Orientador: Maria Cano / Resumo: As leishmanioses são doenças tropicais negligenciadas, causadas por protozoários do gênero Leishmania. Elas são consideradas pela Organização Mundial da Saúde como uma doença endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. Assim, a busca por novas metodologias de combate e controle dessas doenças parasitárias se faz necessária. Uma das abordagens refere-se ao estudo da biologia molecular dos parasitos causadores da doença, como o estudo dos telômeros, os quais são repetições em tandem associadas a proteínas e localizadas nas extremidades dos cromossomos da maioria dos eucariontes. Sua função é diferenciar os terminais de cromossomos das quebras de DNA em dupla fita e assim proteger tais extremidades da degradação e dos mecanismos de reparo das células, que em muitos casos resulta na perda de material genético codificante ao fim de cada ciclo celular. Os estudos da biologia telomérica de Leishmania têm auxiliado bastante no entendimento deste organismo, no qual o complexo telomerase é composto minimamente por um componente proteico, TERT, e por um RNA, TER, sendo que a caracterização funcional destes componentes é uma das metas de nosso grupo de pesquisa. Tal caracterização tende a ser feita, principalmente, por meios de compostos inibitórios específicos da função desses componentes ou por meio de manipulação gênica, tal qual a tecnologia CRISPR-Cas, que tem possibilitado alterações genômicas precisas e pontuais bem como o silenciamento rápido e específico de genes em diferente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmaniasis are neglected tropical disease, caused by protozoa of the genus Leishmania, which according to the World Health Organization is endemic in many countries, including Brazil. Thus, the search for new alternatives to combat and control these parasitic diseases, are necessary. One of the current potential approaches are to study the biology of telomeres, which are tandemly repeated sequences associated with proteins located at the ends of the chromosomes of most eukaryotes. The main function of telomeres is to differentiate the chromosome end termini from double-stranded DNA breaks and thus, to protect the ends from degradation and damage repair mechanisms, which, at the end of each cell cycle, can result in loss of genetic material. The telomere biology studies of Leishmania have greatly improved our knowledge about this organism, in which the telomerase complex is composed minimally by a protein component, TERT, and by an RNA, TER. The functional characterization of these components is one of the goals of our research group. Such characterization is usually done by using inhibitory compounds specific to the function of these components or by gene manipulation, such as the CRISPR-Cas technology, which has enabled precise genomic alterations as well as the rapid and specific silencing of genes in different organisms, including Leishmania. Thus, we sought to observe the effects of inhibiting the L. major telomerase activity, using a specific TERT inhibitor, called BI... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

CRISPR-Cas systems are highly diverse and canonically function as prokaryotic adaptive immune systems. The canonical resistance mechanism relies on spacers that are complementary to the invaders' nucleic acids. By accidental incorporation or other mechanisms, prokaryotes can also acquire self-targeting spacers that are complementary to their own genome. As self-targeting commonly leads to lethal autoimmunity, the existence of self-targeting spacers poses a paradox. In Chapter 1, we provide an overview of the prevalence of self-targeting spacers, summarize how they can be incorporated, and which means can be employed by the host to evade lethal self-targeting. In addition, we outline alternative functions of CRISPR-Cas systems that are associated with self-targeting spacers. Whether CRISPR-Cas systems can efficiently target their own genome depends heavily on the presence of protospacer adjacent motifs (PAMs) next to the target region. In Chapter 2, we developed a method to determine PAM requirements. Thereby, we specifically focused on type I systems that engage multi-protein complexes, which are challenging to assess. Using the cell-free transcription-translation (TXTL) system, we developed an enrichment-based binding assay and validated its reliability by examining the well-known PAM requirements of the E. coli type I-E system. In Chapter 3, we applied the TXTL-based PAM assay to assess 16 additional CRISPR-Cas systems. These 16 systems included three CRISPR-Cas associated transposons (CASTs). CASTs are recently discovered transposons that employ CRISPR-Cas systems in a non-canonical function for the directed integration of the transposon. To further characterize CASTs in TXTL outside their PAM requirements, we reconstituted the transposition of CASTs in TXTL. In Chapter 4, we turned to non-canonical self-targeting CRISPR-Cas systems, which were already discussed in Chapter 1. While investigating how the plant pathogen Xanthomonas albilineans survives self-targeting by its two endogenous CRISPR-Cas systems, we identified multiple putative anti-CRISPR proteins (Acrs) in the genome of X. albilineans. Two of the Acrs, named AcrIC11 and AcrIF12Xal, inhibited degradation by their respective CRISPR-Cas systems but still retained Cascade-binding ability, and appear responsible for the lack of autoimmunity in X. albilineans. In summary, we developed new technologies that eased the investigation of non-canonical multi-component systems and, if applied to additional systems, might reveal unique properties that could be implemented in new CRISPR-Cas based tools. / CRISPR-Cas-Systeme sind sehr vielfältig und funktionieren kanonisch als prokaryotische adaptive Immunsysteme. Der kanonische Resistenzmechanismus basiert auf Spacern, die komplementär zu den Nukleinsäuren der Eindringlinge sind. Durch zufällige Inkorporation oder andere Mechanismen können Prokaryoten auch Spacer integrieren, die komplementär zu ihrem eigenen Genom sind. Da Selbst-targeting in der Regel zu letaler Autoimmunität führt, stellt die