Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Lippia alba (Mill.) N. E. Brown is a native medicinal plant of South America. Known popularly as false-melissa , its leaves and roots are used in the treatment of some illnesses, including some of infective etiology. The presence of essential oils, among other metabolites with recognized antimicrobial activity, can explain its medicinal use. This paper describes the chemical analyses and antimicrobial activity of the essential oils from Lippia alba at different seasons of the year, as well as the bio-guided fractionation, the isolation and the structure elucidation of its main constituents. Lippia alba was cultivated in São Luiz Gonzaga, RS, Brazil, and its leaves were collected in 2005 and 2006 in the middle period (January, April, July and October) of each season. A voucher specimen (SMDB n° 10.050) was deposited in the herbarium of the Department of Biology, UFSM. The extraction of the essential oils was performed by the hydrodistillation method of fresh leaves. The oils were analyzed by GC-MS and their constituents were identified by the comparison of Kovat s retention indexes and mass spectra with literature data. The essential oil was fractionated by CC over silica gel for the isolation of germacrene D-4-ol and linalool, both identified by GC-MS, 13C and 1H NMR, DEPT-135, COSY and HETCOR. The antimicrobial activity of the essential oils, fractions and isolated compounds were determined by the broth microdilution method. The essential oil showed qualitative and semi-quantitative variability in relation to the seasons of the year. The yield ranged from 0.3 to 0.6%, being lower in winter and higher in summer, autumn and spring. The essential oil was composed of monoterpenoids (69 - 84%) and sesquiterpenoids (6 - 24%), being most of them oxygenated and hidrocarbonated, respectively. Moreover, the major compounds (> 15%) were not the same between the years of the analysis. The seasonal variability influenced the antimicrobial activity of the essential oils. With the exception of P. aeruginosa, all other microorganisms were susceptible to the essential oil. The most sensitive ones were S. cerevisiae (MIC and MFC of 800 μg/mL for the oil obtained in January), S. aureus (MIC of 800 μg/mL and MBC of 1600 μg/mL for the oils obtained in April and July) and K. pneumoniae (MIC and MFC of 1600 μg/mL for the oil extracted in July). In view of the antimicrobial activity, winter and summer are the best seasons for the collection and extraction of essential oils. The bio-guided fractionation of the essential oil showed that the fractions containing greater amounts of oxygenates are more active than those containing hydrocarbon compounds. Germacrene D-4-ol presented activity against S. cerevisiae (MIC and MFC of 200 μg/mL), P. zopfii (MIC and MFC of 400 μg/mL) and S. aureus (MIC and MBC of 800 μg/mL), while linalool was inactive against the tested microorganisms up to 3200 mg/mL. / Lippia alba (Mill.) N. E. Brown é uma planta medicinal nativa da América do Sul. Conhecida popularmente como falsa-melissa , suas folhas e raízes são empregadas no tratamento de várias doenças, incluindo algumas de etiologia infecciosa. A presença dos óleos essenciais, entre outros metabólitos com reconhecida atividade antimicrobiana, pode explicar o seu uso como medicinal. Este trabalho descreve a analise química e a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de Lippia alba nas diferentes estações do ano, bem como o fracionamento bio-guiado, o isolamento e a elucidação estrutural dos seus principais constituintes. Lippia alba foi cultivada no município de São Luiz Gonzaga, RS, Brasil, e suas partes aéreas foram coletadas no período médio de cada estação (janeiro, abril, julho e outubro) durante o ano de 2005 e 2006. Material testemunha (SMDB n° 10.050) encontra-se depositado no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM. Para a realização dos experimentos, foram utilizadas as folhas frescas. A extração dos óleos essenciais foi realizada pelo método da hidrodestilação. Os óleos foram analisados por CG-EM e seus constituintes identificados pela comparação dos índices de retenção de Kovats e espectros de massas com dados da literatura. O óleo essencial também foi fracionado por CC sobre gel de sílica até o isolamento do germacreno D-4- ol e do linalol, ambos identificados por CG-EM, RMN 13C e 1H, DEPT-135, COSY e HETCOR. A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais, das frações e das substâncias isoladas foi determinada pelo método de microdiluição em caldo. O óleo essencial apresentou variabilidade qualitativa e semiquantitativa em relação às estações do ano. O rendimento variou na ordem de 0,3 a 0,6%, sendo menor no inverno, e maior no verão, outono e primavera. O óleo essencial foi composto de monoterpenóides (69 - 84%) e sesquiterpenóides (6 24%), sendo a maioria deles oxigenados e hidrocarbonados, respectivamente. Os compostos majoritários (>15%) não foram os mesmos entre os diferentes anos de análise. A variabilidade sazonal, por sua vez, influenciou a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. Com exceção de P. aeruginosa, todos os outros microorganismos foram sensíveis ao óleo essencial de pelo menos uma estação. Os microorganismos com menor CIM foram S. cerevisiae (CIM e CFM de 800 μg/mL para o óleo obtido em janeiro), S. aureus (CIM de 800 μg/mL e CBM 1600 μg/mL para os óleos obtidos em abril e julho) e K. pneumoniae (CIM e CBM de 1600 μg/mL para o óleo extraído em julho). Tendo em vista a atividade antimicrobiana, o inverno e o verão constituem as melhores épocas para a coleta e extração dos óleos essenciais. O fracionamento bio-guiado do óleo essencial mostrou que frações contendo maiores quantidades de compostos oxigenados são mais ativas do que aquelas contendo compostos hidrocarbonados. Germacreno D-4-ol apresentou atividade contra S. cerevisiae (CIM e CFM de 200 μg/mL), P. zopfii (CIM e CFM de 400 μg/mL) e S. aureus (CIM e CBM de 800 μg/mL), ao passo que linalol foi inativo contra os microorganismos testados até a concentração de 3200 mg/mL.

