Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T04:00:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CarlaReis_M.pdf: 2012737 bytes, checksum: 29446d9a4e9ff14301c100dcd3fb82ab (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Anticorpos monoclonais (AcM) são imunoglobulinas secretadas por clones de linfócitos B imortalizados obtidos pela tecnologia de hibridomas. Esses clones são cultivados em meios de cultura complexos e, geralmente, liberam baixas concentrações de AcM, dificultando as etapas de purificação. Como a utilização destas proteínas nas áreas terapêutica e analítica requer um alto grau de pureza, diferentes estratégias de purificação vêm sendo desenvolvidas, mas usualmente os anticorpos são purificados por cromatografia de afinidade com proteína A ou G imobilizada, o que representa um elevado custo de produção para processos industriais. No intuito de contribuir para o desenvolvimento de processos de purificação dessas moléculas, estudou-se a purificação do AcM anti-Trypanosoma cruzi isotipo IgG2a em orto-fosfo-serina (OPS) imobilizado em gel de agarose. Contrário ao relatado em literatura, observou-se que o agente quelante apresentou baixa capacidade em imobilizar o íon metalico Ni2+. Além disso, o quelato formado adsorveu a molécula alvo juntamente com impurezas do sobrenadante do meio de cultura. Foi observado também que o OPS se comporta como ligante de troca iônica seletivo para IgG2a em solução tampão Tris-HCl 50 mmol/L pH 7,0, quando imobilizado em gel de agarose ativado com CNBr, porém os ensaios realizados com o ligante imobilizado em gel ativado com bisoxirano demonstraram que a inserção de uma molécula espaçadora reduz a seletividade do adsorvente. O AcM foi recuperado com elevado grau de pureza quando empregado em solução tampão Tris-HCl 50 mmol/L pH 7,0 e dessorção pelo acréscimo de NaCl 1,0 mol/L para promover aumento da força iônica. Os resultados de ensaios dinâmicos revelaram que a eficiência de recuperação do produto foi de 97,3% e a capacidade dinâmica de adsorção foi 0,39 mg de AcM/mL de gel devido. Este trabalho sugere a potencialidade de utilização do ligante OPS para a purificação dos anticorpos anti-Trypanosoma cruzi (IgG2a) / Abstract: Monoclonal antibodies (mAb) are immunoglobulins produced by lynphocyte B clones immortalized by the hibridoma technology. Those clones are cultivated in complex medium and generally produce low levels of mAb, interfering on purificaton steps. Since these antibodies are required for analytical and therapeutical purposes, the need of highly pure antibodies is imperative. Although they are usually purified by chromatografic techniques utilizing immobilized protein A ligands, different strategies for downstream processes have been studied to overcome the high costs of these conventional medias for industrial scale purposes. Aiming to contribute with the development of such processes, the anti-Trypanosoma cruzi mAb (IgG2a isotype) was investigated under chromatographic conditons twards the affinity ligand ortho-phospho-L-serine (OPS) immobilized onto agarose beads. It was observed that despite the fact this ligand has been reported as a chelating agent for the purification of immunoglobulins by IMAC technique, OPS presented low chelating capacity for Ni2+ and the metal complex formed adsorbed the desired protein within culture medium contaminants. It was also observed that under buffering conditions of Tris-HCl 50 mmol/L pH 7.0 OPS behaves as a selective ionic exchanger ligand for IgG2a when immobilized in CNBr activated agarose. On the other hand, when immobilized in bisoxirane activated agarose, OPS has shown that the presence of a spacer arm reduces the selectivity of the adsorbent. The mAb was recuperated in one single step with highly putity degree when operated with adsorption buffer Tris-HCl 50 mmol/L pH 7.0 and elution by increasing the ionic strength with the addition of NaCl 1.0 mol/L. The dynamic tests results showed that the efficiency for product recovery was 97.3% and the dynamic binding capacity was 0.39 mg of mAb/mL swollen agarose. This work suggests the potencial use os OPS ligand affinity for the purification of IgG2a antibodies anti-Trypanosoma cruzi in a single step / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T20:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Serracchiani_MarcelMafei_M.pdf: 2065791 bytes, checksum: 04a95a39ac0691a669c45efc9e3fc435 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A produção de proteínas recombinantes em plantas transgênicas tem se mostrado uma forma segura, eficiente e barata de obtenção em grande escala de várias proteínas de interesse, tais como vacinas, enzimas industriais, bioativos, biofarmacos e anticorpos e seus fragmentos. Contudo, para que a produção de proteínas recombinantes em plantas se torne viável é necessário o desenvolvimento de um processo de recuperação e separação da molécula alvo que seja eficiente e reprodutivo, pois a produção de biomoléculas em plantas transgênicas, assim como os métodos tradicionais de produção, apresentam componentes indesejáveis que devem ser removidos. Neste trabalho, avaliou-se a purificação de fragmentos Fab de IgG humana adicionados artificialmente (spiking) a extrato protéico de soja não transgênica utilizando-se a técnica de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Estudou-se o efeito dos quelatos IDA-Ni(II) e TREN-Ni(II), dos sistemas tamponantes Tris-HCl, fosfato de sódio e Mes, na presença e na ausência de sal (NaCl) na purificação de fragmentos Fab. Primeiramente foram realizados experimentos cromatográficos com as proteínas nativas do extrato proteico do grão de soja. Dos resultados obtidos, selecionou-se, para o adsorvente agarose-TREN-Ni(II), o sistema tamponante Tris-HCl/Tris-HCl na ausência de NaCl, e para o adsorvente agarose-IDA-Ni(II), selecionou-se o sistema tamponante fosfato de sódio/acetato de sódio contendo NaCl. Estes sistemas tamponantes e adsorventes foram utilizados para purificação dos fragmentos Fab adicionados (spiking) ao extrato proteico de grãos de soja. Em agarose-TREN-Ni(II), os fragmentos Fab foram purificados por cromatografia negativa, obtendo-se 66% dos fragmentos Fab na etapa de flowthrough e lavagem, com um grau de pureza de 91% e fator de purificação de 1,4. Para o adsorvente agarose-IDA-Ni(II), os fragmentos Fab foram purificados por cromatografia tradicional (eluição a pH 5,8), obtendo-se alto grau de pureza do fragmento Fab purificados, com um fator de purificação de 2,5. Este estudo contribuiu para obter conhecimento de base para posterior aplicação da técnica de IMAC na purificação de proteínas recombinantes produzidas em sementes de plantas transgênicas / Abstract: The recombinant proteins production using transgenic plants have been considered a safe, efficient and cheap way of producing on large scale innumerous proteins of interest, such as vaccines, industrial enzymes, bioactives, biopharmaceuticals and antibody and it fragments. However, for the production of recombinant proteins in plants become viable is necessary to develop a process for recovery and separation of the target molecule that is efficient and reproductive, because the production of biomolecules in transgenic plants, as well as traditional production methods, have components reactions which must be removed. In this work, the purification of Fab fragments of human IgG added artificially (spiking) to extract non-transgenic soy protein, using the technique of affinity chromatography on immobilized metal ions (IMAC), was evaluated. The effect of chelating agents IDA-Ni(II) and TREN-Ni(II), and the buffers Tris, sodium phosphate and Mes, in presence and the absent of NaCl, was studied for the Fab purification. First, the chromatographic experiments with the native proteins of soybean extract were performed. From the results obtained, it was selected, for the adsorbent TREN-Ni(II), the buffers system Tris-HCl/Tris-HCl without NaCl, and for the adsorbent IDA-Ni(II), the buffer system sodium phosphate/ sodium acetate with NaCl was selected. These adsorbents and buffer systems were used for purification of Fab fragments added (spiking) to soybean extract proteins. In the agarose adsorbent TREN-Ni (II), Fab fragments were purified by negative chromatography, obtaining 66% of Fab fragments in flowthrough and wash steps with a purity of 91% and purification factor of 1.4. For the adsorbent agarose-IDA-Ni (II), Fab fragments were purified by traditional chromatography (elution at pH 