Existenz von selbst-targeting Spacern ein Paradoxon dar. In Kapitel 1 geben wir einen Überblick über die Verbreitung von selbst-targeting Spacern, fassen zusammen, wie sie eingebaut werden können und welche Mittel der Wirt einsetzen kann, um sich dem letalen Selbst-targeting zu entziehen. Darüber hinaus werden alternative Funktionen von CRISPR-Cas-Systemen skizziert, die mit selbst-targeting Spacern in Verbindung gebracht werden. Ob CRISPR-Cas-Systeme Ziele in ihrem eigenen Genom erkennen können, hängt stark davon ab ob bestimmte Motive neben der Zielregion (protospacer adjacent motifs, PAMs) vorhanden sind. In Kapitel 2 haben wir eine Methode entwickelt, um die Anforderungen an PAMs zu bestimmen. Dabei konzentrierten wir uns speziell auf Typ I Systeme, deren Erforschung durch Nutzung von Multiproteinkomplexen erschwert wird. Unter Verwendung des zellfreien Transkriptions-Translations-Systems (TXTL) entwickelten wir einen Test der zur Anreicherung erkannter PAMs führt. Seine Zuverlässigkeit validierten wir, indem wir die bekannten PAM-Anforderungen des E. coli Typ I-E Systems untersuchten. In Kapitel 3 wendeten wir den TXTL-basierten PAM-Assay an, um 16 weitere CRISPR-Cas-Systeme zu untersuchen. Zu diesen 16 Systemen gehörten drei CRISPR-Cas-assoziierte Transposons (CASTs). CASTs sind kürzlich entdeckte Transposons, die CRISPR-Cas-Systeme in einer nicht-kanonischen Funktion für die gerichtete Integration des Transposons einsetzen. Um CASTs in TXTL außerhalb ihrer PAM-Anforderungen weiter zu charakterisieren, haben wir die Transposition von CASTs in TXTL rekonstruiert. In Kapitel 4 wandten wir uns den nicht-kanonischen, selbst-targeting CRISPR-Cas-Systemen zu, die bereits in Kapitel 1 behandelt wurden. Während wir untersuchten, wie das Pflanzenpathogen Xanthomonas albilineans Selbst-targeting durch seine beiden endogenen CRISPR-Cas-Systeme überlebt, identifizierten wir mehrere mutmaßliche Anti-CRISPR-Proteine (Acrs) im Genom von X. albilineans. Zwei dieser Acrs, AcrIC11 und AcrIF12Xal, hemmten die Degradation durch ihre jeweiligen CRISPR-Cas-Systeme, erlaubten aber dennoch DNA-Bindung durch Cascade. Diese beiden Acrs scheinen für das Fehlen von Autoimmunität bei X. albilineans verantwortlich zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir neue Technologien entwickelt haben, die die Untersuchung von nicht-kanonischen Mehrkomponentensystemen erleichtert haben und bei Anwendung auf weitere Systeme einzigartige Eigenschaften offenbaren könnten, die in neue CRISPR-Cas-basierte Tools implementiert werden könnten.

Allogenic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HCT) is a curative therapy for the treatment of malignant and non-malignant bone marrow diseases. The major complication of this treatment is a highly inflammatory reaction known as Graft-versus-Host Disease (GvHD). Cyclosporin A (CsA) and tacrolimus are used to treat GvHD which limits inflammation but also interferes with the anticipated Graft-versus-Leukemia (GvL) effect. These drugs repress conventional T cells (Tcon) along with regulatory T cells (Treg), which are important for both limiting GvHD and supporting GvL. Both of these drugs inhibit calcineurin (CN), which dephosphorylates and activates the nuclear factor of activated T-cells (NFAT) family of transcription factors. Here, we make use of our Cd4cre.Cas9+ mice and developed a highly efficient non-viral CRISPR/Cas9 gene editing method by gRNA-only nucleofection. Utilizing this technique, we demonstrated that unstimulated mouse T cells upon NFATc1 or NFATc2 ablation ameliorated GvHD in a major mismatch mouse model. However, in vitro pre-stimulated mouse T cells could not achieve long-term protection from GvHD upon NFAT single-deficiency. This highlights the necessity of gene editing and transferring unstimulated human T cells during allo-HCT. Indeed, we established a highly efficient ribonucleoprotein (RNP)-mediated CRISPR/Cas9 gene editing for NFATC1 and/or NFATC2 in pre-stimulated as well as unstimulated primary human T cells. In contrast to mouse T cells, not NFATC1 but NFATC2 deficiency in human T cells predominantly affected proinflammatory cytokine production. However, either NFAT single-knockout kept cytotoxicity of human CD3+ T cells untouched against tumor cells in vitro. Furthermore, mouse and human Treg were unaffected upon the loss of a single NFAT member. Lastly, NFATC1 or NFATC2-deficient anti-CD19 CAR T cells, generated with our non-viral ‘one-step nucleofection’ method validated our observations in mouse and human T cells. Proinflammatory cytokine production was majorly dependent on NFATC2 expression, whereas, in vitro cytotoxicity against CD19+ tumor cells was undisturbed in the absence of either of the NFAT members. Our findings emphasize that NFAT single-deficiency in donor T cells is superior to CN-inhibitors as therapy during allo-HCT to prevent GvHD while preserving GvL in patients. / Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (allo-HCT) ist eine kurative Therapie zur Behandlung bösartiger und nicht bösartiger Knochenmarkerkrankungen. Die Hauptkomplikation dieser Behandlung ist eine hochgradige Entzündungsreaktion, die als Graft-versus-Host-Disease (GvHD) bekannt ist. Zur Behandlung der GvHD werden Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus eingesetzt, die die Entzündung eindämmen, aber auch den gewünschten Graft-versus-Leukämie-Effekt (GvL) beeinträchtigen. Diese Medikamente unterdrücken sowohl konventionelle T-Zellen (Tcon) als auch regulatorische T-Zellen (Treg), die sowohl für die Begrenzung der GvHD, als auch für die Unterstützung der GvL wichtig sind. Beide Medikamente hemmen Calcineurin (CN), das die Transkriptionsfaktoren der Familie der Nuclear Factor of Activated T-Cells (NFAT) dephosphoryliert und aktiviert. Hier nutzten wir unsere Cd4cre.Cas9+-Mäuse und entwickelten eine hocheffiziente, nicht-virale CRISPR/Cas9-Geneditierungsmethode mittels reiner gRNA-Nukleofektion. Mithilfe dieser Technik konnten wir zeigen, dass unstimulierte T-Zellen der Maus nach Ablation von NFATc1 oder NFATc2 die GvHD in einem Major-Mismatch-Mausmodell mildern. In vitro vorstimulierte T-Zellen von Mäusen konnten jedoch keinen