Itraconazole is a triazole antifungical agent with a broad spectrum of activity belonging to the class of azole, indicated in the treatment of different types of mycotic infections systemic and local. Its mechanism of action is based on the ability to inhibition of synthesis of ergosterol which is a component of vital importance to the cell membrane of the fungi. This drug has only official methodology for raw material, described in British and European Pharmacopeia. In this paper, following the main guidelines for validation, were developed and validated quantitative analytical methods that can be applied both for the raw materials as the finished product containing itraconazole capsules through a high performance liquid chromatography (HPLC) with detection in the ultraviolet (254 nm, C8 reversed-phase column, mobile phase acetonitrile : water (65:35), the temperature of 25 °C) and microbiological assay by agar diffusion, with planning 3x3, employing Candida Albicans ATCC 10231 as microorganism testing in the culture medium antibiotic N° 19 in the region of the ultraviolet spectrophotometry (256 nm, with final solutions in 0.1 mol l-1 hydrochloric acid). All methods showed appropriate linearity, precision, accuracy, robustness and specificity. / O itraconazol é um antifúngico triazólico de amplo espectro de ação pertencente à classe dos azóis, indicado no tratamento de diferentes tipos de infecções micóticas sistêmicas e superficiais. Seu mecanismo de ação baseia-se na capacidade de inibição da síntese do ergosterol que é um componente de vital importância para a membrana das células dos fungos. Este fármaco possui metodologia descrita, somente, para matéria-prima, que se encontram oficializadas nas Farmacopéias Britânica e Européia. Neste trabalho foram desenvolvidos e validados, em conformidade com guias nacionais e internacionais, métodos analíticos quantitativos que podem ser empregados tanto para matéria-prima quanto para forma farmacêutica de cápsulas contendo itraconazol. Utilizaram-se as metodologias: cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) com detecção na região do ultravioleta (UV) em 254 nm, coluna de fase reversa C8, fase móvel acetonitrila : água (65:35), na temperatura de 25 °C; Ensaio microbiológico por difusão em ágar com planejamento 3x3, empregando Cândida Albicans ATCC 10231 como microrganismo teste em meio de cultura antibiótico n°19 e Espectrofotometria na região do ultravioleta, no comprimento de onda de 256 nm , com soluções finais em ácido clorídrico 0,1 mol.l-1 . Todos os métodos apresentaram linearidade, precisão, exatidão, robustez e especificidade adequados.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Haloperidol and fluphenazine are typical neuroleptics widely used in the treatment of mental illness, whose chronic use is associated with adverse effects that affect the motor function and memory, among others. The motor disturbances can be moderate, and include parkinsonism, akathisia, dystonia, but also a more severe syndrome, known as tardive dyskinesia (TD). Studies have shown that essential polyunsaturated fatty acids (EPUFAs) may affect physiological functions involved in movement and memory disorders through of the membrane phospholipid composition of neuronal cells. This study investigated the effects of supplementation of EPUFA (omega-3) on orofacial dyskinesia and memory dysfunction induced by haloperidol and fluphenazine, designated as experiment 1 and 2, respectively. In both experiments, male Wistar rats received in place of drinking water, a suspension with capsules of fish oil (FO), whose composition was determined by gas chromatography (EPA-20%, DHA- 6%, linolenic acid- 0, 4%), or vehicle (C). After 8 weeks of treatment, half the animals of each experimental group received a weekly administration of neuroleptic (12mg/kg/mL-im) (H-haloperidol or F-fluphenazine in experiments 1 and 2, respectively) or vehicle for 4 weeks. The intake of omega-3 ad libitum in the drinking water was maintained during this time. The animals were observed weekly for the quantification of orofacial dyskinesia (OD), (vacuous chewing movements frequency- VCM) in 7th, 14th, 21st and 28th days after the first dose of neuroleptic/vehicle. Immediately after each orofacial observation, the rats treated with neuroleptic (H and FO+H, experiment 1, F and FO+F, experiment 2) were submitted to catalepsy-time quantifications. In the last week of treatment, the rats of both experiments were previously trained for 4 consecutive days and submitted to memory test in water-maze task. On the 8th day after the last dose of neuroleptic/vehicle, the rats were sacrificed by exsanguinations (by cardiac puncture), with blood collection and removal of brain tissue (hippocampus and substantia nigra) for determination of lipid