Une des pathologies les plus répandues dans les pays développés est la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Elle se présente sous différentes formes dont la plus sévère est caractérisée par la présence de formation de néo-vascularisation provenant de la choroïde (CNV) migrant vers la rétine. Malheureusement, le diagnostic peut être seulement posé une fois que les symptômes apparaissent et que la vision est déjà affectée. Récemment, un vif engouement s’est porté sur les microARN (miARN), devenus des molécules d’intérêt pour le développement de biomarqueurs et représentant également un important potentiel thérapeutique. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’identification de miRNA dans un contexte de DMLA avec CNV permettrait de caractériser leurs rôles, tant au niveau de l’identification de biomarqueurs que de nouvelles cibles thérapeutiques. Le premier objectif de notre projet était d’identifier chez l’humain une signature de miARN spécifique à la forme humide de la DMLA. Pour ce faire, nous avons réalisé un criblage des miARN dans l’humeur vitrée de patients. Nous avons observé une augmentation des niveaux de miR-146a et une diminution de miR-106b et miR-152 spécifique à la DMLA. Cette signature fut confirmée dans le plasma de cette même cohorte de patients. D’autre part, l’exploration de bases de données AMD Gene Consortium (AGC) et Ingenuity Pathway Analysis (IPA) a démontré une relation entre les miARN détectés et des mutations génétiques associées à la forme DMLA avec CNV. En effet, nous avons identifié un SNP (single-nucleotide polymorphism ou SNP) (rs1063320) dans un site de liaison de miR-152 du gène HLA-G. Le second objectif était d’explorer la possibilité d’utiliser, du point de vue thérapeutique, un des miARN identifiés au 1er objectif. Nous avons, tout d’abord, quantifié l’expression de miR-146a, miR-106b et miR152 dans un des modèles classiques de la DMLA avec CNV chez la souris (brûlures par laser). Le candidat retenu fut miR-106b, puisqu’en plus d’être impliqué dans l’angiogenèse, son expression dans le modèle animal reflétait de plus près celle obtenue chez les patients. Suite à ces résultats, nous avons: exploré A) le mécanisme influençant la diminution de l’expression de miR-106b et B) l’effet de sa surexpression sur l’angiogenèse. D’abord en A), nous avons observé une activation de la voie de PERK dans notre modèle animal de CNV induite par laser menant à une diminution de l’expression de MCM7 et du polycistron miR-106b~25. . Ensuite en B), nous avons pu observer l’effet anti-angiogénique de miR-106b sur la migration des cellules endothéliales in vitro et sur la formation de NV in vivo. L’action anti-angiogénique de miR-106b pourrait ainsi avoir un potentiel thérapeutique important sur la formation de la CNV dans la DMLA. / Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness worldwide affecting individuals over the age of 60. The neovascular form (NV AMD) is characterized by choroidal neovascularization (CNV) and is responsible for the majority of central vision impairment. Unfortunately, diagnostic of AMD can only be done after symptoms have appeared and loss of visual field occurred. Recently, there is a growing interest in microRNAs (miRNAs) for their eventual use in the development of new biomarkers or new therapeutic strategies. Our hypothesis is that wet AMD is associated with specific signature of several miRNAs that can be used as biomarkers for the disease. These miRNAs can be harnessed for therapeutic interventions. Our first objective was to identify a specific signature of miRNAs for wet AMD by using non-biased microRNA arrays and individual TaqMan qPCRs. We profiled miRNAs in the vitreous humour and plasma of patients with NV AMD. We identified a disease-associated increase in miR-146a and a decrease in miR-106b and miR-152 in the vitreous humour, which was reproducible in plasma. Moreover, miR-146a/miR-106b ratios discriminated patients with NV AMD with an area under the Receiver Operating Characteristic curve (ROC AUC) of 0,977 in vitreous humour and 0,915 in plasma, suggesting potential for a blood-based diagnostic. Furthermore, using the AGC and IPA database, we mapped a NV AMD-associated single nucleotide polymorphism (SNP) (rs1063320) in a binding site for miR-152-3p in the HLA-G gene. Our second objective was to explore the therapeutic potential of a specific miRNA (identified in objective 1). First, we explored the expression levels of miR-146a, miR-106b and miR-152 in the laser burn mouse model. We demonstrated that levels of miR-106b were significantly decreased in this mouse model of CNV. We divided this objective in two parts: Part A, explore mechanisms causing miR-106b downregulation and part B, study the therapeutic potential of miR-106b on the inhibition of angiogenesis and CNV formation. First, we showed that expression of the miR-106b-25 cluster is negatively regulated by the ER stress pathway of protein kinase RNA-like ER kinase (PERK) and a reduction in levels of MCM7, the host gene of miR-106b. �����Second, we demonstrated that therapeutic delivery of miR-106b to the retina with lentiviral vectors protects against aberrant retinal neovascularization in two distinct mouse models of pathological neo-vascularization. Results from this study suggest that miRNAs, such as miR-106b, have the potential to be used as multitarget therapeutics for conditions characterized by aberrant retinal neovascularization.