langfristigen Schutz vor GvHD bei NFAT-Einzeldefizienz erreichen. Dies unterstreicht die Notwendigkeit der Gen-Editierung und des Transfers unstimulierter menschlicher T-Zellen während einer allo-HCT. In der Tat konnten wir ein hocheffizientes Ribonukleoprotein (RNP)-vermitteltes CRISPR/Cas9 gene-editing für NFATC1 und/oder NFATC2 nicht nur in vorstimulierten, sondern auch in unstimulierten primären menschlichen T-Zellen etablieren. Im Gegensatz zu T-Zellen von Mäusen wirkte sich der Mangel an NFATC2, nicht aber so sehr an NFATC1, in menschlichen T-Zellen überwiegend auf die Produktion proinflammatorischer Zytokine aus. Bei beiden NFAT-Single-Knockouts blieb jedoch die Zytotoxizität menschlicher CD3+ T-Zellen gegen Tumorzellen in vitro unangetastet. Darüber hinaus wurden die Treg von Maus und Mensch durch den Verlust eines einzelnen NFAT-Mitglieds nicht beeinträchtigt. Schließlich bestätigten NFATC1- oder NFATC2-defiziente Anti-CD19-CAR-T-Zellen, die mit unserer nicht-viralen "Ein-Schritt-Nukleofektionsmethode" erzeugt wurden, unsere Beobachtungen zu T-Zellen von Maus und Mensch. Die Produktion proinflammatorischer Zytokine hing hauptsächlich von der NFATC2-Expression ab, während die In-vitro-Zytotoxizität gegen CD19+-Tumorzellen in Abwesenheit eines der beiden NFAT-Mitglieder ungestört war. Unsere Ergebnisse unterstreichen, dass der Mangel eines einzelnen NFAT-Mitglieds in Spender-T-Zellen einer Therapie mit CN-Inhibitoren während einer allo-HCT überlegen ist. Hier könnten wir eine GvHD verhindern und gleichzeitig den GvL-Effekt in allo-HCT-Patienten erhalten.

Les bactéries sont continuellement exposées à un danger, la prédation par des bactériophages. Pour se défendre, elles ont développé une grande variété de mécanismes. Parmi ceux-ci, on retrouve CRISPR-Cas (« clustered regularly interspaced palindromic repeats »), un système adaptatif que possèdent environ 45% des bactéries. Une caractéristique unique du système CRISPR-Cas est qu’il constitue en quelque sorte la mémoire de l’hôte. Par exemple, le système peut emmagasiner des petits fragments d’un génome viral, appelés espaceurs, et les introduire dans son CRISPR. Cette mémoire lui permet de se défendre contre une réinfection par le même virus ou un virus hautement apparenté. Par contre, malgré que l’acquisition de nouveaux espaceurs semble fréquente dans la nature, ce phénomène n’est que très rarement observé en conditions de laboratoire. Néanmoins, quelques bactéries font exception à la règle et l’une d’entre elles est Streptococcus mutans. Dans le cadre de cette étude, l’interaction entre la souche S. mutans P42S et le bactériophage virulent M102AD a été analysée en détail. De plus, certaines applications potentielles du système CRISPR-Cas ont également été approfondies. Le premier objectif de cette thèse était de caractériser le système CRISPR-Cas de S. mutans P42S au niveau moléculaire et de déterminer son rôle dans les interactions phage-bactérie. Le deuxième objectif était d’établir le potentiel de la protéine Cas9 de S. mutans P42S (SmutCas9) comme nouvel outil d’édition génomique. S. mutans P42S possède un système CRISPR-Cas de type II-A. Bien que ce type de système soit probablement le plus étudié, celui de S. mutans P42S présente plusieurs caractéristiques uniques lui permettant de se démarquer. En effet, ce dernier reconnaît un PAM différent de ce qui était auparavant connu pour cette espèce bactérienne, l’acquisition simultanée de multiples espaceurs semble fréquente, ce qui est probablement dû au phénomène de « priming ». Malgré le rôle de CRISPR-Cas dans la défense antivirale, S. mutans P42S dispose d’autres mécanismes de défense contre les phages. Des cellules mutantes sont résistantes aux phages en empêchant l’adsorption de particules virales à la cellule ont notamment été observées. D'autres mécanismes sont assurément impliqués dans la défense antivirale de S. mutans. Finalement, SmutCas9 s’est montrée efficace dans l’édition de génomes viraux et elle apparaît comme une candidate à explorer pour cette application. / Bacteria are exposed to the constant threat of viral predation. To defend themselves, bacteria have developed a wide variety of different mechanisms. One of these mechanisms is CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced palindromic repeats), an adaptive immune mechanism found in approximately 45% of bacteria. A unique feature of CRISPR-Cas systems compared to other antiviral defence mechanisms is that it has a memory. The system is capable of remembering previous viral encounters and protects the bacterial host from re-infection by the same or highly-related viruses. This memory is due to the acquisition of virus-derived genome fragments called spacers. Despite common acquisition of novel spacers in nature, and thereby the emergence of new immunity, acquisition of new spacers under laboratory conditions has been rarely observed. One of the few exceptions is Streptococcus mutans. In this study, the interactions between S. mutans strain P42S and its virulent bacteriophage M102AD are investigated in detail. In addition, possible applications of the CRISPR-Cas system are analysed. The first objective of this thesis was to characterise the CRISPR-Cas system of S. mutans P42S on the molecular level and to determine its role in antiviral defence. The second objective was to determine the potential of the Cas9 protein of S. mutans P42S (SmutCas9) in genome editing. S. mutans P42S possesses a type II-A CRISPR-Cas system. Although this is arguably the best studied system, the one found in the strain S. mutans P42S has several features that makes it stand out. It recognises a PAM different from what was known for this species, multiple spacer acquisitions are frequent, and this appears to be partially due to priming. Although CRISPR-Cas plays a role in antiviral defence, there are additional antiviral defence mechanisms that protect S. mutans against phages. Adsorption resistance is one of them, although additional unidentified antiviral defence mechanisms are likely involved. Finally, SmutCas9 has been shown functional in editing of viral genomes and appears to be a candidate for human genome editing.

