcot-Marie-Tooth disease . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 5. Charcot-Marie-Tooth disease type 1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 6. Macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 Research questions and aim of this project 25 Materials and Methods 27 1. Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.1. Mouse lines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.2. Antibodies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.3. Primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.4. Buffers and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 1.5. Apparatus, laboratory equipment and consumables . . . . . . . . . . . . 33 1.6. Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2. Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.1. Mouse procedures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.2. Histological analysis of diseased and non-diseased mouse peripheral nerves 38 2.3. Spatial analysis of diseased and undiseased mouse peripheral nerves . . . 42 2.4. Fluorescence Activated Cell Sorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 2.5. Statistical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 Results 47 1. Quantification of macrophages in CMT1A along the proximo-distal axis . . . . . 47 1.1. PMP22-tg mice have increased numbers of nuclei . . . . . . . . . . . . . 48 1.2. Peripheral nerves of PMP22-tg mice display a heterogenous macrophage response . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 1.3. Characterisation of nerve macrophages in WT at different time points . . 55 1.4. There are no differences in the density of macrophages along the proximodistal axis within one nerve . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 2. Macrophage characterisation in 3D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 2.1. There is a lack of increase in total volume of CX3CR1+ macrophages in nerves of P18 PMP22-tg mice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 2.2. There are no significant differences in spatial properties . . . . . . . . . . 61 3. Inflammatory profile of macrophages in CMT1A . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 3.1. There are no changes in the expression of the lysosomal marker CD107b in 6mo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 3.2. DECTIN1 expression is altered in nerve macrophages at 6 months . . . . 66 3.3. The ventral roots of P18 PMP22-tg mice have a higher quantity ofMHCII objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.4. Macrophages in VR have higher MHCII+ content . . . . . . . . . . . . . 69 3.5. The Npero in PMP22-tg mice displays a specific switch in the antigen presenting cell type via MHCII at P18 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4. Establishing a protocol for nerve macrophage isolation for downstream transcriptomic analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.1. Isolating cells from peripheral nerve tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.2. Isolating macrophages using FACS-analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 Discussion 77 1. Macrophage increase in different nerves and at different disease stages is more diverse than previously known . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 2. CX3CR1+ macrophage subpopulation stays quantitatively stable and is spatially unchanged . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 3. Inflammation markers display a diverse pattern in nerve macrophages . . . . . . 86 4. Macrophage separation enables subpopulation-specific analyses . . . . . . . . . . 89 5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92 Abstract 94 Zusammenfassung 95 References 97 A. Appendix i A.1. List of Tables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.2. List of Figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i A.3. Macros in Fiji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iii A.4. Macros in Imaris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v A.5. Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x A.6. Copyright of figures taken from publications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xvii B. Selbstständigkeitserklärung (Declaration of independence) xx C. Curriculum Vitae xxi D. Acknowledgements xxii