Hintergrund: Zur Begutachtung von Riechschäden werden immer häufiger objektive Befunde benötigt. Die bisher meist übliche Registrierung olfaktorisch evozierter Potenziale (OEP) ist technisch aufwändig und von der Atemtechnik des Probanden abhängig. Zur Diagnostik der Anosmie und Parosmie wird hier die methodisch einfachere Messung der "contingent negative variation" (CNV) eingesetzt. Patienten und Methode: An 25 Probanden mit normalem Riechvermögen und 16 Patienten mit dem subjektiven Befund einer Anosmie nach Unfallverletzung wurden OEP- und CNV-Messungen vorgenommen. Bei der "direkten" CNV sollte der Proband einen Ton aufmerksam erwarten, der einem Duftreiz nach 1,5 s folgte. Für die "selektive" CNV wurde nur einer von zwei zufällig wechselnden Duftreizen mit einem Ton als Zweitreiz markiert, der eine Erwartungsreaktion auslösen sollte. Ergebnisse: Für die beiden Versuchsarten wurde bei 21 bzw. 23 der Probanden mit normalem Riechvermögen eine eindeutige CNV gefunden. Das OEP fehlte in 4,3 % aller Messungen. Bei den Patienten mit Anosmie war in keinem Fall ein OEP bzw. eine CNV vorhanden. Die Amplituden der "selektiven" CNV sind signifikant höher als die der "direkten" CNV. Für die Ergebnisse bei weiblichen und männlichen Probanden ergab sich kein signifikanter Unterschied. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse zeigen, dass ein objektiver klinischer Riechtest mit CNV-Ableitung möglich ist. Im Gegensatz zur OEP-Messung, deren Ergebnis von der Reaktion auf die Reizparameter abhängt, ist die CNV ein Maß für die kognitive Bedeutung des Reizes. Die einfache Reiz- und Messtechnik könnte zur weiteren Verbreitung der objektiven Olfaktometrie beitragen. / Background: An objective smelling test is indicated for a reliable assessment of olfactory disorders. Usually olfactory evoked potentials (OEP) are registered. But the technique of this measurement is complicated and the generation of the OEP depends on the respiration of the subject. Alternatively, the contingent negative variation (CNV) can be used in the diagnosis of anosmia and parosmia, requireing only a simple olfactory stimulator. Subjects and Method: OEP and CNV were derived from 25 adults with normal smelling and from 16 patients with anosmia after head injury. First, the "direct" CNV was registered when the subjects expected a tone following a smell stimulus after 1.5 s. Using two different odors in a random order, the tone only followed one of them, so the "selective" CNV was scored. Results: In both tests a distinct CNV was found in 21 and 23 normal smelling subjects, respectively. OEPs were absent in 4.3 % of this control group. No patient with anosmia showed an OEP or a CNV. The amplitudes of the "selective" CNV are significantly higher than those of the "direct" CNV. No gender dependency was found. Conclusion: The results show that an objective olfactometry can be realized by registration of CNV. Contrary to the measurement of OEP which depend on the physical parameters of olfactory stimuli, CNV correlates well with the cognitive identification of odor.