Développé en 2012, le système CRISPR-Cas a d'ores et déjà révolutionné les sciences du vivant en démocratisant l'édition du génome grâce à sa simplicité d'usage, sa forte efficacité et son adaptabilité. Néanmoins, l'efficacité et la précision de ce système varient grandement ce qui peut freiner ou empêcher sa mise en place. Mes travaux de doctorat se sont articulés autour de ces deux thématiques. L'édition du génome à l'aide de nucléases artificielles repose sur l'activation des voies de réparation de la cellule par induction d'une cassure double brin (DSB) dans l'ADN. Le système CRISPR-Cas est composé d'une nucléase (Cas) associée à un ARN guide qui se lie à la séquence ciblée par appariement de base. Une fois la DSB induite par la nucléase, plusieurs mécanismes de réparation entrent en compétition pour réparer la cassure. La réparation par jonction d'extrémités non-homologues (NHEJ) peut entrainer l'insertion de mutations ce qui permet de réaliser des inactivations de gène alors que la réparation par recombinaison homologue (HDR) permet des corrections ou insertions précises. Les stratégies les plus répandues pour améliorer l'efficacité de l'édition génique reposent sur l'utilisation de marqueurs de sélection. Néanmoins, ces marqueurs peuvent influencer la physiologie des cellules et leur utilisation n'est pas envisageable dans un cadre thérapeutique. Pour y remédier nous avons développé une méthode de cosélection sans marqueur se basant sur la création d'un allèle à gain de fonction. En modifiant le gène ATP1A1 encodant pour la pompe Na+/K+ ATPase par NHEJ et HDR nous avons conféré une résistance à l'ouabaïne aux cellules tout en conservant la fonctionnalité de la pompe. En ciblant simultanément le gène ATP1A1 et un gène d'intérêt, le traitement des cellules à l'ouabaïne permet de sélectionner les cellules résistantes et enrichir la population en cellules génétiquement modifiées dans le gène d'intérêt. Nous avons obtenu des augmentations drastiques de l'efficacité de NHEJ et de HDR et la cosélection à l'aide de Cas12a permet d'enrichir facilement et simultanément de multiples cibles. La méthode est simple et rapide à mettre en place et nous avons démontré sa versatilité en l'appliquant à diverses lignées cellulaires dont les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques couramment utilisées en thérapie génique ex vivo, ce qui permet d'envisager de futures applications thérapeutiques. Notre stratégie a été déployée dans de nombreux laboratoires depuis sa publication et, de manière significative, elle a également été utilisée pour enrichir les événements de réparation des éditeurs de base et éditeurs par transcriptase inverse (prime editing) et pourrait aussi être applicable aux futurs outils d'édition du génome. La HDR est la voie privilégiée pour des perspectives thérapeutiques. Néanmoins, la NHEJ est la voie de réparation majoritaire dans les cellules humaines et la recombinaison homologue n'est active que lors des phases S et G2 du cycle cellulaire. La fusion de Cas9 avec le dégron de la géminine a permis de restreindre son activité aux phases S, G2 et M du cycle cellulaire et augmenter sensiblement le ratio de réparation par HDR. Parallèlement à la réplication de l'ADN, la recombinaison homologue présente un pic d'activité en milieu de phase S puis son activité diminue. Nous avons émis l'hypothèse que restreindre l'activité de la nucléase à la phase S permettrait d'augmenter davantage le ratio de réparation par HDR. Néanmoins, aucun dégron existant ne permet une dégradation lors des phases G1, G2 et M. Le système d'identification Fucci se base sur la fusion de dégrons à des protéines fluorescentes pour marquer les différentes phases du cycle cellulaire. Afin de développer un nouveau dégron permettant d'améliorer les systèmes Fucci et CRISPR, nous nous sommes intéressés à SLBP, une protéine active uniquement lors de la phase S. Nous avons caractérisé son dégron et l'avons utilisé afin de développer une sonde fluorescente spécifique de la phase S dont le profil d'expression a été confirmé par cytométrie en flux et microscopie en temps réel. Le marquage précis de la phase S pourrait notamment aider à élucider les voies de réparation de l'ADN. Nous avons également démontré que la fusion d'un de nos dégrons avec SpCas9 permet d'augmenter le taux de réparation par HDR de manière plus significative que le dégron de la géminine. Il sera intéressant d'évaluer sa synergie avec d'autres stratégies d'optimisation du système CRISPR. / Developed in 2012, the CRISPR-Cas system has rapidly revolutionized life sciences and is routinely used in research laboratories worldwide. Its efficiency, simplicity and versatility greatly facilitate gene editing and functional genomics. However, the variability of its precision and efficiency is a major concern since it restrains its implementation, especially for therapeutic use. My PhD investigations revolves around these challenges. Gene editing through artificial nucleases relies on inducing a double-strand break (DSB) in the DNA to activate cellular repair pathways. For CRISPR-Cas systems, targeting is realised through base pairing between the targeted sequence and a guide RNA that associates with the Cas nuclease, making the design of new guides a simple process. Once the nuclease has elicited the DSB, several repair mechanisms compete to repair the break. Non-homologous end joining (NHEJ) can lead to mutations in the targeted sequence and allows gene knock-out while homology-directed repair (HDR) permits precise corrections or insertions. The most common strategy to enrich for cells that have undergone the desired genetic modification relies on the use of selection markers. However, since these markers can impact cell physiology, they are not suitable for therapeutic use. To address this issue, we have developed a marker free co-selection method based on the creation of a gain of function allele. By targeting ATP1A1, the gene encoding for the Na+/K+ ATPase pump, we conferred resistance to ouabain to the cells by either NHEJ or HDR while conserving the pump properties. Simultaneous