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Charcot-Marie-Tooth-1A (CMT1A) is the most prevalent inherited peripheral neuropathy and no curing treatment is available. Even though the genetic cause (a duplication of the myelin protein PMP22) is known since the 90th, the pathological mechanisms are poorly understood. Clinically, affected patients suffer from muscular atrophies, foot deformities and sensory deficits. Histologically, diseased peripheral nerves show primary myelin abnormalities during development followed by a slowly progressing demyelination and subsequent axonal loss in adulthood, which accounts for clinical symptoms. Most specifically, CMT1A nerves exhibit onion bulb formations, which are supernumerary Schwann cells, wrapping concentrically around a central axon-Schwann cell unit. Here, we show that Schwann cells of various demyelinating neuropathies express the paracrine growth factor Neuregulin-1 type-I, which is undetectable in healthy nerves but essential for regeneration after acute nerve injury. We could demonstrate a correlation of Nrg1-I expression in Schwann cells with clinical and histological disease hallmarks in various genetically modified mouse models. Induction of glial Nrg1-I expression on a wildtype background induced symptoms reminiscent of a demyelinating neuropathy, whereas ablation of Nrg1 in Schwann cells of a CMT1A mouse model ameliorated neuropathological hallmarks. Especially, formation of onion bulbs, the key hallmark of CMT1A, could be attributed to Nrg1-I expression in Schwann cells. Furthermore, we showed that this is facilitated via the ErbB2/MEK/ERK signaling cascade. This study proposes a model in which the beneficial, transient upregulation of glial Nrg1-I after acute nerve injury turns into a detrimental constantly active repair-response, due to functional loss of axonal contact in CMT1A and supposedly in other demyelinating neuropathies. This putative common pathway in peripheral neuropathies might open up promising new therapeutic strategies that interfere with the Nrg/ErbB2/MEK/ERK pathway, especially since ErbB2 receptor inhibitors are already applied in breast cancer therapies.:Abbreviations ........................................................................................................................................... i 1 Introduction ..................................................................................................................................... 1 1.1 The central and peripheral nervous system .............................................................................1 1.2 Schwann cells and Myelination ................................................................................................3 1.3 Neuregulin ................................................................................................................................6 1.4 Acute injury of the peripheral nervous system and Wallerian degeneration ....................... 11 1.5 Diseases of the peripheral nervous system: Neuropathies ................................................... 12 1.6 Charcot-Marie-Tooth disease ................................................................................................ 13 2 Aims ............................................................................................................................................... 16 3 Material and methods ................................................................................................................... 17 3.1 Animal models ....................................................................................................................... 17 3.2 Genotyping ............................................................................................................................ 18 3.3 Phenotyping tests .................................................................................................................. 18 3.4 Histology ................................................................................................................................ 