Um eine Entscheidung zu treffen, muss Information interpretiert und in eine Handlung übersetzt werden. Dafür wird die a priori Wahrscheinlichkeit bezüglich der Entscheidungsalternativen in den Prozess der Entscheidungsfindung integriert und löst Mechanismen der Handlungsvorbereitung aus. In der vorliegenden Dissertation habe ich untersucht, welche Vorbereitungsprozesse aufgrund von wahrscheinlichkeitsbasierter Vorinformation stattfinden und welche Gehirnareale mit der Integration dieser Information assoziiert sind. Um diese Fragen zu beantworten, habe ich eine Verhaltensstudie, eine Studie mit Ableitung des Elektroenzephalogramms (EEG) und eine Studie mittels der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRT) mit simultaner Ableitung des EEGs durchgeführt. Die Versuchspersonen bearbeiteten währenddessen eine Zahlenvergleichsaufgabe mit einem Hinweisreiz, der Wahrscheinlichkeitsinformation bezüglich der erforderlichen Antwort enthielt. Die Reaktionszeit wurde durch die wahrscheinlichkeitsbasierte Vorinformation des Hinweisreizes parametrisch moduliert (Studie 1). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass Vorbereitungsprozesse in Abhängigkeit der Wahrscheinlichkeitsinformation stattfinden. Die EEG Studie (Studie 2) ergab einen parametrischen Effekt von Wahrscheinlichkeitsinformation auf die Amplitude der Contingent Negative Variation (CNV), einer EEG-Komponente, die Vorbereitungsprozesse auf prämotorischer Ebene reflektiert. Darüber hinaus fand sich mittels einer Dipolquellenanalyse ein Dipol im anterioren Cingulum (ACC), dessen Aktivität ebenfalls durch die Wahrscheinlichkeitsinformation parametrisch moduliert war. Diese Ergebnisse lassen auf prämotorische Vorbereitungsprozesse aufgrund von Wahrscheinlichkeitsinformation schließen. In den fMRT-Ergebnissen zeigte sich eine parametrisch modulierte neuronale Aktivierung im posterioren Teil des medial-frontalen Kortex (pMFC), die auf eine Kontrollfunktion zur Handlungsanpassung dieses Areals zurückgeführt werden kann (Studie 3a). Um dynamische Fluktuationen der Wahrscheinlichkeitsverarbeitung zu untersuchen, wurde die CNV Amplitude der Einzeltrials in das Modell der fMRT-Analyse integriert (Studie 3b). Die CNV Amplitude korrelierte mit der neuronalen Aktivität in einem Netzwerk, bestehend aus frontalen, parietalen und striatalen Arealen, das mit allgemeiner wahrscheinlichkeitsunabhängiger Handlungsvorbereitung im Zusammenhang steht. Dagegen zeigten sich im dorsolateralen Präfrontalkortex (DLPFC), im inferioren frontalen Gyrus (IPG) und im inferioren Parietallappen (IPL) Aktivierungen, die sich auf die dynamische Integration von Wahrscheinlichkeitsinformation zurückführen lassen. / To prepare actions in advance, prior information about the probability of decision alternatives is integrated into the decision-making process. In the present dissertation, I investigated preparatory processes elicited by prior probability (PP) and the neural basis of PP processing. In three studies, I collected behavioral data and, furthermore, recorded electroencephalographic (EEG) data separately as well as simultaneously with functional magnetic resonance imaging (fMRI). While applying these methods, participants had to perform a number comparison task with a precue delivering PP about a subsequent response-demanding stimulus. The probability precue elicited the preparation of the response, as shown by the parametrical modulation of response time (RT) depending on PP (Study 1). The EEG study (Study 2) revealed a parametrical effect of PP on the contingent negative variation (CNV) during the foreperiod, which is an indicator for premotor response preparation. Furthermore, a dipole was located in the anterior cingulate cortex (ACC) with its activity parametrically modulated by PP. These EEG results suggest that PP influences premotor response preparation in a parametrical fashion. An analysis of fMRI data showed that neural activity in the posterior medial frontal cortex (pMFC) increased with increasing PP (Study 3a), which is attributed to a monitoring function of this region with respect to behavioral adjustment and initiation of response preparation depending on the PP. By applying an EEG-informed fMRI analysis (Study 3b), I focused on trial-to-trial fluctuations in PP processing and general response preparation as represented by the single-trial CNV amplitude. I found that the CNV amplitude was correlated with neural activity in a network consisting of frontal, parietal, and striatal regions reflecting general preparatory processes independently of PP. Parts of the network, namely, the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC), the inferior frontal gyrus (IFG), and the inferior parietal lobule (IPL), showed activations, which exclusively represented the contributions of PP to the CNV amplitude fluctuations. These results suggest that PP elicits premotor response preparation and activates the pMFC parametrically signaling the need for behavioral adjustment. In contrast, DLPFC, IFG, and IPL are involved in dynamically fluctuating PP processing mechanisms.