targeting of ATP1A1 and a gene of interest followed by cell treatment with ouabain allows enrichment for cells genetically modified in the gene of interest. We observed a drastic improvement in efficiency for both NHEJ and HDR events and several targets can be enriched simultaneously and easily by exploiting Cas12a multiplexing capabilities. It's a simple and fast strategy and we have demonstrated its versatility by modifying various cell lines including hematopoietic and progenitor stem cells, commonly used in ex vivo gene therapy, demonstrating therapeutic potential. Since its publication, the ATP1A1 co-selection strategy has been exploited in numerous laboratories and successfully applied to enrich for base and prime editors' modifications and it could as well be applied to future genome editing tools, further demonstrating its versatility. Due to its fidelity, HDR is the preferred pathway for potential therapeutic use. Nevertheless, NHEJ is the major repair mechanism in human cells and homologous recombination is only active during S and G2 cell cycle phases. Although inhibiting NHEJ or promoting HDR by targeting proteins involved in these pathways is greatly efficient, the efficiency variability between cell lines and toxicity is considerable. Fusing Cas9 to the geminin degron restricts its activity to the S, G2 an M phases and slightly improves the HDR ratio. Alongside DNA replication, homologous recombination activity is thought to peak in the mid S phase and decline during G2 phase. We hypothesized that restricting Cas9 nuclease expression to the S phase will further bias repair towards HDR. However, no degron allowing G1, G2 and M phases degradation has been developed yet. The Fucci system is based on the fusion between degrons and fluorescent proteins to distinguish the different cell cycle phases but lack an S-phase specific probe. To improve cell cycle identification and HDR ratio, we decided to develop a degron allowing such a regulation. In that order, we studied the stem-loop binding protein (SLBP) which bind histone mRNAs and is only active during S phase and is degraded in other phases. We analysed SLBP endogenous expression pattern, characterised its degron, and used it to engineer an S-phase specific probe that we named Fucci-S. K562 and HeLa S3 cells constitutively expressing Fucci-S probe were created and their fluorescence expression pattern were analysed by FACS and live cell microscopy to confirm its S-phase specificity. Combined with the Fucci probes it allows to differentiate all the cell cycles phases and could be used in developmental and DNA repair studies. Fusing one of our newly developed degrons to SpCas9 increases HDR ratio more than the geminin degron. Additional studies would allow to establish its range of use and how it synergizes with other CRISPR-Cas optimisation strategies.

CRISPR-Cas systems are a versatile tool in genetic engineering because they can be easily reprogrammed to cut a specific chromosomal region or RNA transcript. The choice of nuclease, gRNA design, and target region all influence targeting efficiency, so the appropriate CRISPR components should be chosen depending on the desired application. This thesis examines factors that influence targeting in both DNA- and RNA-targeting CRISPR systems. Chapter 1 discusses the importance of target RNA abundance in shaping the immunity of type VI CRISPR systems. In bacteria, the Cas13 nuclease is known to degrade RNA specifically and non-specifically, leading to cell growth arrest, also known as dormancy. In this chapter, the factors that determine dormancy are investigated by targeting genome- and plasmid-encoded transcripts in E. coli. The observations are extended to a gRNA library targeting the entire coding genome and gRNA design rules are extrapolated. Finally, the role of Cas13 in defense is investigated by testing how the system behaves during viral infection or plasmid transformation. Chapter 2 also looks at the factors that characterize targeting efficiency, but focuses on the Cas12a DNA-targeting system in K. pneumoniae. The ultimate goal is to develop CRISPR antimicrobials as alternatives to antibiotics to eliminate multidrug-resistant and hypervirulent bacteria. Several nucleases are tested for antimicrobial activity, the Cas12a nuclease is selected and the same gRNAs are used against different strains to understand the robustness of the method. Rules for gRNA design are also investigated by looking at secondary structure and testing a gRNA library across several genomic regions in two different strains. This information is used to develop a machine-learning algorithm to predict gRNA activity. In addition, the CRISPR-Cas systems are also packaged in a T7-like phage with engineered tail fibers and delivered to K. pneumoniae. While Chapter 2 uncovers various factors that improve targeting efficiency, Chapter 3 aims to reduce targeting by the Cas9 and Cas12a nucleases to favor homology-directed repair for genome editing in E. coli. Targeting is slowed down so that some copies of the chromosomes remain intact, allowing the bacterium to survive and integrate the desired edit. To reduce targeting, different gRNA formats or nuclease variations are used, gRNA expression is modulated, or gRNAs with attenuated targeting are designed. Attenuated gRNAs are tested to introduce point mutations as well as whole gene deletions and substitutions, and the method is extended to Klebsiella oxytoca and Klebsiella pneumoniae, where it is applied to block transcription of an antibiotic resistance gene in the genome, restoring sensitivity to ampicillin. Overall, this work discusses how changing the CRISPR components alters the outcome of targeting and highlights strategies to achieve efficient or attenuated targeting depending on the desired application. / CRISPR-Cas-Systeme sind ein vielseitiges Werkzeug in der Gentechnik, da sie leicht umprogrammiert werden können, um eine bestimmte chromosomale Region oder ein RNA-Transkript zu schneiden. Die Wahl der Nuklease, das Design der gRNA und die Zielregion beeinflussen alle die Effizienz