19 3.5 Molecular biology .................................................................................................................. 22 3.6 Material ................................................................................................................................. 26 4 Results ........................................................................................................................................... 29 4.1 Ablation of glial Neuregulin-1 improves the clinical phenotype in a mouse model of CMT1A ………………………………………………………………………………………………………………………………………… 29 4.2 Overexpression of Neuregulin-1 type-I induces hallmarks of peripheral neuropathy ......... 34 4.3 Glial Neuregulin-1 type-I signaling promotes survival and attraction of Schwann cells ....... 36 4.4 Dedifferentiation promoting signaling pathways are induced by SC-Nrg1-I ........................ 40 5 Discussion ...................................................................................................................................... 45 6 Abstract ......................................................................................................................................... 50 7 Zusammenfassung ......................................................................................................................... 51 8 References ..................................................................................................................................... 52 9 Appendix .......................................................................................................................................... iii 9.1 List of figures ........................................................................................................................... iii 9.2 List of tables............................................................................................................................. iv 9.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .......................................................... v Content 9.5 Publications ........................................................................................................................... viii

Die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit 1A (CMT1A) gehört zur Familie der erblichen Neuropathien des peripheren Nervensystems (PNS) und ist mit einer Prävalenz von 1 zu 2500 die häufigste Subform. Die Patienten leiden an einer distal ausgeprägten Muskelatrophie und sensorischen Beeinträchtigungen. Die Histopathologie zeigt sich im PNS durch Myelinisierungsdefekte, die Bildung von Zwiebelschalenformationen, eine langsam fortschreitende Demyelinisierung und einen axonalen Verlust in späteren Krankheitsstadien, die für die klinische Symptomatik verantwortlich sind. Bis heute gibt es keine Behandlungsmöglichkeiten. Die genetische Duplikation des Gens, das für das periphere Myelinprotein von 22kDa (PMP22) kodiert, ist Hauptursache der Erkrankung und betrifft speziell die myelinisierenden Gliazellen des PNS, die Schwannzellen. Erkrankte Schwannzellen induzieren eine de novo Expression des glialen Wachstumsfaktors Neuregulin 1-Typ I (NRG1-I). Die chronische NRG1-I Überexpression wurde als ein maßgeblicher Faktor der Krankheitspathogenese der CMT1A identifiziert. Aberrantes NRG1-I überstimuliert den ERBB2 Rezeptor, was zu einer Hyperaktivierung des MEK-ERK Signalwegs führt. Die genetische Ablation von NRG1 spezifisch in Schwannzellen verbesserte die klinische Präsentation und Histopathologie in CMT1A Mäusen. Damit einhergehend waren die ERBB2 und ERK Hyperaktivität in Schwannzellen normalisiert. Die Inhibition der NRG1-I-vermittelten pathologischen Signalkaskade stellt damit einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz für die CMT1A dar. Die langfristige pharmakologische Inhibition entweder der ERBB2 oder der ERK Aktivierung verschlechterte jedoch die klinische Präsentation von adulten CMT1A Ratten. Die Verringerung der ERBB2 Aktivität verschlimmerte die axonale Funktion und bewirkte eine Zunahme von Zwiebelschalenformationen. Die Reduktion der ERK Hyperaktivität führte zu einem frühen behandlungsinduzierten Gewichtsverlust und einer