Rheumatoid arthritis (RA) is caused by aberrant attack of the joints by native inflammatory system. This can lead to joint destruction and pain that can be debilitating. Increased angiogenesis and innervation by nociceptive afferent fibers are characteristic features of RA joints, which in addition to the elevated levels of a wide variety of inflammatory mediators, are thought to play an important role in the pathogenesis of chronic inflammatory pain associated with RA. Interestingly, a recent report indicates that C–type natriuretic peptide (CNP) is increased in the blood serum of RA patients. Natriuretic peptides (NPs) control natriuresis and normalize changes in blood pressure. Many biological effects of NPs are mediated by guanylate cyclase (GC)–coupled NP receptors, NPR–A and NPR–B, whereas the third NP receptor, NPR–C, lacks the GC kinase domain and acts as the NP clearance receptor. In addition, NPR–C can couple to specific Gái–βã–mediated intracellular signaling cascades in numerous cell types. Recent studies suggest that NPs are also involved in the regulation of pain sensitivity, although the underlying mechanisms remain largely unknown. In Aim 1, I show that CNP acutely sensitized the excitation of mouse dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons that is dependent on the transient receptor potential vanilloid–1 (TRPV1). CNP potentiated capsaicin– and proton–activated TRPV1 currents in cultured mouse DRG neurons and increased neuronal firing frequency, an effect that was absent in DRG neurons from TRPV1−/−mice. Further, CNP injection into mouse hind paw led to the development of thermal hyperalgesia, which was absent in TRPV1−/−mice. In Aim 2, I dissected the signaling mechanism underlying TRPV1 sensitization by CNP. My results show that all 3 functional NPRs are expressed in mouse DRG neurons; however NPR–A/B–cGMP signaling is not involved in CNP–mediated sensitization of TRPV1. Interestingly, I observed that sensitization of TRPV1 by CNP is dependent on protein kinase C (PKC) activity. Furthermore, I found that NPR–C is co–expressed in TRPV1–expressing mouse DRG neurons and can be co–immunoprecipitated with Gαi, but not with Gαq/11 or Gαs subunits. CNP treatment induced translocation of PKCå to the plasma membrane of these neurons, which was attenuated by pertussis toxin pre–treatment. Accordingly, CNP–induced sensitization of TRPV1 was attenuated by pre–treatment of DRG neurons with the specific inhibitors of Gβã, phospholipase–Cβ (PLCβ) or PKC, but not of protein kinase A (PKA), and by mutations at two PKC phosphorylation sites, S502 and S800, in the TRPV1 protein. Furthermore, the development of thermal hyperalgesia in CNP–injected hindpaw was attenuated by administration of specific inhibitors of Gβã or PKC. Thus, my work identifies the Gβã–PLCâ–PKC–dependent potentiation of TRPV1 as a novel signaling cascade recruited by CNP in mouse DRG neurons that can lead to enhanced nociceptor excitability and thermal hypersensitivity. Such signaling cascade could presumably constitute one of the mechanisms underlying chronic inflammatory joint pain associated with RA.

Worldwide research devotes significant effort to identify new, targetable molecular mechanisms in the field of angiogenesis, since therapeutic modulation of angiogenesis can critically alter the progression of a number of diseases. Stimulation of angiogenesis is desirable in situations characterized by tissue-damaging ischemia where blood supply is severely reduced, such as lower limb diabetic arteriopathy or following myocardial infarct. In contradistinction, stemming excessive or ectopic angiogenesis can be beneficial in situations such as solid tumor growth or in neovascular age-related macular degeneration. It has been previously shown that Hydrogen Sulfide (H2S), a new vasoactive gasotransmitter, can initiate angiogenic responses which depend on the activation of ATP-sensitive potassium channels (KATP). Intriguingly, C-type Natriuretic Peptide (CNP), which is also known to activate KATP, has been reported to promote endothelial cell growth; however, its angiogenic properties have not been explored at any depth. This pattern prompted us to investigate whether direct KATP activation induces angiogenic responses and whether endothelial responses to CNP or Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) indeed require KATP activation. We undertook a dual-pronged approach, based on both in vivo and in vitro experimental approaches. In vivo, chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) angiogenesis was similarly enhanced by the direct KATP channel activator SG-209 and by the polypeptides CNP or VEGF. Two KATP inhibitors, Glibenclamide and 5-Hydroxydecanoate (5-HD), abrogated both basal and CNP-induced CAM angiogenesis. In vitro, direct activators of KATP such as Nicorandil and SG- 209 and receptor-acting agonists such as VEGF and CNP, increased proliferation and migration in the mouse brain endothelial cell line bEnd.3. In addition, VEGF and CNP induced comparable capillary tube-like formation by Human Umbilical Vein Endothelial cells (HUVECs) in low growth factor Matrigel. All these in vitro pro-angiogenic endothelial responses were effectively abrogated by Glibenclamide or by 5-HD. Transfection of HUVECs with a siRNA specifically targeting the inwardly rectifying potassium channel (Kir) 6.1 subunit decreased the expression of this subunit at both the mRNA and the protein level. The resulting knock-down of the Kir6.1 KATP subunit impaired HUVEC migration through transwells in vitro and substantially decreased tubular network formation in Matrigel in response to either the direct KATP activator