des Targetings, so dass die richtigen CRISPR-Komponenten je nach gewünschter Anwendung ausgewählt werden sollten. In dieser Arbeit werden die Faktoren untersucht, die das Targeting sowohl bei DNA-targeting als auch bei RNA-targeting CRISPR-Systemen beeinflussen. In Kapitel 1 wird erörtert, wie die Häufigkeit der Ziel-RNA die Immunität von Typ VI CRISPR-Systemen ausprägt. In Bakterien ist von der Cas13-Nuklease bekannt, dass sie RNA spezifisch und unspezifisch abbaut, was zu einem Stillstand des Zellwachstums führt, der auch als Dormanz bezeichnet wird. In diesem Kapitel werden die Faktoren untersucht, die Dormanz determinieren, indem genom- und plasmidkodierte Transkripte in E. coli ins Visier genommen werden. Die Beobachtungen werden auf eine gRNA-Bibliothek ausgeweitet, die auf das gesamte kodierende Genom abzielt, und es werden gRNA-Designregeln extrapoliert. Schließlich wird die Rolle von Cas13 bei der Verteidigung untersucht, indem getestet wird, wie sich das System während einer Virusinfektion oder Plasmidtransformation verhält. Kapitel 2 befasst sich ebenfalls mit den Faktoren, die die Targeteffizienz charakterisieren, konzentriert sich jedoch auf das Cas12a-DNA-Targeting-System in K. pneumoniae. Das Endziel ist die Entwicklung von CRISPR-Antimikroben als Alternative zu Antibiotika, um multiresistente und hypervirulente Bakterien zu eliminieren. Mehrere Nukleasen werden auf ihre antimikrobielle Aktivität getestet, die Cas12a-Nuklease wird ausgewählt und dieselben gRNAs werden gegen verschiedene Stämme eingesetzt, um die Robustheit der Methode zu verstehen. Außerdem werden die Regeln für das Design von gRNAs untersucht, indem die Sekundärstruktur betrachtet und eine gRNA-Bibliothek, die verschiedenen genomische Regionen in zwei verschiedenen Stämmen umfasst, getestet wird. Diese Informationen werden zur Entwicklung eines Algorithmus für maschinelles Lernen verwendet, um die gRNA-Aktivität vorherzusagen. Darüber hinaus werden die CRISPR-Cas-Systeme auch in einen T7-ähnlichen Phagen mit manipulierten Schwanzfasern verpackt und an K. pneumoniae übertragen. Während in Kapitel 2 verschiedene Faktoren aufgedeckt werden, die die Effizienz des Targetings verbessern, zielt Kapitel 3 darauf ab, das Targeting durch die Cas9- und Cas12a-Nukleasen zu reduzieren, um homology directed repair für Genom-Editierung in E. coli zu begünstigen. Das Targeting wird verlangsamt, so dass einige Kopien der Chromosomen intakt bleiben und das Bakterium überleben und die gewünschte Veränderung integrieren kann. Um das Targeting zu reduzieren, werden verschiedene gRNA-Formate oder Nuklease-Variationen verwendet, die gRNA-Expression wird moduliert, oder es werden gRNAs mit abgeschwächten Targeting entwickelt. Abgeschwächte gRNAs werden getestet, um Punktmutationen, Deletionen und Substitutionen ganzer Gene einzuführen, und die Methode wird auf Klebsiella oxytoca und Klebsiella pneumoniae ausgeweitet, wo sie zur Blockierung der Transkription eines Antibiotikaresistenzgens im Genom eingesetzt wird, um die Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin wiederherzustellen. Insgesamt wird in dieser Arbeit erörtert, wie die Veränderung der CRISPR-Komponenten die Folgen des Targetings verändert und es werden Strategien hervorgehoben, um effizientes oder abgeschwächtes Targeting, je nach der gewünschten Anwendung, zu erreichen.

CRISPR-Cas systems use CRISPR RNAs (crRNAs) to recognize and clear invading nucleic acids. In type II and some type V systems, a trans-activating crRNA (tracrRNA) binds to crRNAs to drive their maturation and subsequent interference by Cas9 and Cas12, respectively. Despite the diversified distribution of tracrRNA and its wide use for genome editing, a few related questions remain to be elucidated. Does crRNA solely derive from CRISPR loci? Could the tracrRNA hybridize with other cellular RNAs containing repeat-like sequences, resulting in crRNA-like RNA? Could we even engineer tracrRNA to sense any RNA-of-interest? To answer these questions, we analyzed the RNAs co-immunoprecipitated with Cas9 from Campylobacter jejuni, and unexpectedly found that tracrRNA hijacked some cellular RNAs as noncanonical crRNAs, which can guide DNA targeting by Cas9. We then demonstrated that the tracrRNA can be reprogrammed to sense any RNA-of-interest. We exploited this RNA sensing capability to develop an in vitro multiplexed RNA detection platform LEOPARD and an in vivo RNA recording platform TIGER. We further combined Rptrs with collateral cleavage of single-stranded DNA by Cas12 nucleases to create a direct RNA detection platform with signal amplification. Finally, we provided a detailed protocol for Rptrs design. My work establishes a new mode of crRNA biogenesis, created a new framework for RNA detection and recording, and would open more opportunities and applications for transcription-dependent editing, regulation and therapy. / CRISPR-Cas Systeme nutzen CRISPR RNAs (crRNAs) um eindringende Nukleinsäuren zu erkennen und abzuwehren. In Typ II und manchen Typ V Systemen, bindet eine trans-aktivierende crRNA (tracrRNA) an crRNAs, um deren Reifung und darauffolgende Interferenz durch Cas9 bzw. Cas12 voranzutreiben. Trotz der diversifizierten Verbreitung von tracrRNA und deren breite Anwendung für Genom-Editierung, bestehen weiterhin ungeklärte Fragen. Stammen crRNAs ausschließlich von CRISPR loci ab? Könnte die tracrRNA mit anderen zellulären RNAs, die Repeat-artige Sequenzen enthalten, hybridisieren und crRNA-ähnliche RNA bilden? Könnte man sogar trcrRNA konstruieren, um beliebige RNAs von Interesse zu erkennen? Um diese Fragen zu beantworten, analysierten wir RNAs die mit Cas9 von Campylobacter jejuni co-präzipitierten. Dabei stellten wir unerwarteter Weise fest, dass tracrRNAs bestimmte zelluläre RNAs als nicht-kanonische crRNAs kaperten und folglich Cas9 zu DNS-Zielsequenzen steuern konnten. Als nächstes demonstrierten wir, dass trcrRNAs umprogrammiert werden können, um beliebige RNAs von Interesse zu erkennen. Wir nutzten dieses RNA Wahrnehmungsvermögen, um eine in vitro Multiplex RNA Erkennungsplattform LEOPARD und eine in vivo RNA Aufzeichnungsplattform TIGER zu entwickeln. Zusätzlich kombinierten wir Rptrs mit der kollateraler Spaltung von Einzelstrang-DNS durch Cas12 Nukleasen, um eine direkte RNA Detektierungsplattform mitsamt Signalamplifikation zu entwickeln. Zum Schluss stellten wir ein detailliertes Protokoll für das Entwerfen von Rptrs bereit. Meine Arbeit etabliert eine neue Art der crRNA Biogenese, schafft ein neues Rahmenwerk für die Detektion und Aufzeichnung von RNA und eröffnet mehr Möglichkeiten und Anwendungen für transkriptionsabhängige Editierung, Regulation und Therapie.