Zunahme an demyelinisierten Axonen. Das Auftreten sekundär dysregulierter Signalkaskaden könnte zu dem Scheitern der Studien beigetragen haben. Das Scheitern beider Studien weist jedoch auch darauf hin, dass die Komplexität der CMT1A Pathobiologie besonders während der späten chronischen Phase noch immer unzureichend verstanden ist und weiterer Erforschung bedarf. Zusammenfassend ist die Interferenz mit der ERBB2-ERK Signalkaskade für die Behandlung der CMT1A ungeeignet. Dies weist auf die Notwendigkeit hin, ein tieferes Verständnis der Komplexität der späten chronischen CMT1A Pathobiologie und vor allem der NRG1-vermittelten Pathomechanismen zu erlangen. Beides schafft die Grundlage für die Identifizierung neuer therapeutischer Behandlungsansätze:Abbreviations 1. Introduction 1.1 The peripheral nervous system 1.1.1 Structure and functions of the nervous system 1.1.2 Neurons and glial cells 1.1.3 Signal transduction and myelination 1.1.4 Development and functions of Schwann cells 1.2 Peripheral neuropathies 1.2.1 Acquired and inherited peripheral neuropathies 1.2.2 Clinical presentation and classification of Charcot-Marie-Tooth diseases 1.2.3 The peripheral myelin protein of 22 kDa (PMP22) 1.2.4 Animal models of PMP22 – associated CMTs 1.2.5 Pathobiology and treatment options of CMT1A 1.2.6 Ablation of Schwann cell Neuregulin 1 ameliorates the phenotype of a CMT1A mouse model 1.3 The Neuregulin 1 – ERBB2 – ERK signaling axis in the Charcot-Marie-Tooth 1A disease 1.3.1 Functions of Neuregulin 1 in the peripheral nervous system 1.3.2 ERBB receptor tyrosine kinase signaling in Schwann cells 1.3.3 NRG1-I – ERBB mediated pathophysiological effects in CMT1A 1.3.4 Options for pharmacological interference with NRG1-I – mediated ERBB2 and ERK activation 1.4 Aim of the dissertation 2. Materials and Methods 2.1 Materials 2.1.1 Chemicals and Reagents 2.1.2 Consumable Supplies 2.1.3 Technical Equipment 2.1.4 Kits 2.1.5 Buffers and Solutions 2.1.6 Antibodies 2.1.7 Genotyping Primer 2.1.8 qPCR Primer 2.1.9 Enzymes 2.1.10 Software 2.2 Animal caretaking and treatment 2.2.1 Animal strains and breeding 2.2.2 Animal breeding and caretaking 2.2.3 Identification of animals 2.2.4 Herceptin® and Selumetinib treatment of CMT1A rats 2.2.5 Mechanical phenotyping 2.2.6 Electrophysiological examination 2.2.7 Euthanasia 2.2.8 Preparation and handling of peripheral nerve tissues 2.3 Histological methods 2.3.1 Embedding of isolated peripheral nerves in Agar 100 resin 2.3.2 Generation, imaging, and analysis of semi-thin sections 2.3.3 Coating of support copper grids for ultrastructure analysis 2.3.4 Generation, contrasting, imaging, and analysis of ultra-thin cross-sections 2.4 Protein Biochemistry 2.4.1 Isolation and quantification of (phospho-) proteins from frozen peripheral nerves 2.4.2 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) 2.4.3 Western blot and Fast Green staining 2.5 Molecular Biology Methods 2.5.1 Isolation of genomic DNA from tissues 2.5.2 Polymerase chain reaction of genomic DNA 2.5.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products 2.5.4 RNA Isolation 2.5.5 Quality and quantity assessment of isolated RNA 2.5.6 cDNA Synthesis of total RNA 2.5.7 Quantitative real-time PCR analysis 2.6 Bioinformatics 2.6.1 Power analysis 2.6.2 Statistical methods 3. Results 3.1 NRG1 – ERBB2/ERBB3 – ERK signaling is increased in an adult CMT1A-resembling rat model 3.2 Late long-term blockage of ERBB2 signaling deteriorates the clinical and histopathological outcome of CMT1A rats 3.2.1 The clinical phenotype and histopathological hallmarks worsen after long-term Herceptin treatment of CMT1A rats 3.2.2 Herceptin application inhibits NRG1-I – mediated ERBB2/ERBB3 activation and concomitant downstream signaling 3.2.3 Inhibition of ERBB2 – mediated downstream signaling does not affect CMT1A Schwann cell dedifferentiation 3.3 Late long-term application of Selumetinib deteriorates the clinical presentation of CMT1A rats 3.3.1 Late short-term Selumetinib application ameliorates NRG1-I – ERBB2/3 – mediated downstream signaling 3.3.2 Long-term Selumetinib treatment deteriorates the clinical phenotype and promotes demyelination in CMT1A rats 3.3.3 Selumetinib