SG-209 or the receptor-operating KATP activator CNP. Furthermore, the bEnd.3 endothelial cell proliferation and migration responses to SG-209 required mobilization of the “classic” endothelial pro-angiogenesis kinases Erk1/2, p38 and Akt, since the responses to SG-209 were all abolished by each of the respective kinase inhibitors. This work allows us to firmly conclude that: a) direct pharmacological modulation of KATP channels affects angiogenic responses in vitro and in vivo, b) CNP is a bona fide angiogenic factor, as potent and efficient to mobilize endothelial cells as VEGF, c) the angiogenic effects of CNP and VEGF depend on the activation of endothelial KATP channels and specifically require the expression of the Kir6.1 pore-forming KATP subunit, and finally d) KATP activation may be a common molecular mechanism that underpins angiogenesis to a wide variety of endogenous vasoactive stimuli that includes H2S, VEGF and CNP. The therapeutic implications of this work are significant: Sulfonylurea-type KATP channel inhibitors, with questionable selectivity for pancreatic β-cells, are widely used drugs to treat type II diabetes, a disease characterized by arterial dysfunction and higher incidence of myocardial and lower limb ischemia. The outcome of cardiac ischemia in diabetic patients is worse if they have been treated with sulfonylureas, indicating some, until now unresolved, deleterious cardiovascular activity of this class of compounds. The present demonstration that endothelial KATP channel activation is a common pro-angiogenic mechanism, may in part explain this unfavorable outcome of sulfonylurea treatment in diabetics. Furthermore, it raises the need to design new molecules which, while inhibiting the pancreatic KATP channels, should spare the endothelial KATP channels and the ensuing angiogenesis, thus exhibiting increased therapeutic benefit. / Σε πολλά εργαστήρια, σε παγκόσμιο επίπεδο, συντελείται σημαντική ερευνητική προσπάθεια για την ταυτοποίηση νέων μοριακών μηχανισμών στο πεδίο της αγγειογένεσης ως στόχων ανάπτυξης φαρμάκων, καθώς η θεραπευτική ρύθμιση της αγγειογένεσης μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την εξέλιξη πολλών ασθενειών. Η διέγερση της αγγειογένεσης είναι επιθυμητή σε καταστάσεις ισχαιμίας όπου η παροχή αίματος μειώνεται σοβαρά, με αποτέλεσμα δυσλειτουργία ή νέκρωση ιστών, όπως πχ συμβαίνει κατά την εμφάνιση αρτηριοπάθειας στο διαβητικό κάτω άκρο ή μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου. Σε αντιδιαστολή, η αναστολή υπερβολικής ή έκτοπης αγγειογένεσης μπορεί να είναι επωφελής σε καταστάσεις όπως κατά την ανάπτυξη συμπαγούς όγκου ή σε νεοαγγειακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας σχετιζόμενη με την ηλικία. Έχει δειχθεί ότι το Υδρόθειο (H2S), ένας νέος αγγειοδραστικός αέριος διαβιβαστής (gasotransmitter), μπορεί να εκκινήσει αγγειογόνες αποκρίσεις που εξαρτώνται από την ενεργοποίηση των ευαίσθητων στο ΑΤΡ διαύλων καλίου (ΚΑTP). Μας κίνησε επίσης το ενδιαφέρον η αναφορά οτι το C-νατριουρητικό πεπτίδιο (CNP), που είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί τους ίδιους διαύλους καλίου, δύναται να προάγει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Ωστόσο, οι αγγειογενετικές ιδιότητες του CNP δεν έχουν διερευνηθεί σε βάθος. Αυτή η σύγκλιση μας ώθησε στη διερεύνηση του κατά πόσον η άμεση ενεργοποίηση των ΚΑTP διαύλων καλίου προκαλεί αγγειογενετική απόκριση και επίσης εάν η απόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων στο CNP ή στον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF) απαιτούν πράγματι ενεργοποίηση των διαύλων ΚΑTP. Η πειραματική προσέγγιση σχεδιάστηκε με βάση τόσο in vivo, όσο και in vitro μεθόδους. In vivo, η φυσιολογικά συντελλούμενη αγγειογένεση στην χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM) ενισχύθηκε απο τον άμεσο ενεργοποιητή των διαύλων ΚΑTP, το μόριο SG-209, καθώς και απο τα πολυπεπτίδια CNP και VEGF. Δύο αναστολείς των διαύλων ΚΑTP, η γλιβενκλαμίδη (glibenclamide) και το 5-υδροξυδεκανοϊκό οξύ (5-HD), ανέστειλαν τόσο την αγγειογένεση υποβάθρου (basal) της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης, όσο και την επαγόμενη απο το CNP αγγειογένεση το σύστημα αυτό. In vitro, άμεσοι ενεργοποιητές των διαύλων ΚΑTP όπως η νικορανδίλη (nicorandil) και το SG-209, καθώς και έμμεσοι ενεργοποιητές, μέσω αρχικής αγωνιστικής δράσης τους σε ειδικούς υποδοχείς, όπως ο VEGF και το CNP, αύξησαν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση εγκεφαλικών ενδοθηλιακών κυττάρων ποντικού της κυτταρικής σειράς bEnd.3. Επιπλέον, ο VEGF και το CNP επάγουν με παρόμοιο τρόπο το σχηματισμό τριχοειδών αγγείων απο ενδοθηλιακά κύτταρα απομονωμένα απο φλέβα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC) που δημιουργούνται σε Matrigel με χαμηλή περιεκτικότητα σε αυξητικούς παράγοντες. Όλες αυτές οι in vitro θετικές αγγειογενετικές ενδοθηλιακές αποκρίσεις αναστέλλονται παρουσία της γλιβενκλαμίδης και του 5-HD. Διαμόλυνση κυττάρων HUVECs με siRNA που στοχεύει ειδικά την υπομονάδα του δίαυλου καλίου Kir 6.1 μείωσε αποτελεσματικά την έκφραση αυτής της υπομονάδας τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Η μείωση στην έκφραση της υπομονάδας Kir6.1 των διαύλων καλίου προκάλεσε καταστολή της μετανάστευσης των κυττάρων HUVECs σε θαλάμους τύπου φρέατος (transwells) καθώς και σημαντική απομείωση στο σχηματισμό δικτύου τριχοειδών αγγείων σε Matrigel, όταν αυτές οι αποκρίσεις επάγονται είτε απο τον άμεσο ενεργοποιητή των διαύλων ΚΑTP, το μόριο SG-209, είτε απο τον έμμεσο ενεργοποιητή των διαύλων ΚΑTP (μέσω δράσης σε ειδικούς υποδοχείες), το πεπτίδιο CNP. Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων bEnd.3 που διεγείρονται ως απόκριση στο μόριο SG-209 απαιτούν κινητοποίηση των "κλασσικών" ενδοθηλιακών προ-αγγειογενετικών κινασών Erk1 / 2, p38 και Akt, δεδομένου ότι οι αποκρίσεις αυτές στον SG-209 καταστάλθηκαν απο κάθε ένα από τους αντίστοιχους αναστολείς των κινασών. Η παρούσα μελέτη μας επιτρέπει να συμπεράνουμε ότι: α) άμεση φαρμακολογική τροποποίηση της λειτουργίας των διαύλων ΚATP επηρεάζει σημαντικά τις αγγειογόνες αποκρίσεις τόσο in vitro όσο και in νίνο, β) το CNP είναι όντως ένας αγγειογενετικός παράγοντας, τόσο ισχυρός και αποτελεσματικός για την κινητοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων όσο και ο VEGF, γ) οι αγγειογόνες επιδράσεις του CNP και του VEGF εξαρτώνται από την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών διαύλων ΚΑTP και συγκεκριμένα απαιτούν την έκφραση της υπομονάδας Kir6.1 του διαύλου ΚΑTP, και τέλος δ) η ενεργοποίηση των διαύλων ΚΑTP φαίνεται οτι είναι ένας κοινός μοριακός μηχανισμός που υποστηρίζει την αγγειογένεση που διεγείρεται απο ένα ευρύ φάσμα ενδογενών αγγειοδραστικών χυμικών ερεθισμάτων, που περιλαμβάνουν το H2S, τον VEGF και το CNP. Οι επιπτώσεις της μελέτης αυτής στην θεραπευτική πράξη είναι πιθανώς σημαντικές: Οι τύπου σουλφονυλουρίας αναστολείς διαύλων των διαύλων ΚΑTP, που στοχεύουν μη-επαρκώς επιλεκτικά σε β-παγκρεατικά κύτταρα, χρησιμοποιούνται ευρέως ως φάρμακα για τη θεραπεία του διαβήτη τύπου II, μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από γενικευμένη δυσλειτουργία του αρτηριακού συστήματος, με συνέπεια υψηλή επίπτωση εμφράγματος του μυοκαρδίου και ισχαιμίας των κάτω άκρων. Η εξέλιξη ενός επεισοδίου μυοκαρδιακής ισχαιμίας σε διαβητικούς ασθενείς είναι χειρότερη εάν αυτοί ακολουθούσαν φαρμακολογική θεραπεία με σουλφονυλουρίες, υποδεικνύοντας κάποια, μέχρι τώρα σε σημαντικό βαθμό ανεξήγητη, επιβλαβή καρδιαγγειακή επίδραση αυτής της κατηγορίας ενώσεων. Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι η ενεργοποίηση ενδοθηλιακών διαύλων ΚΑTP είναι ένας κοινός προ- αγγειογενετικός μηχανισμός, που μπορεί εν μέρει να εξηγήσει αυτή την αρνητική έκβαση της πρότερης θεραπείας με σουλφονυλουρίες σε διαβητικούς. Επιπλέον, η έρευνα αυτή υποστηρίζει την ανάγκη για το σχεδιασμό νέων μορίων, τα οποία, ενώ θα αναστέλλουν τους διαύλους ΚΑTP στο πάγκρεας, δεν θα επηρεάζουν τους ενδοθηλιακούς διαύλους ΚΑTP και την εξαρτώμενη απο αυτούς αγγειογένεση, και έτσι θα παρουσιάζουν, βάσει των ανωτέρω, βελτιωμένη θεραπευτική δράση.

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Membrane filtration is growing in popularity as a viable technology for drinking water treatment to meet high demand and regulatory requirements. While many improvements have been made to the technology in the past decade, fouling continues to be one of the major operational challenges associated with membranes as it increases operating costs and reduces membrane life. Fouling control typically requires some form of pre-treatment. Biofiltration is a ???green??? technique that can minimize chemical usage and waste during water treatment and is a relatively new application as a pre-treatment for membranes. Proteins and polysaccharides (biopolymers) have been found to contribute most to fouling of low pressure polymeric membranes. Biofiltration has recently been demonstrated as an effective pre-treatment method for reducing biopolymer-associated fouling of this type of membrane (Hall?? et al., 2009). Given that the concentration and composition of organic matter in water is variable, there is an opportunity to explore the applicability of this robust technology for different water types. The primary goals of this research were to assess the effectiveness of direct biofiltration in minimizing ultrafiltration polymeric (PVDF) membrane fouling and at the same time evaluate the biofilter development, biofilter performance based on organics removal potential, and the effect of phosphorus addition (as a nutrient) to the biofilter influent. A pilot-scale treatment train was constructed at the Technology Demonstration Facility at the Walkerton Clean Water Centre. It included two parallel dual media (sand/anthracite) biological filters (preceded by roughing filters), followed by an ultrafiltration membrane unit. Experiments were conducted using water from the Saugeen River (Ontario, Canada) whose primary form of carbon is humic material. The biofilters were allowed to acclimate and biofilter performance and organics removal were tested over a fourteen month period, the last four months of which were dedicated to phosphorus enhancement experiments. The membrane fouling experiments started seven months following the start-up of the biofilters, after confirmation of steady-state operation. Biofilter water samples were analyzed for natural organic matter constituents along with other water quality parameters, and biomass quantity and activity in the media were measured. Biomass activity in the biofilter media and biopolymer removal through the biofilter indicated a rapid acclimation period, and also demonstrated similar performance of the parallel biofilters during start-up and steady-state operation. The biofilters achieved 21% removal of the biopolymers on average following acclimation, while reduction of the humic fractions was not observed. A linear relationship between biopolymer removal and its concentration in the river water was observed (first-order process). Membrane fouling experiments were conducted using both untreated and biofiltered river water. The fouling rates were computed by monitoring changes in transmembrane pressure over time. Analysis of the samples with liquid chromatography-organic carbon detection confirmed the significant contribution of biopolymers to irreversible and reversible membrane fouling rates even when only present at low concentrations. During the phosphorus enhancement phase, two different phosphorus doses were fed into the influent of one of the parallel biofilters in order to achieve a target C:N:P ratio of roughly 100:10:1. Although initially (first month of the dosing period) an increase in the removal of dissolved organic carbon and ultraviolet-absorbance was observed in the phosphorus-enhanced biofilter, this was not sustained. Phosphorus addition did not affect biopolymer removal or biomass quantity and activity in the biofilter, and the membrane fouling experiments during this period did not show any significant effect of phosphorus addition.