peroxidation. Data of OD (VCMs) and catalepsy time were analyzed by three-way and one way ANOVA with repeated measure, respectively, followed by Duncan s test (VCMs only) and paired T test; Data of water-maze task and assessments of lipid peroxidation (TBARs) were evaluated by two way ANOVA followed by Duncan s test. Statistical significances were considered for P <0.05 values for all assessments. The omega-3 decreased the motor disorders (VCMs and catalepsy time), the loss of memory and parameters of lipid peroxidation induced by neuroleptics, suggesting that these effects are related to the anti-apoptotic properties of EPUFAs. Our results emphasize the importance of including fatty acids n-3 from diet or its supplementation, which may prevent or reduce motor and memory disorders, often related to chronic treatment with typical neuroleptics, which until now has no effective treatment. / Neurolépticos típicos como haloperidol e flufenazina são amplamente empregados no tratamento das doenças mentais, cujo uso crônico está associado a efeitos adversos que afetam as funções motoras e de memória, entre outras. Os distúrbios motores podem ser mais brandos, e incluem tremores, acatisia, distonias, como também uma síndrome mais grave, a discinesia tardia (DT). Estudos têm demonstrado que os ácidos graxos poliinsaturados (AGPIs) podem afetar as funções fisiológicas envolvidas nos distúrbios do movimento e de memória, através da composição da membrana fosfolipídica das células neuronais. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da suplementação dos AGPIs n-3 (ômega-3) sobre a discinesia orofacial e a disfunção de memória induzidas por haloperidol e flufenazina, designados como experimento 1 e 2, respectivamente. Em ambos os experimentos, ratos Wistar machos receberam no lugar da água de beber, uma suspensão com cápsulas de óleo de peixe (OP), cuja composição foi determinada através de cromatografia gasosa (EPA-20%, DHA 6%, ácido linolênico 0,4%), ou veículo (C). Após 8 semanas de tratamento, metade dos animais de cada grupo experimental receberam uma administração semanal de neuroléptico (12 mg/kg/mL;im) (H-haloperidol e F-flufenazina, nos experimentos 1 e 2 respectivamente) ou veículo por 4 semanas. Durante este tratamento a ingestão ad libitum de ômega-3 na água de beber foi mantida. Os animais foram semanalmente observados para a quantificação da discinesia orofacial (DO) (incidência de movimentos de mascar no vazio - VCM) no 7º, 14º, 21º e 28º dias após a primeira administração de neuroléptico ou veículo. Logo após cada observação orofacial, todos os animais tratados com neurolépticos (grupos H e OP+H, experimento 1; F e OP+F, experimento 2) foram submetidos à quantificação do tempo de catalepsia. Na última semana de tratamento, de ambos os experimentos foram submetidos ao teste de memória em water-maze , após 4 dias de treinamento. No 8º dia após a última administração de neuroléptico/veículo, os ratos foram sacrificados por exsanguínação (punção cardíaca), com coleta de sangue e retirada de tecidos cerebrais (substância-negra e hipocampo) para determinação de parâmetros de peroxidação lipídica. Os dados da DO (VCMs) foram analisados por ANOVA de três vias com medida repetida, seguida por teste de Duncan e teste T pareado; O tempo de catalepsia foi avaliado por ANOVA de uma via com medida repetida, seguida de teste T pareado; Resultados obtidos em paradigma de labirinto aquático e avaliações de peroxidação lipídica (TBARS) foram avaliados por ANOVA de duas vias seguida de teste de Duncan. Foram considerados significativos os valores de P<0.05, para todas as avaliações. O ômega-3 diminuiu as desordens motoras (VCM e tempo de catalepsia), os prejuízos de memória e parâmetros de peroxidação lipídica induzidos pelos neurolépticos, sugerindo que esses efeitos estão relacionados com as propriedades anti-apoptóticas dos ácidos graxos essenciais. Nossos resultados ressaltam a importância da inclusão de ácidos graxos n-3s na dieta ou através da sua suplemantação, os quais podem prevenir ou atenuar distúrbios motores e de memória, freqüentemente relacionados ao tratamento crônico com neurolépticos típicos, que até o momento não dispõe de um tratamento eficaz.

The genus Senecio (Asteraceae) constitutes a group of cosmopolitan plants formed by more than 2000 species. Although most of these plants are considered to be toxic due to the presence of pyrrolizidine alkaloids, several of them are used in folk medicine. Their medicinal use can be attributed to other secondary metabolites, amongst them the terpenoids, with known antimicrobial activity. This work describes the isolation and identification of three compounds present in the CH2Cl2 extract of fresh aerial parts of Senecio platensis Arech., a species that showed the presence of peroxides in a phytochemical screening. Additionally, the the antibacterial activity of the isolated secondary metabolites has been evaluated. The aerial parts of Senecio platensis were collected in Capão Novo RS, Brasil and identified by Prof. Dr. Nelson Ivo Matzenbacher. Voucher specimen SMDB 9522 is preserved in the Herbarium of the Departamento de Botânica, UFSM. The fresh aerial parts of S. platensis (350.0 g) were extracted by maceration with CH2Cl2. The CH2Cl2 extract was evaporated to obtain an viscous residue (6.0 g), which approximates a yield of 1.71%. The crude extract was fractionated by flash chromatography over silica gel, using CH2Cl2 and CH2Cl2:EtOH