Die vorliegende Dissertation beinhaltet drei Studien, welche die kognitiven und neuronalen Grundlagen der Kontrollregulation – ausgelöst durch vorherige Konflikte, konfliktankündigende Hinweise sowie Arousal – untersuchen. Jede Studie basierte auf Interferenzaufgaben mit Durchgängen, die Reaktionskonflikt auslösten (inkompatibel) oder nicht (kompatibel). Studie 1 untersuchte, ob Abfolge abhängigen Verhaltensanpassungen äquivalent sind mit erwartungsbasierten Kontrollprozessen, die durch Hinweise auf die Kompatibilität der nächsten Aufgabe ausgelöst werden. Behaviorale und elektroenzephalographische (EEG) Maße belegten, dass diese Prozesse dissoziieren. Die kontingente negative Variation (CNV), eine EEG Komponente, die Aufgabenantizipation indiziert, zeigte, dass von der Abfolge anhängige Kontrollanpassungen bereits zwischen den Durchgängen agieren. Studie 2 fokussierte auf Prozesse und neuronale Substrate der Kontrollantizipation durch Hinweise. Kompatibilitätshinweise begünstigten effektiv die Leistung, vergrößerten die CNV vor dem nächsten Durchgang und reduzierten konfliktbezogene Konfliktverarbeitung, wie sie durch die N2 Komponente indiziert wird. Im Gegensatz zur Kontrollbedingung gab es keine Anzeichen von Reaktionskonflikt, was auf präemptive Strategien hinweist (d.h. a priori Konfliktverhinderung durch Umschreibung von Bedingungs-Handlungs-Regeln). Funktionelle Bildgebung bestätigte dies, da sie Beteiligung neuronaler Netzwerke zeigte, die eher mit Regelelaboration und –aufrechterhaltung einhergehen als mit Konfliktüberwachung und –lösung. Studie 3 untersuchte das Verhältnis von Handlungskontrolle und Arousalniveau. Toninduziertes Arousal verbesserte Leistung in inkompatiblen und kompatiblen Durchgängen, wobei letztere stärker begünstigt wurden. N1 und N2 im EEG wiesen darauf hin, dass die Effekte auf bessere frühe perzeptuelle Diskriminierung und Aufmerksamkeitszuteilung zurückgehen. / The present dissertation contains three studies that investigated the cognitive and neuronal basis underlying action control regulation prompted by prior conflicts, cues predicting conflict, as well as the state of arousal. These studies were based on inference paradigms involving trials that either induced response conflict (incompatible trials) or did not (compatible trials). Study 1 examined whether behavioral adjustments due to the trial sequence are equivalent to expectancy-based adjustments triggered by cues predicting compatibility. Behavioral and electroencephalographic (EEG) measures showed dissociation of these processes. The contingent negative variation (CNV), a pre-target EEG component indexing task anticipation, further indicated that sequence-related control adjustments already act in the intertrial interval. Study 2 focused on processes and neural substrates underlying cue-based anticipatory control. Cues predicting compatibility effectively benefitted behavioral performance, enhanced the pre-target CNV, and reduced post-target conflict-related processing, as indicated by the N2 component. In contrast to the control condition, indicators of response conflict were absent, a result pointing to conflict preemption strategies (a priori avoidance of conflict via transformation of condition-action rules). Functional neuroimaging fostered this conclusion by showing the involvement of neuronal networks associated with rule elaboration and maintenance rather than with conflict monitoring or resolution. Study 3 investigated the interrelation of action control and the state of arousal. Tone-induced arousal improved performance in both incompatible and compatible trials, whereas the latter ones were relatively more accelerated. N1 and N2 in EEG indicated that these effects are due to enhanced early perceptual discrimination and attentional allocation.