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Submitted by Elesbão Santiago Neto (neto10uepb@cche.uepb.edu.br) on 2018-04-05T19:02:03Z No. of bitstreams: 1 PDF - Valter Angelo da Silva Junior.pdf: 36791695 bytes, checksum: 273ed695189827b6fb638d73013560f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T19:02:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Valter Angelo da Silva Junior.pdf: 36791695 bytes, checksum: 273ed695189827b6fb638d73013560f2 (MD5) Previous issue date: 2017-06-05 / CAPES / This thesis addresses the topic of geopolitical power calculations from the Chinese perspective. A unique aspect of China's assessment of this subject is the use of an analytical tool called "Comprehensive National Power" (CNP) which aims to measure the power of countries and to rank them according to the results found. This Chinese method evaluation, in most of its variations, emphasizes political power as the basis of state power, as well as considering that these units are responsible for the configuration and definition of the International System, not the opposite the other way around. By doing so, it visualizes international relations from a different parameter of Western mainstream approaches, which are mostly based on material power and the power of structure constraint. This dissertation deals with this matter by contextualizing the reader from the initial theoretical foundations on state power and power in the Chinese context, in the presentation of the various CNP versions in China, and, finally, using the analysis method of Yan Xuetong (2008;2011) to evaluate the evolution of China's CNP in the Hu Jintao period (2003-2013). In this way, the thesis presents the relations between China's action - in the established time interval - and the CNP, aiming to identify how the country uses this in the assessment of the International System. / Esta dissertação aborda o tema de cálculos de poder geopolítico a partir da perspectiva chinesa. Um aspecto singular da avaliação da China a respeito deste tema é a utilização de uma ferramenta analítica chamada “Comprehensive National Power” (CNP) que objetiva mensurar o poder dos países e hierarquizá-los a partir dos resultados encontrados. Este método de avaliação chinês, na maioria de suas variações, enfatiza o poder político como a base do poder de um Estado, além de considerar os que estas unidades são responsáveis pela configuração e definição do Sistema Internacional, não o movimento contrário. Desta maneira visualiza as relações internacionais a partir de um parâmetro diferente das abordagens ocidentais de mainstream, baseadas no poder material e no poder do constrangimento da estrutura. A presente dissertação aborda esta matéria contextualizando o leitor desde os fundamentos teóricos iniciais sobre poder e poder estatal no contexto chinês, na apresentação das diferentes versões do CNP da China, e, por fim, utilizando o método de análise de Yan Xuetong (2008; 2011) para avaliar a evolução do CNP da China no período Hu Jintao (2003-2013). Desse modo, o trabalho apresenta as relações entre a ação da China no interregno temporal estabelecido e o CNP, objetivando identificar de que maneira o país utiliza desta ferramenta em sua avaliação do Sistema Internacional.

Kardiale Arrhythmien können zum plötzlichen Herzstillstand (SCD) bei Herzinsuffizienz (HF)-Patienten führen und stellen in diesen Zusammenhang die häufigste Todesursache (> 50 %) dar. Aufgrund der schlechten Prognose werden weitere Therapiemöglichkeiten und Wirkstoffe benötigt. Die Phosphodiesterase 2 (PDE2A), ein cAMP und cGMP hydrolysierendes Enzym, ist im Endstadium bei HF-Patienten hochreguliert. Die PDE2A zeichnet sich durch die Möglichkeit aus, durch cGMP allosterisch aktiviert zu werden, welches die PDE2A Hydrolyseaktivität vor allem gegenüber cAMP stark steigert. In vorangegangenen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die herzspezifische PDE2A3-Überexpression in Mäusen eine starke anti-arrhythmische Wirkung vermittelt. Andere Studien wiederum zeigten, dass eine pharmakologische Hemmung der PDE2A dem hypertrophen Wachstum von Kardiomyozyten entgegenwirkt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Rolle der PDE2A für die Herzfunktion unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen mit Hilfe eines herzspezifischen PDE2A Knockout Modells zu untersuchen. Weiterhin war das Ziel den PDE2A-vermittelten cGMP/cAMP-Crosstalk-Mechanismus unter Verwendung des natriuretischen Peptids Typ C (CNP) in frisch isolierten murinen sowie humanen von induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten (hiPSC-KM) zu charakterisieren, um potentielle anti-arrhythmogene kardioprotektive Wirkungen der cGMP-vermittelten PDE2A Stimulation aufzudecken. Zunächst wurde ein neues Mausmodell mit Kardiomyozyten-spezifischer Deletion der PDE2A (PDE2A-KO) unter der Verwendung der „knockout-first“ Strategie generiert und mittels Echokardiographie charakterisiert. Das Fehlen der PDE2A Expression