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 mai 2023) / La métagénomique virale a permis l'identification de milliers de nouvelles séquences de phages dans une variété d'écosystèmes. Leur caractérisation est limitée par leur grande diversité, puisque la majorité des nouvelles séquences virales ne ressemble à aucun phage connu et répertorié. Pour faire face à ce défi, de nouveaux outils de la bio-informatique doivent être développés permettant de mieux comprendre les interactions phages-bactéries et ainsi élucider le rôle des phages dans leur écosystème. Une approche pour étudier les interactions phages-bactéries repose sur l'exploitation des systèmes CRISPR-Cas. Chez les bactéries et les archées, ces systèmes servent de mécanismes de défense contre le matériel génétique envahisseur comme le génome des phages. Grâce à de courtes séquences appelées espaceurs, incorporées dans leur locus CRISPR, les bactéries qui portent ce système peuvent reconnaître rapidement un génome de phage, le couper et ainsi bloquer l'infection. Les espaceurs sont archivés et continuent d'être ajoutés au fil des infections, rendant le locus CRISPR très dynamique. Pour les analyses bio-informatiques, les espaceurs ont plusieurs utilités, notamment pour le typage de souches bactériennes et pour la prédiction des hôtes bactériens de séquences virales. Cependant, les quelques outils existants ont été développés avant l'accélération massive dans la découverte de nouvelles séquences de phages offerte par la métagénomique virale. Ainsi, beaucoup de travail répétitif, manuel et non standardisé était requis pour utiliser les espaceurs CRISPR dans le contexte d'études de métagénomique. Les deux premiers chapitres de cette thèse sont dédiés au développement d'outils bio-informatiques exploitant les loci CRISPR. Dans un premier temps, le logiciel CRISPRStudio a été développé pour automatiser la création de figures représentant les loci CRISPR. Ce logiciel offre une grande polyvalence, tout en accélérant la production de figures. Dans un deuxième temps, un second logiciel a été créé pour prédire les hôtes bactériens des phages. Celui-ci s'appuie sur une base de données d'espaceurs de plus de 11 millions de séquences et d'une série de critères fondés sur la biologie des systèmes CRISPR-Cas pour sélectionner l'hôte bactérien le plus probable d'un phage. Cet outil a permis d'améliorer les performances, la standardisation et la facilité d'utilisation des approches de prédiction de l'hôte utilisant les espaceurs CRISPR. Puis, les deux outils ont été mis à profit dans le troisième chapitre pour l'étude spécifique des interactions phages-bactéries entre Escherichia coli et ses phages, dans le contexte du microbiote intestinal. La caractérisation des loci CRISPR a permis d'élucider le rôle probable du système CRISPR-Cas chez cette espèce, soit un mécanisme anti-prophages. À ma connaissance, il s'agit également de la première étude identifiant une aussi grande proportion des cibles des espaceurs, en trouvant l'origine de 60 % des proto-espaceurs. / Viral metagenomics has allowed the identification of thousands of new phage sequences in various ecosystems. Yet, their characterization is still limited by their great diversity, as the majority of new viral sequences resembles no known phages in reference databases. To tackle this challenge, new bioinformatic tools are needed to better understand phage-bacteria interactions and to elucidate the role of phages in their ecosystem. One approach to study phage-bacteria interactions consists in taking advantage of CRISPR-Cas systems. In bacteria and archaea, these systems act as defense mechanisms against invading genetic material, such as phage genomes. Thanks to short sequences called spacers incorporated in their CRISPR locus, bacteria that carry this system can rapidly recognize a phage genome and block its infection, analogous to an adaptive immune system. Spacers are archived and continue to be added upon phage infection, which makes the CRISPR locus highly dynamic. In bioinformatics analyses, spacers can be utilized to perform strain typing and to predict the bacterial hosts of phages. However, the few existing tools were developed before the metagenomics era and the massive discovery of new phage sequences. Thus, exploiting CRISPR loci for viral metagenomics projects requires repetitive, manual, and non-standardized work. The first two chapters of this thesis are dedicated to developing bioinformatics tools exploiting CRISPR loci. First, a software was developed to automatize the creation of figures representing CRISPR loci. CRISPRStudio offers versatility, is user-friendly and accelerates the figure production. Second, another software was created to predict the bacterial hosts of phages. It relies on a spacer database containing more than 11 million sequences and on a set of criteria inspired by CRISPR-Cas biology to select the most likely bacterial host for a phage genome. This tool improved the performances, the standardization, and the ease of use of host prediction approaches using CRISPR spacers. In the third chapter, the two tools were used to specifically study phage-bacteria interactions between Escherichia coli and its phages, present in the gut microbiota. CRISPR characterization allowed us to uncover the probable role of the CRISPR-Cas system in this species, being an anti-prophage mechanism. To my knowledge, this is the first study that identified a large proportion of spacer targets, by finding the origin of 60% of the protospacers.