5.8), obtaining a high purity of the purified FAB, with a purification factor of 2.5. This study contributed to obtain knowledge base for application of the technique on the IMAC purification of recombinant proteins produced in transgenic plant seeds / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:38:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Serpa_Gisele_M.pdf: 3619704 bytes, checksum: 1feef42faa8bb785a83f4c9f481a438c (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Anticorpos monoc1onais são imunoglobulinas secretadas por uma célula híbrida, chamada hibridoma, que é fonnada pela fusão de um linfócito (produtor de anticorpos) e uma célula de mieloma, o que faz do hibridoma uma célula produtora de anticorpos virtualmente imortal. Os anticorpos monoc1onais têm sido utilizados nas áreas analítica e terapêutica, o que implica na necessidade de obtenção de anticorpos de alta pureza. Muitos estudos têm sido realizados visando a purificação de anticorpos monoc1onais, e destacam-se as técnicas de adsorção seletiva, como as cromatografias de troca iônica, hidrofóbicas e de a:f11Údade. Neste trabalho aplicou-se a cromatografia em membranas de álcool polietileno-vinílico, derivatizadas com ácido iminodiacético (IDA), com íons metálicos imobilizados na purificação de anticorpos monoc1onais IgGl a partir de sobrenadante de cultura celular. Para determinar as melhores condiçôes de adsorção e eluição, foram testados os íons Cu2+, Ni2+, Zn2+ e C02+, na presença de diferentes sistemas tamponantes. A seletividade dos metais, em cada um dos sistemas, foi determinada através de eletroforese SDS-PAGE e testes ELISA das frações dos picos de proteína obtidos. A melhor condição de purificação foi a alimentação de sobrenadante de cultura celular previamente precipitado e dialisado com solução de sulfato de amônio, em coluna contendo PEVA-IDA-Zn2+, em presença de tampão Tris-HCI 50 mM a pH 7,0 e eluição por aumento de concentração de Tris. A partir das isotermas de adsorção, determinou-se a capacidade máxima de adsorção e a constante de dissociação do complexo IDA­Zn2+-IgGl que de acordo com o ajuste dos parâmetros pelo modelo de Langmuir, mostraram uma alta capacidade de adsorção (63,4 mg/g de membrana seca) e uma constante de dissociação (8,lxlO-6 M) característica de sistemas de média afinidade. Foram também determinadas as curvas de ruptura para o processo proposto, através de experimentos de fIltração a diferentes vazões de alimentação, utilizando um módulo contendo as fibras ocas com Zn2+ imobilizado, construído em nosso laboratório / Abstract: Monoc1onal antibodies are immunoglobulins produced by a hybrid cell ca11ed hybridoma. These cells result from the fusion of lymphocytes with malignant myeloma cells. Hybridomas cells express both the lymphocyte's property of specific-antibody production and the immortal character of the myeloma cells. Monoc1onal antibodies have been used in analy1ica1 and therapeutica1 areas. This application needs high1y pure antibodies. Many techniques have been studied focusing monoc1onal antibodies purification. These techniques inc1ude ion exchange, hydrophobic and affinity chromatography. In this study, we applied polyethylenevinyl alcohol (PEV A) membranes in the purification of monoc1onal antibody from cell culture supem.atant. These membranes were derivatized with the quelant agent, iminodiacetic acid (IDA). We evaluated the adsorption and purification of monoc1onal antibodies on the matrix with different immobilized metal ios, Cu2+, Ni2+, Zn2+ and C02+ and with different buffers. According to SDS­PAGE electrophoresis and ELISA analysis, the higher selectivity was obtained in the presence of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,0 and with elution by increasing Tris concentration, with immobilized Zn2+, wich provided the purification of IgG with traces of albumin. The adsorbent capacity and the dissociation constant of the complex IDA-Zn2+-IgGI were determinated from adsorption isotherms. According to the Langmuir model, the results indicated that the matrix presents high adsorption capacity (63,4 mg/g de chy membrane) and a dissociation constant (8,1 x 10-6 M) characteristic for intermediate affinity systems. We also evaluated the breaktrough