in Kardiomyozyten führte zu keinem veränderten kardialen Phänotyp. Unter chronischen Stressbedingungen nach Isoprenalininfusion (osmotische Minipumpe, 14 Tage) zeigte der PDE2A-KO eine verminderte Kontraktion und Auswurffraktion im Vergleich zu den behandelten Kontrolltieren. Herzfrequenz und Hypertrophie unterschieden sich dabei nicht voneinander. Um den Einfluss der CNP-vermittelten PDE2A Aktivierung auf pro-arrhythmische intrazelluläre Signale zu untersuchen, wurden spontane lokale Ca2+ Freisetzungen aus dem SR (Ca2+ Sparks, CaSp) sowie arrhythmische Ca2+-Wellen (CaW) sowie die Kontraktion von isolierten ventrikulären und atrialen Kardiomyozyten quantifiziert. Interessanterweise reduzierte CNP signifikant die Anzahl an arrhythmogenen CaSp und CaW nach akuter β-adrenerger Stimulation, ohne dabei die zelluläre Kontraktilität zu beeinflussen. Dieser anti-arrhythmogene Effekt wurde in den PDE2A-KO Tieren nicht beobachtet bzw. wurde durch die spezifische PDE2A-inhibition mittels Bay 60-7550 vollständig aufgehoben. Eine simultane Hemmung der cGMP-aktivierten Proteinkinase G hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der CaSp. Zusätzlich zeigten Versuche mit isolierten Kardiomyozyten von Mäusen mit herzspezifischen PDE2A3-Überexpression eine deutlich verminderte Anzahl an CaSp nach akuter β-adrenerger Stimulation. Dieser protektive Effekt wurde bei spezifischer PDE2-Hemmung verhindert. Während die alleinige Inhibition der PDE2 keinen Einfluss auf die CaSp Frequenz hatte, steigerte die Hemmung der PDE3 und PDE4 die Anzahl der CaSp in Kardiomyozyten von Kontrolltieren signifikant. Von besonderer Bedeutung ist, dass der CNP/cGMP/PDE2A-vermittelte anti-arrhythmogene Effekt auch in humanen ventrikulären sowie atrialen iPSC-KMs reproduziert werden konnte. Auf zellulärer Ebene wurden die stressinduzierten Ca2+-Lecks in humanen Zellen durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation unterdrückt. CNP vermittelte auf zellulärer Ebene starke anti-arrhythmogene Effekte über die Stimulation der PDE2A. Interessanterweise war die Expression von CNP in humanem ventrikulärem Gewebe von Patienten mit Herzinsuffizienz signifikant vermindert, während ANP und BNP hochreguliert waren und damit eine Desensitisierung ihrer Rezeptoren vermitteln könnten. In isolierten murinen Kardiomyozyten induzierte die CNP-vermittelte PDE2 Aktivierung eine signifikante Verminderung der intrazellulären cAMP Level. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit unterstreichen deutlich die klinische Relevanz der PDE2A als potenzielles therapeutisches Ziel bei ventrikulären Herzrhythmusstörungen sowie bei Vorhofflimmern nach akuter Stressstimulation oder bei HF weiter zu untersuchen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass PDE2A eine entscheidende Rolle in der Unterdrückung akuter stressinduzierter arrhythmogener Ca2+-Lecks spielt. Daher könnte die pharmakologisch gesteigerte PDE2A-Aktivität eine neue kardioprotektive Strategie zur Therapie von Arrhythmien bei HF darstellen.:Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis XII Tabellenverzeichnis XVI 1. Einleitung 1 1.1. Herzinsuffizienz und kardiale Arrhythmien 1 1.1.1. Ätiologie und Epidemiologie 1 1.1.2. Pathophysiologie und Klassifikation kardialer Arrhythmien bei HF 3 1.1.3. Zellulärer und molekularer Aspekt 7 1.1.4. Pharmakologische Therapie 9 1.2. Kardiale Signaltransduktion und sekundäre Botenstoffe 11 1.2.1. cAMP-Signalkaskade 12 1.2.2. cGMP-Signalkaskade 13 1.2.3. Natriuretische Peptide und deren klinische Relevanz 14 1.3. Kardiale Phosphodiesterasen 15 1.3.1. Kardiale PDEs mit dualer Substratspezifität 17 1.3.2. Kardiale cAMP und cGMP-spezifische PDEs 18 1.4. Phosphodiesterase 2A 19 1.4.1. Molekularer Aspekt 19 1.4.2. PDE2A-Expression und Aktivität 21 1.4.3. Perspektiven hinsichtlich der Rolle von PDE2A bei Herzerkrankungen 22 2. Zielsetzung 24 3. Material und Methoden 25 3.1. Material 25 3.2. Tiermodel 25 3.2.1. Tierhaltung 25 3.2.2. C57BL/6JRj Wildtyp-Mausmodel 25 3.2.3. Herzspezifische PDE2A-KO-Mausmodel (PDE2A_fl_αMHC_cre) 26 3.2.4. Genotypisierung 27 3.3. Zellkultur und Differenzierung der humanen induced pluripotent stem cell-derived Kardiomyzyten (iPSC-KM) 30 3.4. Gewinnung Patientengewebe 31 3.5. Echokardiografische Langzeitcharakterisierung 32 3.6. Implantierung osmotischer Minipumpen 34 3.7. Zellisolation adulter Mauskardiomyozyten 35 3.7.1. Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten 35 3.7.2. Isolierung atrialer Kardiomyozyten 36 3.8. Kontraktilitätsmessung 37 3.9. Calcium-Imaging 38 3.10. Calcium-Spark Detektion in Kardiomyozyten 41 3.10.1. Calcium-Spark Detektion in Mauskardiomyozyten 41 3.10.2. Calcium-Spark Detektion in humanen iPSC-KM 42 3.11. Proteinexpressionsanalyse aus Mausatrium 42 3.11.1. Proteinisolation und Konzentrationsbestimmung 42 3.11.2. Immunoblot 43 3.12. ELISA 45 3.13. qPCR 45 3.14. Statistische Auswertung 46 4. Ergebnisse 47 4.1. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die Herzfunktion 47 4.1.1. Echokardiografische Charakterisierung im Alter von 3 und 6 Monaten 47 4.1.2. Auswirkung einer chronischen Aktivierung der β-adrenergen Signalkaskade auf die Herzfunktion 51 4.2. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt in PDE2A-Knockout-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 56 4.2.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 56 4.2.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 60 4.2.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 63 4.3. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die Kontraktilität ventrikulärer Kardiomyozyten 65 4.3.1. Einfluss auf die zelluläre Kontraktion 65 4.3.2. Einfluss auf die zelluläre Kontraktionsgeschwindigkeit und Relaxationsgeschwindigkeit 67 4.3.3. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die zelluläre Kontraktion 69 4.4. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch natriuretische Peptide auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in ventrikulären Kardiomyozyten nach Stressinduktion 72 4.4.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 72 4.4.2. Veränderung der Spark-Morphologie nach CNP-Stimulation 73 4.4.3. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach ANP-Stimulation 75 4.4.4. Veränderung der Spark-Morphologie nach ANP 76 4.4.5. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz nach PKG-Inhibition 78 4.4.6. Veränderung der auf Spark-Morphologie nach PGK-Inhibition 80 4.5. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die intrazellulären cAMP-Konzentration in ventrikulären Kardiomyozyten 82 4.6. Auswirkung des Myokardinfarkts auf die murine Genexpression der PDE2A, des CNP und der natriuretischen Peptidrezeptoren 83 4.7. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt atrialer Kardiomyozyten nach Stressinduktion 84 4.7.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 84 4.7.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum 87 4.7.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 89 4.7.4. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf den Ca2+- Zyklus 90 4.8. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in atrialen Kardiomyozyten 95 4.8.1. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz 95 4.8.2. Veränderung der Spark-Morphologie 96 4.9. Auswirkung des PDE2A-KO auf die Expression Ca2+-regulierender Proteine 98 4.10. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in humanen iPSC-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 102 4.10.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 102 4.10.2. Auswirkung der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie 104 4.10.3. Bedeutung der PDE3 und PDE4 Inhibition auf Ca2+-Sparks in ventrikulären hiPSC-KM 106 4.10.4. Einfluss der PDE3 und PDE4 Inhibition auf die Ca2+-Spark-Morphologie 108 4.10.5. Bedeutung der CNP-Stimulation auf Ca2+-Sparks in atrialen hiPSC-KM nach Stressinduktion 109 4.10.6. Einfluss der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie nach Stressinduktion 111 4.11. Auswirkung dilatativer Kardiomyopathie auf die Genexpression natriuretischer Peptide und deren Rezeptoren 112 5. Diskussion 114 5.1. Der herzspezifische PDE2A-Knockout 115 5.1.1. Basale Herzfunktion konditionaler PDE2A-KO Mäuse 115 5.1.2. Cre-Expression beeinträchtigt die Überlebensfähigkeit der PDE2A-KO Mäuse 116 5.1.3. Der PDE2A-KO führt zur Reduktion der Herzfunktion bei chronischer Stressstimulation 117 5.2. Die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation reduziert arrhythmogene Ca2+-Freisetzungen ohne den intrazellulären Ca2+-Zyklus oder die zelluläre Kontraktion zu beeinflussen 119 5.2.1. PDE2A-Stimulation reduziert stressinduzierte arrhythmogene Ca2+-Wellen 119 5.2.2. Die zelluläre Kontraktilität wird durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation nicht beeinträchtigt 121 5.2.3. Natriuretische Peptid-vermittelte PDE2A-Stimualtion unterdrückt die stressinduzierten Ca2+-Lecks aus dem SR 122 5.3. CNP vermittelt einen anti-arrhythmogenen Effekt in humanen iPSC-Kardiomyozyten 124 5.4. Limitationen 125 5.4.1. Einschränkungen des Cre/loxP-Systems beim PDE2A-KO 125 5.4.2. Crosstalk-Mechanismen zyklischer Nukleotide 126 5.4.3. Patientenbasierte Variabilität 127 5.5. Ausblick 128 5.6. Die klinische Relevanz der PDE2A 129 6. Zusammenfassung 131 7. Summary 133 8. Referenzen 135 9. Anhang 162 9.1. Chemikalienliste 162 9.2. Antikörper- und Primerliste 164 9.3. Kits und Verbrauchsmaterialien 166 10. Danksagung 172 11. Erklärung 173 / Cardiac arrhythmias can lead to sudden cardiac death (SCD) in heart failure (HF) patients and are the most common cause of death (> 50%) in this context. Due to the poor prognosis, additional therapeutic options and agents are needed. Phosphodiesterase 2 (PDE2A), an enzyme that hydrolyzes cAMP and cGMP, is upregulated in end-stage HF patients. PDE2A can be allosterically activated by cGMP, which significantly increases its hydrolytic activity, particularly towards cAMP. Previous studies have shown that heart-specific overexpression of PDE2A3 in mice has a strong anti-arrhythmic effect. Conversely, other studies have shown that pharmacological inhibition of PDE2A counteracts the hypertrophic growth of cardiomyocytes. The aim of this study was to investigate the role of PDE2A in heart function under physiological and pathophysiological conditions using a heart-specific PDE2A knockout model. Furthermore, the goal was to elucidate the PDE2A-mediated cGMP/cAMP crosstalk mechanism using C-type natriuretic peptide (CNP) in freshly isolated murine cardiomyocytes and human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells (hiPSC-CMs) to uncover potential anti-arrhythmic cardioprotective effects of cGMP-mediated PDE2A stimulation. First, a new mouse model with cardiomyocyte-specific deletion of PDE2A (PDE2A-KO) was generated using the 'knockout-first' strategy and characterized via echocardiography. The absence of PDE2A expression in cardiomyocytes did not lead to an altered cardiac phenotype under physiological conditions. However, under chronic stress conditions following isoprenaline infusion (osmotic minipump, 14 days), PDE2A-KO mice showed reduced contraction and ejection fraction compared to treated control animals. Heart rate and hypertrophy did not differ between the groups. To investigate the influence of CNP-mediated PDE2A activation on pro-arrhythmic intracellular