treatment improved the dysbalance of the ERK and AKT pathways in CMT1A 4. Discussion 4.1 NRG1-I-mediated malsignaling may not have been sufficiently inhibited to impact the clinical outcome of CMT1A rats after ERBB2 suppression 4.2 Herceptin-binding of ERBB2 may interfere with the regeneration ability of Schwann cells in CMT1A 4.3 Dysregulation of ERK activity in late CMT1A promotes demyelination 5. Abstract 6. Zusammenfassung 7. References 8. Appendix 8.1 List of figures 8.2 List of tables 8.3 Eigenständigkeitserklärung 8.4 Curriculum vitae 8.5 Publikationen 8.6 Danksagungen / The Charcot-Marie-Tooth disease 1A (CMT1A) belongs to the family of inherited neuropathies of the peripheral nervous system (PNS) and is the most frequent subform with a prevalence of 1 in 2500. Patients present with a distally pronounced muscle atrophy and sensory impairments. Histologically, peripheral nerves display developmental myelination abnormalities, onion bulb formations, slowly progressive demyelination, and axonal loss during later disease stages, which account for clinical symptomatology. No treatment options are available upon today. Genetic testing revealed a genomic duplication of the gene encoding for the peripheral myelin protein of 22kDa (PMP22) as the primary cause of disease that affects specifically the myelinating glia of the PNS, the Schwann cells. Pmp22 overexpression has been shown to dysregulate physiological axon-glia interactions. Diseased Schwann cells respond with a de novo expression of the glial growth factor, Neuregulin 1-type I (NRG1-I). While not present under physiological conditions, chronic NRG1-I signaling was identified to be a major driver of disease pathogenesis in CMT1A. On the mechanistic level, aberrant NRG1-I has been demonstrated to overstimulate the ERBB2 receptor resulting in hyperactivation of the MEK-ERK pathway. Genetic disruption of NRG1 specifically in Schwann cells strongly improved the clinical presentation and histopathological manifestation of disease hallmarks in CMT1A-resembling rodents. This beneficial outcome was accompanied by a downregulation of ERBB2 and ERK hyperactivity in Schwann cells. Therefore, interfering with NRG1-I-mediated pathological signaling was proposed to constitute a promising therapeutic approach for CMT1A. However, long-term pharmacological obstruction of either ERBB2 or ERK activation deteriorated the clinical presentation of adult CMT1A rats. ERBB2 inhibition worsened axonal function and induced an increase in onion bulb formations. Reduction of ERK hyperactivity resulted in an early treatment-induced weight loss and an increase in demyelinated axons. The development maladaptive signaling mechanisms may have caused the observed outcome of the trials. However, failing of both trials instead also demonstrates that the complexity of late chronic CMT1A pathobiology is still poorly understood and has to be further investigated. In conclusion, interfering with ERBB2-ERK signaling, downstream of NRG1-I, turned out to be not a viable approach for CMT1A treatment. This points to the necessity to gain a deeper understanding of the late chronic CMT1A intricacy and especially of NRG1-mediated pathomechanisms in neuropathy. Both may build the foundation for the identification of novel therapeutic approaches and drug targets.:Abbreviations 1. Introduction 1.1 The peripheral nervous system 1.1.1 Structure and functions of the nervous system 1.1.2 Neurons and glial cells 1.1.3 Signal transduction and myelination 1.1.4 Development and functions of Schwann cells 1.2 Peripheral neuropathies 1.2.1 Acquired and inherited peripheral neuropathies 1.2.2 Clinical presentation and classification of Charcot-Marie-Tooth diseases 1.2.3 The peripheral myelin protein of 22 kDa (PMP22) 1.2.4 Animal models of PMP22 – associated CMTs 1.2.5 Pathobiology and treatment options of CMT1A 1.2.6 Ablation of Schwann cell Neuregulin 1 ameliorates the phenotype of a CMT1A mouse model 1.3 The Neuregulin 1 – ERBB2 – ERK signaling axis in the Charcot-Marie-Tooth 1A disease 1.3.1 Functions of Neuregulin 1 in the peripheral nervous system 1.3.2 ERBB receptor tyrosine kinase signaling in Schwann cells 1.3.3 NRG1-I – ERBB