curves for PEVA-IDA-Zn2+ membrane chromatography for the antibodies purification using different flow rates. These breaktrough CUIVes are important to sca1e up procedure / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sônia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T14:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tsai_YuanMing_M.pdf: 3416327 bytes, checksum: d37231cf12f3af7bab5f7826907d5180 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O presente trabalho teve como objetivo principal, o estudo comparativo dos agentes quelantes CM-Asp e IDA no processo da purificação de IgG humana por cromatografia de afinidade por íon metálico cobalto imobilizado em diferentes sistemas tamponantes na presença e ausência do sal NaCl. Observou-se, para todos os sistemas tamponantes estudados, a adição de sal foi desfavorável em termos de capacidade e seletividade de adsorção de IgG para ambos os agentes quelantes. De acordo com eletroforeses SDS-PAGE e análises nefelométricas, os melhores resultados foram observados em presença de Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 para o quelato CM-Asp-Co2+ e fosfato de sódio 25 mmol/L com imidazol 2 mmol/L, pH 7,0 para o quelato IDA-Co2+, obtendo-se fatores de purificação de 8,1 e 4,1 e pureza de 100% e 96%, respectivamente. Foram determinadas as curvas de ruptura por meio de experimentos cromatográficos realizados a diferentes diluições do soro humano, os resultados obtidos evidenciaram uma maior eficiência em termos da capacidade de adsorção nas diluições a 5 e 10 vezes (0,89 e 1,03 mg de proteína total/mL gel) comparado a soro diluído a 2,5 vezes (0,40 mg de proteína total/mL gel), tendo estes demonstrado comportamentos similares ao apresentado em etapa cromatográfica. Os dados de adsorção de IgG foram bem representados pelo modelo de Langmuir-Freundlich, a 25ºC, fornecendo valor de Qm igual a 94,44 mg IgG/mL gel e constante de dissociação de 8,18 x 10-5 mol/L, ordem de grandeza característica para ligantes pseudobioespecíficos / Abstract: In this work, we targeted the comparative study between chelating ligands agarose-CM-Asp and agarose-IDA in the purification of human IgG by Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography (IMAC) with immobilized cobalt ion in different buffering systems in the presence or absence of salt. For all buffering systems the addition of salt was unfavorable in terms of adsorption capacity of IgG for both chelating ligands. The best results were obtained in the absence of salt. According to SDS-PAGE electrophoresis and nephelometric analysis, the best conditions observed were Tris-HCl 25 mmol/L, pH 7,0 for the agarose-CM-Asp and sodium phosphate 25 mmol/L with imidazole 2 mmol/L for the agarose-IDA (purification factor of 8,1 and 4,1 and purity of 100% and 96%, respectively). Chromatographic experiments were carried out with different dilutions of human serum to determine the breakthrough curves. The results showed a higher efficiency in terms of adsorption capacity at dilutions of 5 and 10 times (0.89 and 1.03 mg of protein Total / mL gel) compared to serum diluted 2.5 times (0.40 mg total protein / mL gel), these results had similar behaviors as those showed in the chomatografic stage. The adsorption data of IgG at 25ºC were well represented by Langmuir-Freundlich model. Values of Qm equal 94,44 mg of IgG/mL gel and dissociation constant of 8,18 x 10-5 mol/L, characteristic magnitude of pseudospecific ligands / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

O uso de DNA plasmidial (pDNA) visando a aplicações terapêuticas tem aumentado nos últimos anos. A cromatografia aparece como a técnica de purificação mais comum para obtenção de amostras de pDNA com o elevado grau de pureza exigido. Porém, as resinas cromatográficas disponíveis apresentam ainda uma série de desafios, nomeadamente no desenvolvimento de ligantes específicos e matrizes capazes de acomodar este tipo de molécula. Relativamente à apuração de novos ligantes, alguns estudos têm mostrado o potencial do aminoácido arginina para estabelecer interações específicas e preferenciais com o pDNA. Por outro lado, resinas monolíticas surgem como suportes interessantes devido às suas excelentes propriedades de transferência de massa