The 16p11.2 copy-number variant (CNV) represents a well-characterized, high-risk factor for autism spectrum disorder that additionally predisposes deletion carriers (16pdel) to increased head circumference, known as macrocephaly. The 16p11.2 CNV consists of 29 known genes, many of which are associated with neurobiological processes relevant for macrocephaly such as cell proliferation and apoptosis, differentiation and cell growth. Our lab’s previous work has demonstrated that induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived neurons from 16pdel carriers show altered cellular morphology related to growth, which include increased soma size, total dendritic length and dendritic complexity. However, specific CNV genes responsible for these phenotypes have not been established. Here, we investigate the relationship between three 16p11.2 genes and the observed cellular phenotypes. We differentiated neurons from control iPSC-derived neural progenitor cells (NPCs) and used short hairpin RNA (shRNA) to reduce the expression of these CNV genes: KCTD13, MAPK3 and C16ORF53. We then assessed neuronal morphology by evaluating soma size, total dendritic length and dendritic complexity. We demonstrate that knocking down KCTD13 and C16ORF53 increases soma size and total dendrite length, respectively, similar to that observed in 16pdel iPSC-derived neurons. For this reason, we speculate that these genes may have a role in cell growth and might underlie macrocephaly. Thus, our study investigates genes in the 16p11.2 CNV that contribute to neuronal morphology, which may have a role in influencing brain size.

Eine lokale Aktivierung des Komplementsystems im RPE ist ein pathogener Faktor der AMD. Neben der Wirkung von angiogenen Faktoren wie VEGF könnte eine Aktivierung des Blutgerinnungssystems im RPE dazu beitragen, dass sich aus einer trockenen eine feuchte AMD entwickelt. Dies könnte auf mehreren Ebenen geschehen: Gerinnungsfaktoren könnten die Expression der Komplementfaktoren und der angiogenen Faktoren regulieren sowie Wirkungen auf die Proliferation und Migration der RPE-Zellen besitzen. Eine Stimulierung der Proliferation und Migration der RPE-Zellen trägt zur Ausbildung von CNV-Membranen bei. Es ist aber bis jetzt nichts darüber bekannt, ob RPE-Zellen Faktoren des Blutgerinnungssystems exprimieren und ob z.B. Thrombin (als zentrale Protease des Blutgerinnungssystems) die Genexpression von Komplementfaktoren und von VEGF im RPE beeinflusst. Die Ziele der vorliegenden Dissertation waren daher: ● Nachweis der mRNA-Expression von Blutgerinnungs- und Komplementfaktoren im RPE; ● Nachweis der Wirkung von Thrombin auf die Expression von VEGF und von Komplementfaktoren, sowie auf die Proliferation und Migration der RPE-Zellen; und ● Nachweis der Wirkung der Komplementfaktoren C5a und C9 auf die Sekretion von VEGF und die Proliferation und Migration der RPE-Zellen.

This master thesis deals with analysis of structural variation of genome and with methods of its sequencing across all generations. Subsequently it contains a description of copy number variation and methods of its detection. The experimental part focuses on algorithm proposal for CNV detection according analysis and testing of uneven coverage in genome, variable representation of GC content and distance of sequence reads. Finally, the algorithm for detecting copy number variation is tested on genomic data of bacteria Klebsiella pneumoniae.