mediated pathophysiological effects in CMT1A 1.3.4 Options for pharmacological interference with NRG1-I – mediated ERBB2 and ERK activation 1.4 Aim of the dissertation 2. Materials and Methods 2.1 Materials 2.1.1 Chemicals and Reagents 2.1.2 Consumable Supplies 2.1.3 Technical Equipment 2.1.4 Kits 2.1.5 Buffers and Solutions 2.1.6 Antibodies 2.1.7 Genotyping Primer 2.1.8 qPCR Primer 2.1.9 Enzymes 2.1.10 Software 2.2 Animal caretaking and treatment 2.2.1 Animal strains and breeding 2.2.2 Animal breeding and caretaking 2.2.3 Identification of animals 2.2.4 Herceptin® and Selumetinib treatment of CMT1A rats 2.2.5 Mechanical phenotyping 2.2.6 Electrophysiological examination 2.2.7 Euthanasia 2.2.8 Preparation and handling of peripheral nerve tissues 2.3 Histological methods 2.3.1 Embedding of isolated peripheral nerves in Agar 100 resin 2.3.2 Generation, imaging, and analysis of semi-thin sections 2.3.3 Coating of support copper grids for ultrastructure analysis 2.3.4 Generation, contrasting, imaging, and analysis of ultra-thin cross-sections 2.4 Protein Biochemistry 2.4.1 Isolation and quantification of (phospho-) proteins from frozen peripheral nerves 2.4.2 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) 2.4.3 Western blot and Fast Green staining 2.5 Molecular Biology Methods 2.5.1 Isolation of genomic DNA from tissues 2.5.2 Polymerase chain reaction of genomic DNA 2.5.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products 2.5.4 RNA Isolation 2.5.5 Quality and quantity assessment of isolated RNA 2.5.6 cDNA Synthesis of total RNA 2.5.7 Quantitative real-time PCR analysis 2.6 Bioinformatics 2.6.1 Power analysis 2.6.2 Statistical methods 3. Results 3.1 NRG1 – ERBB2/ERBB3 – ERK signaling is increased in an adult CMT1A-resembling rat model 3.2 Late long-term blockage of ERBB2 signaling deteriorates the clinical and histopathological outcome of CMT1A rats 3.2.1 The clinical phenotype and histopathological hallmarks worsen after long-term Herceptin treatment of CMT1A rats 3.2.2 Herceptin application inhibits NRG1-I – mediated ERBB2/ERBB3 activation and concomitant downstream signaling 3.2.3 Inhibition of ERBB2 – mediated downstream signaling does not affect CMT1A Schwann cell dedifferentiation 3.3 Late long-term application of Selumetinib deteriorates the clinical presentation of CMT1A rats 3.3.1 Late short-term Selumetinib application ameliorates NRG1-I – ERBB2/3 – mediated downstream signaling 3.3.2 Long-term Selumetinib treatment deteriorates the clinical phenotype and promotes demyelination in CMT1A rats 3.3.3 Selumetinib treatment improved the dysbalance of the ERK and AKT pathways in CMT1A 4. Discussion 4.1 NRG1-I-mediated malsignaling may not have been sufficiently inhibited to impact the clinical outcome of CMT1A rats after ERBB2 suppression 4.2 Herceptin-binding of ERBB2 may interfere with the regeneration ability of Schwann cells in CMT1A 4.3 Dysregulation of ERK activity in late CMT1A promotes demyelination 5. Abstract 6. Zusammenfassung 7. References 8. Appendix 8.1 List of figures 8.2 List of tables 8.3 Eigenständigkeitserklärung 8.4 Curriculum vitae 8.5 Publikationen 8.6 Danksagungen

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Die Charcot Marie Tooth Erkrankung Typ 1A (CMT1A) stellt die häufigste Unterform aller hereditären Neuropathien dar (Skre, 1974). Es handelt sich hierbei um eine autosomal- dominant vererbte Erkrankung beruhend auf einer Duplikation des Abschnittes auf Chromosom 17, welche das Gen für das periphere Myelinprotein 22kDa beinhaltet. Diese Duplikation resultiert in einer erhöhten Gendosis des pmp22, durch welche es zu einer verstärkten Bildung des Peripheren Myelin Proteins 22kDa unter anderem in Schwannzellen kommt. Es ist noch nicht abschließend geklärt in wieweit diese erhöhte Expression zu der fortschreitenden Demyelinisierung und einer fehlgesteuerten Remyelinisierung peripherer Nerven führt. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind Gegenstand aktueller Forschung. Bei der CMT1A sind sowohl die efferenten als auch die afferenten Nerven betroffen. Durch die im Anschluss an demyelinisierende Prozesse stattfindende fehlgesteuerte Remyelinisierung zur Kompensation der Schädigung kommt es zu einer Verdickung der Nerven mit einer typischen Bildung von Zwiebelschalen. Diese entstehen durch die konzentrische Anlagerung überzähliger, Promyeliniserenden Schwannzellen. Im Verlauf kommt es bei einer demyelinisierenden Erkrankung auch zu einem Untergang der zugehörigen Neuronen. Klinisch imponieren diese neurodegenerativen Veränderungen als eine distal betonte, langsam progrediente Muskelschwäche und - atrophie mit variabler Ausprägung. Zusätzlich können bei den Patienten sensible Ausfälle und Schmerzen auftreten. Die klinische Manifestation ist durch das Ausmaß der Demyelinisierung und des darauffolgenden Axonverlusts bestimmt. Die Duplikation des Genes PMP22 führt bei unterschiedlichen Patienten trotz identischer genetischer Ursache zu einer starken Variabilität der Ausprägung der klinischen Symptome. Diese, und ebenfalls Unterschiede in Erstmanifestationsalter und Krankheitsverlauf, zeigen sich sogar innerhalb von Familien und bei eineiigen Zwillingen. Der ursächliche Pathomechanismus dieser Variabilität ist unbekannt. Aktuell wird der Schweregrad der Erkrankung eines Patienten meist anhand des CMT Neuropathie Scores ermittelt und abgebildet. In der klinischen Beurteilung ist eine schleichende Verschlechterung zu beobachten. Diese langsame Progression der Erkrankung zeigte sich, auch im Rahmen klinischer Studien, in einer Veränderung des CMTNS von ca. 0,23- 0,68 Punkten pro Jahr (Verhamme et al., 2009, Shy et al., 2008, Micallef et al., 2009, Pareyson et al., 2011). Durch die Erkrankung hervorgerufene motorische Einschränkungen äußern sich im Alltag durch eine verminderte Feinmotorik. Die verstärkte Atrophie der Extensoren im Vergleich zu den Flexoren führen zu einem Steppergang oder einem Schleifen der Füße, resultieren aber nur selten in einer absoluten Gehbehinderung. Die Erkrankung verläuft nicht letal. Aktuelle Studien zeigten allerdings bei CMT1A Patienten/innen mit einem langen Krankheitsverlauf eine verminderte Lebenserwartung (Vaeth et al., 2017). Die Ursache hierfür konnte aktuell noch nicht geklärt werden. Trotz intensiver Forschung gibt es noch keine wirksame kausale Therapie. Einige Substanzen (z.B. Ascorbinsäure, Onapriston, Neurotrophin-3 oder PXT3003) zeigten in Tiermodellen vielversprechende Ergebnisse. Teilweise fand bereits eine Erprobung der Substanz in humanen Studien statt. Leider erreichte bisher keine der untersuchten Substanzen ausreichend gute Ergebnisse bei einer vertretbaren klinischen Sicherheit, um eine Zulassung für die Behandlung von CMT1A zu erlangen. Eine Studie mit Ascorbinsäure, welche im Tiermodell zur Verbesserung der Myelinisierung führen konnte, zeigte bei klinischen Studien am Menschen keine signifikanten Veränderungen des klinischen Krankheitsverlaufs. Einige weitere Substanzen, welche bereits in Voruntersuchungen gute Resultate zeigten, befinden sich zurzeit in klinischer Erprobung bei CMT1A Patienten. Es könnte postuliert werden, dass eine fehlende Signifikanz in klinischen Studien auch durch die Schwierigkeiten bei der Zusammenstellung einer geeigneten Patientenkohorte, begründet liegt. Einerseits steht auf Grund der geringen Prävalenz der Neuropathie jedem Zentrum nur ein kleines Patientenkollektiv zur Verfügung. Andererseits besteht durch die beschriebene Variabilität der Erkrankung eine weitere Herausforderung darin, homogene und vergleichbare Kohorten zu bilden. Hinzu kommt, dass der bislang in der klinischen Routine verwendete CMTNS, in der Auswertung von durchgeführten Studien teilweise eine geringe Sensitivität zeigte und die einzelnen Parameter Ceiling Effekte im oberen und unteren Bereich der Skala aufwiesen. All diese Parameter einzeln und in Kombination ergeben erschwerte Rahmen- bedingungen für eine erfolgreiche Erforschung von wirksamen Therapien für die CMT1A. Wie auch beim Menschen zeigte sich auch bei dem am häufigsten verwendeten Tiermodell der CMT Ratte (Sereda et al., 1996) eine Variabilität der Krankheitsausprägung und des Manifestationszeitpunktes. Bei anderen Erkrankungen werden bereits erfolgreich Biomarker zur genauere Beurteilung der Erkrankungsschwere eingesetzt. Für CMT1A existieren bisher keine derartigen Biomarker in der