e altas capacidades de adsorção. Neste estudo, diferentes ligantes baseados em arginina (arginina, di-arginina e tri-arginina) foram imobilizados em resinas de agarose previamente ativadas. Um primeiro estudo de adsorção em batelada foi realizado a fim de avaliar e compreender os mecanismos envolvidos no processo de adsorção dos ácidos nucleicos pDNA e RNA em resina com o aminoácido arginina. Na sequência, apresentamos uma proposta inovadora para o uso de ligantes de arginina em resinas de agarose, em um único passo de purificação em modo negativo a seguir ao passo de concentração por isopropanol. A capacidade da resina para o pDNA foi substancialmente maior do que a obtida para o mesmo tipo de resina no modo positivo, com notória vantagem de capacidade no uso de di-arginina face a arginina com rendimentos próximos de 100% do plasmídeo carregado. Os ligantes di-arginina e tri-arginina foram também imobilizados em resinas monolíticas. Em comparação com o aminoácido arginina, a imobilização dos homopeptídeos nas resinas monolíticas levou ao aumento da capacidade de adsorção (cerca de 2,5 vezes superior) e especicificidade de interações, mostrando-se como uma estratégia promissora para processos de purificação de pDNA. / The use of plasmid DNA (pDNA) for therapeutic applications has increased in recent years. Chromatography appears as the most common purification technique to obtain samples of pDNA with the high degree of purity required. However, the available chromatographic resins still present a series of challenges, namely in the development of specific ligands and matrices capable of accommodating this type of molecule. Regarding the determination of new ligands, several studies have shown the potential of the arginine amino acid to establish specific and preferential interactions with the pDNA. On the other hand, monolithic resins appear as interesting approaches due to their excellent mass transfer properties and high adsorption capacities. In this study, different arginine based ligands (arginine and di-arginine) were firstly immobilized on activated agarose resins. The first part of the work describes the adsorption equilibrium of plasmid DNA adsorption process, as well as the interaction with its main impurity (RNA) on arginine supports in a batch format, in order to compare and gather crucial information about adsorption mechanisms involved in this type of affinity system. Then, a new use for chromatographic bead matrixes based on arginine ligands was proposed, working as an adsorption matrix pDNA purification in negative mode after isopropanol concentration of the sample. The arginine based supports capacity for pDNA under negative mode for pDNA was substantially higher than that obtained with the same type of resin in the conventional positive mode, with a notable advantage of using di-arginine with recovery yields near 100%. The homopeptides (di-arginine and tri-arginine) were also immobilized on functionalized monolithic resins (BIA Separations, Slovenia). Effectively, the immobilization of the arginine homopeptides made the monolithic resins more functional compared to the (mono)arginine based resin, exhibiting greater binding capacities (around 2,5 times higher) and interaction intensities, proving to be a promising strategy for purification processes of pDNA.

O uso de DNA plasmidial (pDNA) visando a aplicações terapêuticas tem aumentado nos últimos anos. A cromatografia aparece como a técnica de purificação mais comum para obtenção de amostras de pDNA com o elevado grau de pureza exigido. Porém, as resinas cromatográficas disponíveis apresentam ainda uma série de desafios, nomeadamente no desenvolvimento de ligantes específicos e matrizes capazes de acomodar este tipo de molécula. Relativamente à apuração de novos ligantes, alguns estudos têm mostrado o potencial do aminoácido arginina para estabelecer interações específicas e preferenciais com o pDNA. Por outro lado, resinas monolíticas surgem como suportes interessantes devido às suas excelentes propriedades de transferência de massa e altas capacidades de adsorção. Neste estudo, diferentes ligantes baseados em arginina (arginina, di-arginina e tri-arginina) foram imobilizados em resinas de agarose previamente ativadas. Um primeiro