mixtures of increasing polarity to yield 29 fractions. After two cycles of column chromatography (column: silica gel impregnated with AgNO3 (10%), eluents: hexane:acetone (95:5) and hexane:ethyl ether (99:1) 13.3 mg of PP1 were isolated from fraction 1 and later identified as germacrene D. After successive column chromatography over silica gel impregnated with AgNO3 (10%), eluting with hexane:acetone (9:1), hexane:ethyl acetate (95:5) and hexane:acetone (93:7), fraction 5 yielded 17.0 mg of AB1 (dehydrofukinone) and 30.6 mg of AB2 (spathulenol). The compounds were analyzed by GC-EI-MS, 1H and 13C NMR and were identified by comparison of their spectroscopic data with the literature. The fraction containing germacrene D, which is considered to be a precursor of several other sesquiterpene derivatives, was submitted to photooxidation process using Bengal Rose as sensitizer agent. By this reaction it was possible to confirm the formation of germacrene-D-1-hydroperoxide by its precursor. The antibacterial evaluation of the isolated compounds was accomplished by the broth microdilution method based on M7-A6/CLSI. In relation to Bacillus cereus ATCC 14579, dehydrofukinone showed MIC of 256 μg/mL and MBC of 4096 μg/mL. The spathulenol presented MIC and MBC of 64 μg/mL. Against the clinical isolate of B. cereus, dehydrofukinone showed MIC of 256 μg/mL and MBC > 8192 μg/mL while spathulenol showed MIC 32 μg/mL and MBC > 8192 μg/mL. Dehydrofukinone and spathulenol are inactive against Pseudomonas aeruginosa at the tested concentrations (until 8192 μg/mL). / O gênero Senecio (Asteraceae) constitui um grupo de plantas cosmopolitas, formado por mais de 2000 espécies. Embora grande número tenha toxicidade reconhecida devido à presença de alcalóides pirrolizidínicos, várias delas são empregadas na medicina popular. Seu uso medicinal pode ser atribuído à presença dos demais metabólitos secundários, entre eles os terpenóides, com atividade antibacteriana reconhecida. Este trabalho descreve o isolamento e a identificação de três constituintes presentes no extrato CH2Cl2 das partes aéreas de Senecio platensis Arech., espécie na qual foi detectada a presença de peróxidos em um screening fitoquímico. Adicionalmente, os metabólitos secundários isolados tiveram sua atividade antimicrobiana avaliada. As partes aéreas de S. platensis foram coletadas em abril de 2004, no município de Capão Novo RS, Brasil. A espécie foi localizada e identificada pelo Prof. Dr. Nelson Ivo Matzenbacher, do Programa de Pós-Graduação em Botânica da UFRGS. Material testemunha encontra-se depositado no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM sob o registro SMDB 9522. As partes aéreas frescas de S. platensis (350,0 g) foram extraídas por maceração em CH2Cl2., seguido de evaporação do solvente, resultando num resíduo pastoso (6,0 g), com rendimento de 1,71%. O extrato bruto foi fracionado por cromatografia em coluna flash sobre gel de sílica, usando CH2Cl2 e misturas de CH2Cl2: EtOH, em gradiente, sendo obtidas 29 frações. A partir da fração 1, após duas cromatografias em coluna com gel de sílica impregnado com AgNO3 (10%), eluídas com hexano:acetona (95:5) e hexano:éter etílico (99:1), foram obtidos 13,3 mg da substância codificada como PP1 e posteriormente identificada como germacreno D. A fração 5 da coluna flash também foi fracionada e, após sucessivas cromatografias em coluna sobre gel de sílica impregnado com AgNO3 (10%), eluídas com hexano:acetona (9:1), hexano:acetato de etila (95:5) e hexano:acetona (93:7), foram isolados 17,0 mg de AB1 (deidrofuquinona) e 30,6 mg de AB2 (espatulenol). Os compostos foram analisados por CG-EM, RMN 1H e RMN 13C e foram identificados pela comparação de seus dados espectroscópicos com os obtidos da literatura. A fração contendo o germacreno D, considerado precursor de vários outros derivados de esqueleto sesquiterpênico, foi submetida a uma reação de foto-oxidação utilizando o corante Rosa de Bengala como agente sensibilizante. Através desta reação foi possível confirmar a formação do germacreno-D-1-hidroperóxido a partir de seu precursor. A avaliação da atividade antibacteriana das substâncias isoladas foi realizada através do método de microdiluição em caldo, baseado nos documentos M7-A6/CLSI, antigo NCCLS. Em relação ao Bacillus cereus ATCC 14579, a deidrofuquinona exibiu uma CIM de 256 μg/mL e CBM de 4096 μg/mL, sendo que o espatulenol apresentou CIM e CBM de 64 μg/mL. Frente à cepa hospitalar de B. cereus, a deidrofuquinona exibiu uma CIM de 256 μg/mL e CBM > 8192 μg/mL, enquanto que o espatulenol apresentou uma CIM 32 μg/mL e CBM > 8192 μg/mL. Tanto a deidrofuquinona quanto o espatulenol não apresentaram atividade contra Pseudomonas aeruginosa até a concentração de 8192 μg/mL.