klinischen Routine. Daher wurden zur Identifikation in einer ersten Studie Hautbiopsien von CMT1A Ratten untersucht. Mittels mRNA Genexpressions- analysen konnten hierbei sechs potenzielle Biomarker gefunden werden, welche sich auch in einer kleinen Kohorte von humanen CMT1A Patienten/innen für die Eignung als diagnostisches Mittel bestätigen ließen (Fledrich et al., 2012). In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde eine weitere Validierung der potenziellen Biomarker zur Diagnostik der Krankheitsschwere durchgeführt. Zusätzlich wurden weitere Marker analysiert, die Hinweise auf den Verlauf der Progression liefern können. Die Validierung erfolgte in einem ersten Schritt an einer paneuropäischen und amerikanischen Kohorte von insgesamt 266 genetisch gesicherten, klinisch gut charakterisierten Patienten mit CMT1A. Für die mRNA Expressionsanalyse wurden Gene analysiert, welche in einer, dieser Dissertation vorangegangenen Untersuchung bei CMT1A Patienten und im Tiermodell eine signifikant veränderte Expressionen aufwiesen (ANPEP, BGN, CDA, CTSA, CRISP3, ENPP1, FN1, FN3KRP, GRIA1, GSTT1, GSTT2, GSTA4, MUCL1, PPARG, SPRR1A und NRG1-I). Den für diese Studie ausgewählten Patienten wurde eine Hautbiopsie an der Fingerkuppe entnommen, mRNA extrahiert, aufbereitet und mithilfe quantitativer Realtime- PCR analysiert. Die Ergebnisse der Expressionsanalysen wurden mittels stabiler Housekeeping Gene und Kallibratoren normalisiert und bezüglich der klinischen Parameter wie Alter, BMI, Geschlecht und untersuchendes Zentrum kontrolliert ausgewertet. Die Expressionsergebnisse wurde mit den aktuell verwendeten klinischen Scores als Marker für die Krankheitsschwere korreliert. Dabei wurden sowohl der ursprüngliche Neuropathie Score für CMT, seine Erweiterungen und Subscores sowie weitere klinische Parameter, wie beispielweise der 9HPT oder der T10MW verwendet. In vorherigen Untersuchungen hatten sich variierende Sensitivitäten der einzelnen Parameter der Scores gezeigt. Daher wurden die Untersuchungsparameter einzeln und in unterschiedlichen Kombination analysiert. Von den 16 untersuchten potenziellen Biomarker zeigten acht Gene (CDA, CTSA, GRIA1, ENPP1, ANPEP, FN3KRP, GSTT2 und PPARG) eine signifikante Korrelation mit der Erkrankungsschwere. Mit einer Sensitivität von 90% und einer Spezifität von 76,1% kann die Kombination dieser acht Gene die Patienten anhand ihres Schweregrades in mild, moderat und schwer betroffen einteilen. Um anschließend die Biomarker für eine Progressionsdetektion zu validieren, erfolgte in einer kleineren Patientenkohorte nach einem Zeitraum von zwei bis drei Jahren eine zweite klinische Untersuchung und erneute Biopsieentnahme. Die klinische Progression der Patienten/innen wurde auch hier durch einen erhöhten CMTNS Punktwert oder die Veränderung von sekundären Parametern ermittelt. Sechs Gene (CDA, CTSA, ENPP1, GSTT2, PPARG und NRG1-I) zeigten eine signifikante Veränderung Ihrer Expression über den untersuchten Zeitraum. Die Kombination dieser sechs Gene korreliert signifikant mit der Veränderung der Erkrankungsschwere, welche durch die Veränderung des CMTNS abgebildet wird. Es zeigte sich eine Sensitivität von 63,2% und eine Spezifität von 100%. Insgesamt konnte bestätigt werden, dass Genexpressionsanalysen aus Hautbiopsien und die daraus identifizierten Biomarker für die Bestimmung der Krankheitsschwere geeignet sind. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass die kutane Expression von individuellen Genen über den definierten Zeitraum eine signifikante Veränderung aufweist, welche mit dem Verlauf der Erkrankung korreliert und damit ebenfalls einen geeigneten Marker für die Progression der Erkrankung bilden kann. Die fünf Gene (CDA, CTSA, ENPP1, GSTT2, PPARG), die sowohl bei der Erkrankungsschwere- als auch bei der Progressionsbeurteilung identifiziert werden konnten, stellen damit ein aussichtsreiches Set von Biomarkern dar, welche im Verlauf im klinischen Alltag und in Studien weiter validiert werden sollten. In Zukunft kann die Implementierung geeigneter Biomarker in klinische Studien entscheidend dazu beitragen, die Entwicklung von erfolgreichen Therapien zu ermöglichen und weiter voranzutreiben.