Ziel dieser Arbeit war es Kandidatengene, die mit der Entwicklung von Adipositas assoziiert sind, auf eine veränderte Kopienzahl zu untersuchen. Zwar fanden wir in den von uns ausgewählten Genen keine Veränderungen der Kopienzahl, es gelang uns jedoch der Nachweis eines Nukleotid-Polymorphismus in SIM1 (rs3734354). Für diesen konnten wir erstmals eine Assoziation mit Parametern der Adipositas in einer Kinderkohorte zeigen. Weiterführend untersuchten wir die Effekte von Typ-2-Diabetes-assoziierten SNPs auf Glukosehomöostase und Insulinmetabolismus. Wir fanden eine Assoziation von rs2877716 (ADCY5) mit einer verminderten Insulinsekretion und von rs17271305 (VPS13C) mit einem erhöhten Nüchternglukosespiegel. Zusammenfassend unterstreichen die Effekte von SNPs wie VPS13C und ADCY5 die Komplexität der bisher unvollständig verstandenen Interaktionen von Alter, Genotyp und Phänotyp auf die Entwicklung des Typ-2-Diabetes. Für die Entwicklung der Adipositas scheinen Veränderungen der Kopienzahl in den untersuchten Genen bei übergewichtigen Kindern eine untergeordnete Rolle zu spielen. Weiterführende Arbeiten sind zur Erklärung der Heritabilität beider Krankheitsbilder und der komplexen Interaktionen von Phänotyp und Genotyp notwendig.:1 Bibliographische Beschreibung 2 Einführung 2.1 Bedeutung und Interaktion von Diabetes und Adipositas 2.2 Überblick Genetik Adipositas und Typ-2-Diabetes: Epidemiologie, Monogen vs. Polygen und Methodik 2.3 Der Leptin-Melanocortin Kreislauf 2.4 Überblick über Gene des Leptin-Melanocortin Kreislaufs (Leptin, POMC, MCR, SIM1) 2.5 Von Adipositas zu Diabetes 2.6 Charakteristik der Typ-2-Diabetes Kandidatengene (GIPR, ADCY5, GCKR, VPS13C) 2.7 Ziele der Arbeit 3 Publikation 1 'Copy number variations in “classical” obesity candidate genes are not frequently associated with severe early-onset obesity in children' 4 Publikation 2 'Effects of Genetic Variants in ADCY5, GIPR, GCKR and VPS13C on Early Impairment of Glucose and Insulin Metabolism in Children' 5 Zusammenfassung der Arbeit 6 Literaturverzeichnis 7 Anlagen 7.1 Supplementary Methods, Publikation 1 7.2 Supplementary Methods, Publikation 2 7.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 7.4 Erklärung über den wissenschaftlichen Beitrag des Promovenden an der ausgewählten Publikation 7.5 Lebenslauf 7.6 Publikationsverzeichnis 7.7 Danksagung

Eine lokale Aktivierung des Komplementsystems im RPE ist ein pathogener Faktor der AMD. Neben der Wirkung von angiogenen Faktoren wie VEGF könnte eine Aktivierung des Blutgerinnungssystems im RPE dazu beitragen, dass sich aus einer trockenen eine feuchte AMD entwickelt. Dies könnte auf mehreren Ebenen geschehen: Gerinnungsfaktoren könnten die Expression der Komplementfaktoren und der angiogenen Faktoren regulieren sowie Wirkungen auf die Proliferation und Migration der RPE-Zellen besitzen. Eine Stimulierung der Proliferation und Migration der RPE-Zellen trägt zur Ausbildung von CNV-Membranen bei. Es ist aber bis jetzt nichts darüber bekannt, ob RPE-Zellen Faktoren des Blutgerinnungssystems exprimieren und ob z.B. Thrombin (als zentrale Protease des Blutgerinnungssystems) die Genexpression von Komplementfaktoren und von VEGF im RPE beeinflusst. Die Ziele der vorliegenden Dissertation waren daher: ● Nachweis der mRNA-Expression von Blutgerinnungs- und Komplementfaktoren im RPE; ● Nachweis der Wirkung von Thrombin auf die Expression von VEGF und von Komplementfaktoren, sowie auf die Proliferation und Migration der RPE-Zellen; und ● Nachweis der Wirkung der Komplementfaktoren C5a und C9 auf die Sekretion von VEGF und die Proliferation und Migration der RPE-Zellen.

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