The ability to precisely manipulate the genome in a targeted manner is fundamental to driving both basic science research and development of medical therapeutics. Until recently, this has been primarily achieved through coupling of a nuclease domain with customizable protein modules that recognize DNA in a sequence-specific manner such as zinc finger or transcription activator-like effector domains. Though these approaches have allowed unprecedented precision in manipulating the genome, in practice they have been limited by the reproducibility, predictability, and specificity of targeted cleavage, all of which are partially attributable to the nature of protein-mediated DNA sequence recognition. It has been recently shown that the microbial CRISPR-Cas system can be adapted for eukaryotic genome editing. Cas9, an RNA-guided DNA endonuclease, is directed by a 20-nt guide sequence via Watson-Crick base-pairing to its genomic target. Cas9 subsequently induces a double-stranded DNA break that results in targeted gene disruption through non-homologous end-joining repair or gene replacement via homologous recombination. Finally, the RNA guide and protein nuclease dual component system allows simultaneous delivery of multiple guide RNAs (sgRNA) to achieve multiplex genome editing with ease and efficiency. The potential effects of off-target genomic modification represent a significant caveat to genome editing approaches in both research and therapeutic applications. Prior work from our lab and others has shown that Cas9 can tolerate some degree of mismatch with the guide RNA to target DNA base pairing. To increase substrate specificity, we devised a technique that uses a Cas9 nickase mutant with appropriately paired guide RNAs to efficiently inducing double-stranded breaks via simultaneous nicks on both strands of target DNA. As single-stranded nicks are repaired with high fidelity, targeted genome modification only occurs when the two opposite-strand nicks are closely spaced. This double nickase approach allows for marked reduction of off-target genome modification while maintaining robust on-target cleavage efficiency, making a significant step towards addressing one of the primary concerns regarding the use of genome editing technologies. The ability to multiplex genome engineering by simply co-delivering multiple sgRNAs is a versatile property unique to the CRISPR-Cas system. While co-transfection of multiple guides is readily feasible in tissue culture, many in vivo and therapeutic applications would benefit from a compact, single vector system that would allow robust and reproducible multiplex editing. To achieve this, we first generated and functionally validated alternate sgRNA architectures to characterize the structure-function relationship of the Cas9 protein with the sgRNA in DNA recognition and cleavage. We then applied this knowledge towards the development and optimization of a tandem synthetic guide RNA (tsgRNA) scaffold that allows for a single promoter to drive expression of a single RNA transcript encoding two sgRNAs, which are subsequently processed into individual active sgRNAs.

Los sistemas de defensa de procariotas denominados CRISPR–Cas dan lugar a la formación de un complejo nucleoproteico compuesto por proteínas Cas y un ARN guía derivado de las regiones CRISPR que se encarga de interferir en la propagación de elementos genéticos móviles a través de la degradación mediada por nucleasas Cas de secuencias foráneas que coinciden con los ARN guía. La fácil reprogramación de la guía ha propiciado el desarrollo de un arsenal de herramientas para la modificación y manipulación de ácidos nucleicos, cuyas aplicaciones superan con creces la utilización implementada inicialmente para la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes como editor del ADN. En un intento de paliar las limitaciones encontradas en el uso de la Cas9 de S. pyogenes, que sigue siendo la herramienta CRISPR más empleada, el repertorio de nucleasas Cas disponibles ha aumentado considerablemente en los últimos años, en particular las pertenecientes a la clase 2. La actividad de corte inespecífico fuera de la diana, el requerimiento de un motivo concreto adyacente a la diana y su gran tamaño, que limita su administración celular, han motivado la búsqueda de nuevas nucleasas en datos genómicos y metagenómicos, así como la generación de variantes derivadas de proteínas nativas mediante evolución dirigida o ingeniería de proteínas. En la presente tesis, llevamos a cabo una búsqueda de sistemas CRISPR–Cas de clase 2 a partir de 10 metagenomas provenientes de tres ambientes previamente inexplorados en este sentido, dando como resultado la identificación de 107 sistemas pertenecientes a alguno de los subtipos descritos hasta la fecha. El análisis de las características de las proteínas Cas encontradas y su relación evolutiva con otras ortólogas empleadas en edición genética nos llevó a la selección de 9 candidatas para su caracterización funcional. Entre todas ellas, la proteína EH6Cas9 mostró actividad nucleasa sobre secuencias diana de ADN en E. coli, adyacentes al motivo 5’-NGG-3’. Con el fin de desarrollar una nueva herramienta de biología molecular, la simplificación del sistema nos llevó a diseñar un ARN guía sintético compatible con EH6Cas9. La caracterización bioquímica de la herramienta demostró que EH6Cas9 es una ADNasa metal dependiente, programable mediante guías de ARN, que muestra su máxima actividad frente a dianas adyacentes a la secuencia consenso 5’-NGGDT-3’ a temperaturas entre 25 °C y 37 °C. Finalmente, EH6Cas9 también demostró su aplicabilidad como herramienta de edición genética. En E. coli, EH6Cas9 mostró una gran eficacia como estrategia para la selección positiva de mutantes, mientras que en células de ratón indujo la formación de inserciones y deleciones en una secuencia diana, presentando características distintivas respecto a la Cas9 de S. pyogenes que la hacen especialmente indicada para aplicaciones de edición genética en eucariotas en las que se requiera una actividad nucleasa moderada y más restringida.