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study evaluated the anesthetic efficacy of eugenol and essential oils (EOs) of Aloysia triphylla and Lippia alba on aquaculture, as well as their stress-reducing effect during transport of shrimp and fish. The effectiveness of eugenol on blocking noxious stimulis was also tested. Sub-adult and post-larvae of white shrimp (Litopenaeus vannamei), albine and grey silver catfish (Rhamdia quelen) and fat snook (Centropomus paralellus) were evaluated for anesthetic induction time and recovery during short and long exposure to the EOs and eugenol. Oxidative stress parameters were also evaluated in sub-adult shrimps. Both silver catfish strains and fat snook were transported in water containing EO of A. triphylla at different concentrations and the reduction of stress was evaluated. An experimental model was elaborated to test the analgesic activity of eugenol in zebrafish (Danio rerio). The concentrations of eugenol, EO of A. triphylla and L. alba recommended for anesthesia in shrimps were respectively 200, 300 and 750 μL L-1 for sub-adults and 175, 300 and 500 μL L-1 for post-larvae. The concentrations indicated for transport are between 20-50, 20-30 and 50 μL-1 for sub adults and for post-larvae only eugenol and EO of A. triphylla at 20 and 20-50 μL L-1. A better antioxidant capacity in the hemolymph was obtained with 30 μL L-1 EOs of A. triphylla and L. alba and 20 μL L-1 eugenol. Albine silver catfish juveniles induced and recovered form anesthesia in longer time than grey ones and 200 μL L-1 was considered the most suitable concentration for both strains. In the transport the OE de A. triphylla increased whole body cortisol but did not promote ion loss. The increase of the concentration of OE A. triphylla proportionately decreased and increased the time of induction and recovery from anesthesia in fat snooks. The concentration of 20 μL L-1 reduced blood glucose levels after 24 h and plasma cortisol and lactate levels after 6h. Eugenol itself did not presented analgesic activity, but after the injection of acetic acid in the anterior portion eugenol blocked the noxious reflex. / O trabalho objetivou avaliar a eficácia anestésica do eugenol e óleos essenciais (OEs) de Aloysia triphylla e Lippia alba em aquicultura, bem como a eficácia dos mesmos como redutores de estresse durante o transporte de camarões e peixes e verificar efeito bloqueador de estímulos nocivos do eugenol. Camarões (sub-adultos e pós larvas), ambas variedades de jundiá e robalos-peva foram transportados em água contendo óleo essencial de A. triphylla em diferentes concentrações e avaliada a redução do estresse. Para eugenol foi traçado modelo experimental de avaliação da atividade analgésica em peixe-zebra (Danio rerio). As concentrações de eugenol e OE de A. triphylla e L. alba recomendadas para anestesia em camarões foram, respectivamente de 200, 300,750 μL L-1 para sub-adultos e para pós-larvas 175, 300 e 500 μL L-1. Para transporte concentrações entre 20-50; 20-30 e 50 μL L-1 são apropriadas para sub-adultos e para pós-larvas somente eugenol e OE de A. triphylla 20 e 20-50 μL L-1. Uma melhor capacidade antioxidante na hemolinfa de camarões foi obtida com 30 μL L-1 OEs de A. triphylla e L. alba e 20 μL L-1 para eugenol. Juvenis albinos de jundiá induziram e recuperaram da anestesia em maior tempo que os cinzas e considerou-se 200 μL L-1 a concentração mais adequada. No transporte, embora o OE de A. triphylla tenha causado aumento de cortisol corporal em jundiás, houve redução da perda de íons. Em robalospeva o aumento da concentração do OE de A. triphylla proporcionalmente diminuiu e aumentou o tempo de indução e recuperação anestésica, respectivamente. A concentração de 20 μL L-1 reduziu os níveis de glicose sanguínea após 24h e de cortisol e lactato após 6h. O eugenol por si só não apresentou atividade analgésica, porém quando injetado ácido acético na porção anterior de zebrafish a resposta ao efeito nocivo foi bloqueada.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Erythropoietin is a hematopoietic hormone and the main physiological function is the induction of erythropoiesis. Recombinant DNA technology enabled cloning and expression of rhEPO gene to produce recombinant human erythropoietin (rhEPO). It is a sialoglycoprotein composed of 165 amino acids chain and about 40% of the molecule consists of carbohydrates, important for biological activity due to the presence of sialic acid residues at the termini of chains affecting its half-life. In the present study an alternative in vitro cell culture-based assay using TF-1 cell line was validated, to be used in conjunction with a reversed-phase liquid chromatography method with fluorescence detection (F-RP-LC) validated to determine the content of sialic acids. The values obtained for the sialic acids were higher than 126.83 ng/μg, and the biotechnology-derived products were subjected to the cell culture bioassay giving potencies 2.91% ± 0.85 lower related to the bioassay in normocythaemic mice, with significant correlation calculated by the Pearson coefficient (r = 0.9947). In parallel, it was determined the content/potency of the products by the validated reversed-phase and size-exclusion liquid chromatography methods that showed mean results 3.14% higher and 2.87% lower, respectively, compared to the in vitro bioassay. It was demonstrated that in vitro cell culture bioassay represent a valid alternative to the in vivo bioassay for the potency assessment of rhEPO, in the context of the reduction and/or replacement of animals. Likewise, correlation of the results obtained with the physicochemical methods, represents advances for the characterization of the biomolecule, which can be applied to the production steps and for the quality control, contributing to assure the batch-to-batch consistency of the bulk and the finished biological products of rhEPO. / A eritropoietina é um hormônio hematopoiético cuja principal função fisiológica é a indução da eritropoiese. Através da tecnologia do DNA recombinante foi possível a clonagem e expressão do gene para produzir a eritropoietina humana recombinante (rhEPO). É uma sialoglicoproteína composta por cadeia de 165 aminoácidos e, aproximadamente, 40% da molécula é constituída de carboidratos, importantes para a atividade biológica devido à presença de resíduos de ácidos siálicos nas extremidades das cadeias, que influenciam na meia-vida da biomolécula. No presente estudo foi validado ensaio alternativo baseado na cultura da linhagem de células TF-1 in vitro, e método por cromatografia líquida por fase reversa com detecção por fluorescência para determinação de ácidos siálicos, para avaliação em conjunto da potência de rhEPO. Determinaram-se teores de ácidos siálicos acima de 126,83 ng/μg e os produtos biotecnológicos foram submetidos ao bioensaio por cultura de células fornecendo potências 2,91% ± 0,85 menores em relação ao ensaio biológico em camundongos normocitêmicos, com correlação significativa calculada pelo coeficiente de correlação de Pearson (r = 0,9947). Paralelamente, determinou-se o teor/potência dos produtos pelas metodologias validadas por cromatografia líquida por fase reversa e por exclusão molecular, que forneceram média de resultados 3,14% maior e 2,87% menor, respectivamente, em relação ao bioensaio in vitro. Demonstrou-se que o bioensaio por cultura de células in vitro, constitui-se em alternativa ao ensaio biológico in vivo para a avaliação de potência de rhEPO, no contexto da redução e/ou substituição do uso de animais. Do mesmo modo, a correlação com os resultados fornecidos pelos métodos físico-químicos, representa avanços para caracterização da biomolécula, que podem ser aplicados nas etapas do processo de produção e para o controle de qualidade, contribuindo para garantir a consistência lote-a-lote da solução concentrada e dos produtos biológicos acabados de rhEPO.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Genus Senecio (Asteraceae) constitutes a group of cosmopolitan plants formed by more than 2000 species. Although these plants have toxicity recognized due to the presence of pyrrolizidine alkaloids, several of them are used in folk medicine. Their medicinal use can be attributed to other secondary metabolites such as flavonoids and terpenoids, being that terpenoids are compounds with recognized antimicrobial activity. In this work, the evaluation of the antimicrobial activity of the CH2Cl2 and EtOH extracts of S. heterotrichius DC., the isolation and characterization of one constituent from CH2Cl2 extract, the reaction of photooxidation of this compound in order to obtain a peroxide as well as the chemical analysis and evaluation of the antimicrobial activity of the essential oils from Senecio heterotrichius DC., S. ceratophylloides Griseb., S. oxyphyllus DC. and S. leptolobus DC. were studied. Extracts of the fresh aerial parts of S. heterotrichius were obtained by sequential maceration at room temperature in CH2Cl2 and EtOH, followed by evaporation under reduced pressure. The CH2Cl2 extract was firstly fractioned by CC over silica gel for the isolation of the sesquiterpene germacrene D and then identified by GC-MS, 1H and 13C NMR. This compound, considered a precursor of several other sesquiterpene derivatives, was submitted to photooxidation reaction using Bengal rose as sensitizer agent. The main formed peroxide was isolated from the reactional mixture by CC over silica gel, analyzed by GC-MS,1H and 13C NMR, and identified as being germacrene-D-1-hydroperoxide. The evaluation of the antimicrobial activity of the extracts of S. heterotrichius and of germacrene-D-1-hydroperoxide was accomplished through the broth microdilution method based on M27- A2/NCCLS documents for yeasts and M7-A4/NCCLS for aerobic bacteria. The extraction of the essential oils of the flowery aerial parts of Senecio heterotrichius, S. ceratophylloides, S. oxyphyllus and S. leptolobus was accomplished through hydrodestilation. The obtained essential oils were analyzed by GC-MS and their constituents were identified by the comparison of their Kovat s Indexes and their fragmentation patterns with literature data. These oils also had their antimicrobial activity evaluated following the previously mentioned methodology. The CH2Cl2 extract evidenced inhibitory activity against Candida krusei (MIC of 0.25 mg/mL) and Staphylococcus aureus (MIC of 2.5 mg/mL). The EtOH extract was inactive against the tested microorganisms. The germacrene-D-1-hydroperoxide presented inhibitory activity against S. cerevisiae (MIC of 2.5 mg/mL), and inhibited partially the growth of the algae Prototheca zoopfi at 5 and 2.5 mg/mL (inhibition of 80 and 50%, respectively). The essential oils of S. ceratophylloides and S. leptolobus exhibited inhibitory and bactericidal activity against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa (MIC and MBC between 6.6 and 3.3 mg/mL). The oil of S. oxyphyllus just inhibited partially the growth of these microorganisms (MIC 50% = 6.6 and 1.6 mg/mL, respectively). The oil of S. heterotrichius inhibited partially the growth of S. aureus with a MIC 50% = 3.3 mg/mL. These oils are constituted almost exclusively by mono and sesquiterpenoids, being germacrene D one of the main constituents present in all essential oils. / O gênero Senecio (Asteraceae) constitui um grupo de plantas cosmopolitas formado por mais de 2000 espécies. Embora estas tenham toxicidade reconhecida devido à presença de alcalóides pirrolizidínicos, várias delas são empregadas na medicina popular. Seu uso medicinal pode ser atribuído aos demais