signals, spontaneous local Ca2+ releases from the sarcoplasmic reticulum (Ca2+ sparks, CaSp), arrhythmic Ca2+ waves (CaW), and contraction of isolated ventricular and atrial cardiomyocytes were quantified. Interestingly, CNP significantly reduced the number of arrhythmogenic CaSp and CaW following acute β-adrenergic stimulation without affecting cellular contractility. This anti-arrhythmic effect was not observed in PDE2A-KO animals and was completely abolished by specific PDE2A inhibition with Bay 60-7550. Simultaneous inhibition of cGMP-activated protein kinase G had no effect on the number of CaSp. Additionally, experiments with isolated cardiomyocytes from mice with heart-specific PDE2A3 overexpression showed a significantly reduced number of CaSp after acute β-adrenergic stimulation. This protective effect was prevented by specific PDE2A inhibition. While PDE2A inhibition alone had no effect on CaSp frequency, inhibition of PDE3 and PDE4 significantly increased CaSp frequency in cardiomyocytes from control animals. Notably, the CNP/cGMP/PDE2A-mediated anti-arrhythmic effect was also reproduced in human ventricular and atrial iPSC-CMs. At the cellular level, stress-induced Ca2+ leaks in human cells were suppressed by CNP-mediated PDE2A stimulation. CNP mediated strong anti-arrhythmic effects at the cellular level through PDE2A stimulation. Interestingly, CNP expression in human ventricular tissue from HF patients was significantly reduced, while ANP and BNP were upregulated, potentially causing receptor desensitization. In isolated murine cardiomyocytes, CNP-mediated PDE2A activation significantly reduced intracellular cAMP levels. The findings from this study clearly underscore the clinical relevance of PDE2A as a potential therapeutic target for ventricular cardiac arrhythmias and atrial fibrillation following acute stress stimulation or in HF. In summary, this study demonstrated that PDE2A plays a crucial role in suppressing acute stress-induced arrhythmogenic Ca2+ leaks. Therefore, pharmacologically enhancing PDE2A activity could represent a novel cardioprotective strategy for treating arrhythmias in HF.:Abkürzungsverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis XII Tabellenverzeichnis XVI 1. Einleitung 1 1.1. Herzinsuffizienz und kardiale Arrhythmien 1 1.1.1. Ätiologie und Epidemiologie 1 1.1.2. Pathophysiologie und Klassifikation kardialer Arrhythmien bei HF 3 1.1.3. Zellulärer und molekularer Aspekt 7 1.1.4. Pharmakologische Therapie 9 1.2. Kardiale Signaltransduktion und sekundäre Botenstoffe 11 1.2.1. cAMP-Signalkaskade 12 1.2.2. cGMP-Signalkaskade 13 1.2.3. Natriuretische Peptide und deren klinische Relevanz 14 1.3. Kardiale Phosphodiesterasen 15 1.3.1. Kardiale PDEs mit dualer Substratspezifität 17 1.3.2. Kardiale cAMP und cGMP-spezifische PDEs 18 1.4. Phosphodiesterase 2A 19 1.4.1. Molekularer Aspekt 19 1.4.2. PDE2A-Expression und Aktivität 21 1.4.3. Perspektiven hinsichtlich der Rolle von PDE2A bei Herzerkrankungen 22 2. Zielsetzung 24 3. Material und Methoden 25 3.1. Material 25 3.2. Tiermodel 25 3.2.1. Tierhaltung 25 3.2.2. C57BL/6JRj Wildtyp-Mausmodel 25 3.2.3. Herzspezifische PDE2A-KO-Mausmodel (PDE2A_fl_αMHC_cre) 26 3.2.4. Genotypisierung 27 3.3. Zellkultur und Differenzierung der humanen induced pluripotent stem cell-derived Kardiomyzyten (iPSC-KM) 30 3.4. Gewinnung Patientengewebe 31 3.5. Echokardiografische Langzeitcharakterisierung 32 3.6. Implantierung osmotischer Minipumpen 34 3.7. Zellisolation adulter Mauskardiomyozyten 35 3.7.1. Isolierung ventrikulärer Kardiomyozyten 35 3.7.2. Isolierung atrialer Kardiomyozyten 36 3.8. Kontraktilitätsmessung 37 3.9. Calcium-Imaging 38 3.10. Calcium-Spark Detektion in Kardiomyozyten 41 3.10.1. Calcium-Spark Detektion in Mauskardiomyozyten 41 3.10.2. Calcium-Spark Detektion in humanen iPSC-KM 42 3.11. Proteinexpressionsanalyse aus Mausatrium 42 3.11.1. Proteinisolation und Konzentrationsbestimmung 42 3.11.2. Immunoblot 43 3.12. ELISA 45 3.13. qPCR 45 3.14. Statistische Auswertung 46 4. Ergebnisse 47 4.1. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die Herzfunktion 47 4.1.1. Echokardiografische Charakterisierung im Alter von 3 und 6 Monaten 47 4.1.2. Auswirkung einer chronischen Aktivierung der β-adrenergen Signalkaskade auf die Herzfunktion 51 4.2. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt in PDE2A-Knockout-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 56 4.2.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 56 4.2.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 60 4.2.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 63 4.3. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die Kontraktilität ventrikulärer Kardiomyozyten 65 4.3.1. Einfluss auf die zelluläre Kontraktion 65 4.3.2. Einfluss auf die zelluläre Kontraktionsgeschwindigkeit und Relaxationsgeschwindigkeit 67 4.3.3. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf die zelluläre Kontraktion 69 4.4. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch natriuretische Peptide auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in ventrikulären Kardiomyozyten nach Stressinduktion 72 4.4.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 72 4.4.2. Veränderung der Spark-Morphologie nach CNP-Stimulation 73 4.4.3. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach ANP-Stimulation 75 4.4.4. Veränderung der Spark-Morphologie nach ANP 76 4.4.5. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz nach PKG-Inhibition 78 4.4.6. Veränderung der auf Spark-Morphologie nach PGK-Inhibition 80 4.5. Einfluss der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die intrazellulären cAMP-Konzentration in ventrikulären Kardiomyozyten 82 4.6. Auswirkung des Myokardinfarkts auf die murine Genexpression der PDE2A, des CNP und der natriuretischen Peptidrezeptoren 83 4.7. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf den intrazellulären Ca2+-Haushalt atrialer Kardiomyozyten nach Stressinduktion 84 4.7.1. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Zyklus 84 4.7.2. Auswirkung auf den intrazellulären Ca2+-Speicher, die fraktionelle und spontane Ca2+-Freisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum 87 4.7.3. Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Ca2+-Freisetzung und der Ca2+-Wiederaufnahme 89 4.7.4. Einfluss des PDE2A-Knockouts auf den Ca2+- Zyklus 90 4.8. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in atrialen Kardiomyozyten 95 4.8.1. Veränderung der Calcium-Spark-Frequenz 95 4.8.2. Veränderung der Spark-Morphologie 96 4.9. Auswirkung des PDE2A-KO auf die Expression Ca2+-regulierender Proteine 98 4.10. Bedeutung der cGMP-vermittelten PDE2A-Stimulation durch CNP auf die spontane Ca2+-Freisetzung (Ca2+-Sparks) in humanen iPSC-Kardiomyozyten nach Stressinduktion 102 4.10.1. Veränderung der Ca2+-Spark-Frequenz nach CNP-Stimulation 102 4.10.2. Auswirkung der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie 104 4.10.3. Bedeutung der PDE3 und PDE4 Inhibition auf Ca2+-Sparks in ventrikulären hiPSC-KM 106 4.10.4. Einfluss der PDE3 und PDE4 Inhibition auf die Ca2+-Spark-Morphologie 108 4.10.5. Bedeutung der CNP-Stimulation auf Ca2+-Sparks in atrialen hiPSC-KM nach Stressinduktion 109 4.10.6. Einfluss der CNP-Stimulation auf die Ca2+-Spark-Morphologie nach Stressinduktion 111 4.11. Auswirkung dilatativer Kardiomyopathie auf die Genexpression natriuretischer Peptide und deren Rezeptoren 112 5. Diskussion 114 5.1. Der herzspezifische PDE2A-Knockout 115 5.1.1. Basale Herzfunktion konditionaler PDE2A-KO Mäuse 115 5.1.2. Cre-Expression beeinträchtigt die Überlebensfähigkeit der PDE2A-KO Mäuse 116 5.1.3. Der PDE2A-KO führt zur Reduktion der Herzfunktion bei chronischer Stressstimulation 117 5.2. Die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation reduziert arrhythmogene Ca2+-Freisetzungen ohne den intrazellulären Ca2+-Zyklus oder die zelluläre Kontraktion zu beeinflussen 119 5.2.1. PDE2A-Stimulation reduziert stressinduzierte arrhythmogene Ca2+-Wellen 119 5.2.2. Die zelluläre Kontraktilität wird durch die CNP-vermittelte PDE2A-Stimulation nicht beeinträchtigt 121 5.2.3. Natriuretische Peptid-vermittelte PDE2A-Stimualtion unterdrückt die stressinduzierten Ca2+-Lecks aus dem SR 122 5.3. CNP vermittelt einen anti-arrhythmogenen Effekt in humanen iPSC-Kardiomyozyten 124 5.4. Limitationen 125 5.4.1. Einschränkungen des Cre/loxP-Systems beim PDE2A-KO 125 5.4.2. Crosstalk-Mechanismen zyklischer Nukleotide 126 5.4.3. Patientenbasierte Variabilität 127 5.5. Ausblick 128 5.6. Die klinische Relevanz der PDE2A 129 6. Zusammenfassung 131 7. Summary 133 8. Referenzen 135 9. Anhang 162 9.1. Chemikalienliste 162 9.2. Antikörper- und Primerliste 164 9.3. Kits und Verbrauchsmaterialien 166 10. Danksagung 172 11. Erklärung 173

Context. Resource allocation is an important issue in order to complete a task in the field of agent system. Several protocols are available for task distribution and for efficient resource allocation among agents. Efficient task distribution and resource allocation among agents are often play important roles to obtain high performance. However, the situation becomes more complicated when the resources are dependent on each other where multiple buyers and providers of resources negotiate in parallel. Objectives. In this paper, we proposed an agent based protocol for synchronizing and allocating dependent resources that involves parallel negotiation between multiple buyers and providers of resources. Methods. Literature survey has been conducted in the studied areas in order to position the work and gain more knowledge. Moreover, to validate the proposed protocol, a simulation study was performed. Results. The suggested protocol can handle dependent resources negotiation parallel and the result illustrates that. Moreover, the approach can avoid broadcasting of call for proposals to reduce the communication overhead, which usually occur in many other protocols. Conclusion. In the suggested protocol, we have presented a new idea of re-planning with other techniques like Information board and leveled commitment. In a simulation study, it was identified that this approach is able to deal with the dependent resources according to the simulation results.

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Methyl-CpG-binding protein 2 (MeCP2 is) is an epigenetic regulator that binds to methylated DNA. Initially identified as transcriptional repressor, MeCP2 also binds to different proteins functioning as gene activator. Importantly, MecCP2 gene mutations and changes in MeCP2 levels are associated to several forms of mental retardation and autism-related disorders; including Rett, a neurodevelopmental disorder affecting primarily girls. While brain MeCP2 was considered to be exclusively neuronal, this regulator is also present in glia. We found that oligodendrocytes, the myelinating cells of the central nervous system (CNS), express particularly high MeCP2 levels at a developmental stage that precedes their final maturation. Moreover, downregulation of MeCP2 levels by treatment of immature oligodendrocytes with small interference RNA (siRNA), reduced the expression of 14 kDa myelin basic protein (MBP) and MOG, two markers of mature oligodendrocytes. These observations raise the possibility that oligodendrocytes have a direct participation in Rett syndrome and other autism-related disorders.