metabólitos secundários, entre eles flavonóides e terpenóides, sendo estes últimos, compostos com reconhecida atividade antimicrobiana. Neste estudo é relatada a avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos CH2Cl2 e EtOH de S. heterotrichius DC., o isolamento e caracterização de um constituinte do extrato CH2Cl2, a reação de fotooxidação deste constituinte obtendo-se um peróxido, bem como a análise química e avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de Senecio heterotrichius DC., S. ceratophylloides Griseb., S. oxyphyllus DC. e S. leptolobus DC. Os extratos das partes aéreas frescas de S. heterotrichius foram obtidos por maceração seqüencial à temperatura ambiente em CH2Cl2 e EtOH, seguido de evaporação sob pressão reduzida. O extrato CH2Cl2 foi fracionado por CC sobre gel de sílica até o isolamento do germacreno D, identificado por CG-EM, RMN 13C e 1H. Este composto, considerado um precursor de vários outros derivados de esqueleto sesquiterpênico, foi submetido a uma reação de foto-oxidação utilizando o corante Rosa de Bengala como agente sensibilizante; o principal peróxido formado foi isolado da mistura reacional por CC sobre gel de sílica, analisado por CG-EM, RMN 13C e 1H, e identificado como sendo o germacreno-D-1-hidroperóxido. A avaliação de atividade antimicrobiana dos extratos de S. heterotrichius e do germacreno-D-1-hidroperóxido foi realizada através do método de microdiluição em caldo, baseado nos documentos M27-A2/NCCLS para fungos leveduriformes e M7-A4/NCCLS para bactérias aeróbias. A extração dos óleos essenciais das partes aéreas floridas de Senecio heterotrichius, S. ceratophylloides, S. oxyphyllus e S. leptolobus foi realizada pela técnica de hidrodestilação. Os óleos essenciais obtidos foram analisados por CG-EM e seus constituintes foram identificados através da comparação de seus Índices de Kovat s e dos modelos de fragmentação com dados da literatura. Estes óleos também tiveram sua atividade antimicrobiana avaliada conforme metodologia citada anteriormente. O extrato CH2Cl2 evidenciou atividade inibitória frente Candida krusei (CIM de 0,25 mg/mL) e Staphylococcus aureus (CIM de 2,5 mg/mL). Já o extrato EtOH foi inativo frente os microrganismos testados. O germacreno-D-1-hidroperóxido apresentou atividade inibitória frente S. cerevisiae (CIM de 2,5 mg/mL) e inibiu parcialmente o crescimento da alga Prototheca zoopfi nas concentrações de 5 e 2,5 mg/mL (80 e 50 % de inibição, respectivamente). Os óleos essenciais de S. ceratophylloides e S. leptolobus apresentaram atividade inibitória e bactericida frente Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (CIM e CBM entre 6,6 e 3,3 mg/mL); o óleo de S. oxyphyllus apenas inibiu parcialmente o crescimento destes microrganismos (CIM 50% = 6,6 e 1,6 mg/mL, respectivamente); já o óleo de S. heterotrichius inibiu parcialmente o crescimento de S. aureus com uma CIM 50% = 3,3 mg/mL. Estes óleos são constituídos quase que exclusivamente de mono e sesquiterpenóides, sendo o germacreno D um dos constituintes majoritários presentes em todos os óleos essenciais.

Some CBC parameters have been implicated in individual susceptibility to death, both in heart disease and cardiac surgery populations. The cellular elements of blood are widely affected during cardiopulmonary bypass (CPB), technique used in cardiac surgery. A Complete Blood Count called Risk Score (CBC-RS) was calculated from the average of the deviations of the various elements of the CBC and has been previously validated and published. The CBC-RS showed as excellent predictor of death from all causes in large healthy and cardiovascular risk populations. Despite the effect of CPB on the blood cells, there is no acknowledgement from the prior assessment of this score in the surgical setting. The aim of this study was to evaluate the role of CBC-RS in the surgical risk prediction (mortality and morbidity) in patients undergoing cardiac surgery with CPB. For this, it was evaluated a historical cohort of 428 patients undergoing cardiac surgery with CPB. The individual CBC-RS was calculated using the collected blood count of patients preoperatively. Logistic regression and statistical C analyzed the predictive accuracy of this score. The primary endpoint was in-hospital mortality (all-cause) and secondary outcomes included the majors and bleeding complications. In our study, CBC-RS was a predictor of hospital mortality (OR = 1.28 for each score increments, 95% CI = 1123-1458, p <0.001) and secondary outcomes (OR = 1.208, 95% CI = 1.103 to 1.323, p <0.001). The areas under the curve (AUC) was 0.697 (p <0.001) and 0.636 (p <0.001) for both the primary and secondary endpoints, respectively. In multivariate analysis, after adjustment for other risk predictors (EuroSCORE II and CPB time), the CBC-RS remained significant and was the strongest predictor of mortality. Therefore, the CBC-RS proved to be an independent predictor of mortality and surgical complications during hospitalization. It may be a useful tool in risk assessment of patients undergoing cardiac surgery. / Dentre os diversos parâmetros fornecidos pelo hemograma, alguns já foram implicados em aumento da suscetibilidade individual à morte, tanto em pacientes com patologias cardíacas quanto os submetidos à cirurgia cardíaca. Os elementos celulares do sangue são amplamente afetados durante a circulação extracorpórea (CEC), técnica usada nas cirurgias cardíacas. Um escore calculado a partir dos desvios da média dos diversos componentes do hemograma foi previamente validado, publicado e chamado de Complete Blood Count Risk Score (CBC-RS). O CBC-RS se mostrou excelente preditor de morte por todas as causas em grandes populações saudáveis ou com fatores de risco cardiovascular. Apesar do efeito da CEC sobre as células sanguíneas, não se tem conhecimento da avaliação prévia deste escore no contexto cirúrgico. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o papel do CBC-RS na predição de risco cirúrgico (mortalidade e morbidade hospitalar) em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca com CEC. Para isso, uma coorte histórica de 428 pacientes submetidos à cirurgia cardíaca com CEC foi avaliada. O CBC-RS individual foi calculado utilizando o hemograma coletado dos pacientes no pré-operatório. A acurácia preditora deste escore foi analisada através regressão logística e estatística C. O desfecho primário avaliado foi a mortalidade hospitalar (por todas as causas) e os desfechos secundários incluíram as complicações maiores e sangramento. Em nosso estudo, o CBC-RS foi um preditor de mortalidade hospitalar (OR = 1,28 por cada aumento de pontuação do CBC-RS, IC 95% = 1.123 - 1.458, p <0,001) e dos desfechos secundários (OR = 1,208, IC 95% = 1,103 - 1,323, p <0,001). As áreas sob a curva (AUC) foram 0,697 (p <0,001) e 0,636 (p <0,001) para os desfechos primário e secundário, respectivamente. Na análise multivariada, após ajuste para preditores de risco pré-operatório (EuroSCORE II) e transoperatório (tempo de CEC) conhecidos, o CBC-RS permaneceu significativo e foi o preditor de mortalidade mais forte. Sendo assim, o CBC-RS se mostrou um preditor independente da mortalidade e complicações cirúrgicas no período hospitalar, podendo representar uma ferramenta útil na avaliação de risco de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that stimulates and regulates the proliferation and differentiation of neutrophils precursors cells of the bone marrow. The recombinant hormone (rhG-CSF) non-glycosylated, filgrastim, is used to treat the neutropenia induced by chemotherapy and bone marrow transplantation. The hydrophobic protein is a 175 aminoacids chain which contains an extra methionine at its N-terminus, and molecular weight of 18.8 kDa. In the present study, a capillary zone electrophoresis (CZE) method was developed and validated for the analysis of filgrastim in pharmaceuticals. The analyses were performed on a fused-silica capillary (75 μm i.d.; effective length, 72 cm) and background electrolyte consisted of 50 mM sodium tetraborate solution at pH 9.0. The capillary temperature was maintained at 15 °C and the applied voltage was 15 kV. The injection was performed using the hydrodynamic mode at 50 mbar for 6 s, with detection at 195 nm using a PDA detector. The electrophoretic separation was obtained with migration time of 21.8 and 15.8 minutes for the filgrastim and leuprorrelin acetate (internal standard), respectively, and with run time of 30 minutes. The procedure was validated by the parameters of specificity, linearity, precision, accuracy, robustness, limit of quantitation and limit of detection. The method was linear in the concentration range of 1 200 μg/mL (r2 = 0.9978) and the limit of quantitation (LOQ) was 1 μg/mL, with acceptable validation parameters. The method was applied for the analysis of pharmaceutical formulations, and the results were correlated to the reversed-phase HPLC method (RP-HPLC), size-exclusion HPLC method (SE-HPLC) and in vitro bioassay method. Therefore, the procedures represent valid alternatives which can improve the quality control, assuring the safety and therapeutic efficacy of the biological product. / O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma não-glicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenia induzida por quimioterapia e transplante de medula óssea. A proteína hidrofóbica é constituída por uma cadeia de 175 aminoácidos com uma metionina N-terminal, e massa molecular de 18,8 kDa. No presente estudo, foi desenvolvido e validado método por eletroforese capilar de zona (CZE) para determinação de filgrastima em formulações farmacêuticas. As análises foram realizadas em capilar de sílica fundida (comprimento efetivo de 72 cm e diâmetro interno de 75 μm) e solução eletrolítica composta de tetraborato de sódio 50 mM, pH 9,0. O capilar foi mantido a temperatura de 15 °C, e a tensão aplicada foi de 15 kV. O tempo de injeção foi de 6 s, com pressão de 50 mbar, e detecção por arranjo de diodos (DAD) a 195 nm. A separação eletroforética foi obtida com tempo de migração de 21,8 e 15,8 minutos para filgrastima e acetato de leuprorrelina (padrão interno), respectivamente, e tempo total de corrida de 30 minutos. O procedimento foi validado, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez, limite de quantificação e limite de detecção. Demonstrou-se linearidade na faixa de concentração de 1 200 μg/mL (r2 = 0,9978) e limite de quantificação (LQ) de 1 μg/mL, com os demais parâmetros de validação aceitáveis. O método foi aplicado para análise de formulações farmacêuticas, e os resultados foram correlacionados com os obtidos por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR) e por exclusão molecular (CLEM), e pelo bioensaio in vitro. Deste modo, os procedimentos pesquisados contribuem para o estabelecimento de alternativas que aprimoram o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.