estudo de adsorção em batelada foi realizado a fim de avaliar e compreender os mecanismos envolvidos no processo de adsorção dos ácidos nucleicos pDNA e RNA em resina com o aminoácido arginina. Na sequência, apresentamos uma proposta inovadora para o uso de ligantes de arginina em resinas de agarose, em um único passo de purificação em modo negativo a seguir ao passo de concentração por isopropanol. A capacidade da resina para o pDNA foi substancialmente maior do que a obtida para o mesmo tipo de resina no modo positivo, com notória vantagem de capacidade no uso de di-arginina face a arginina com rendimentos próximos de 100% do plasmídeo carregado. Os ligantes di-arginina e tri-arginina foram também imobilizados em resinas monolíticas. Em comparação com o aminoácido arginina, a imobilização dos homopeptídeos nas resinas monolíticas levou ao aumento da capacidade de adsorção (cerca de 2,5 vezes superior) e especicificidade de interações, mostrando-se como uma estratégia promissora para processos de purificação de pDNA. / The use of plasmid DNA (pDNA) for therapeutic applications has increased in recent years. Chromatography appears as the most common purification technique to obtain samples of pDNA with the high degree of purity required. However, the available chromatographic resins still present a series of challenges, namely in the development of specific ligands and matrices capable of accommodating this type of molecule. Regarding the determination of new ligands, several studies have shown the potential of the arginine amino acid to establish specific and preferential interactions with the pDNA. On the other hand, monolithic resins appear as interesting approaches due to their excellent mass transfer properties and high adsorption capacities. In this study, different arginine based ligands (arginine and di-arginine) were firstly immobilized on activated agarose resins. The first part of the work describes the adsorption equilibrium of plasmid DNA adsorption process, as well as the interaction with its main impurity (RNA) on arginine supports in a batch format, in order to compare and gather crucial information about adsorption mechanisms involved in this type of affinity system. Then, a new use for chromatographic bead matrixes based on arginine ligands was proposed, working as an adsorption matrix pDNA purification in negative mode after isopropanol concentration of the sample. The arginine based supports capacity for pDNA under negative mode for pDNA was substantially higher than that obtained with the same type of resin in the conventional positive mode, with a notable advantage of using di-arginine with recovery yields near 100%. The homopeptides (di-arginine and tri-arginine) were also immobilized on functionalized monolithic resins (BIA Separations, Slovenia). Effectively, the immobilization of the arginine homopeptides made the monolithic resins more functional compared to the (mono)arginine based resin, exhibiting greater binding capacities (around 2,5 times higher) and interaction intensities, proving to be a promising strategy for purification processes of pDNA.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo L. O. R. Cunha. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. / Nos últimos anos o rol de propriedades biológicas de compostos de selênio e de telúrio tem aumentado e outras atividades, além das bem descritas propriedades antioxidantes, também vêm sendo demonstradas. Neste contexto, a inibição enzimática promovida por espécies hipervalentes de selênio e telúrio (organocalcogenanas) foi relatada para cisteína proteases, tirosina fosfatases e o proteasoma, por exemplo. Esta inibição é resultado da particular reatividade que compostos hipervalentes de telúrio e selênio apresentam com tióis. Como a quantidade de biotióis reativos em sistemas celulares é vasta e nem todos estão disponíveis para ensaios in vitro com as organocalcogenanas, é possível vislumbrar a aplicação desses compostos como ligantes em cromatografia de afinidade para a identificação de proteínas reativas a esses compostos. Para atingir este objetivo foram utilizados organocalcogenetos derivados de benzaldeído. A estrutura dos ligantes é constituída por um grupo fenilcalcogenila ligado a um derivado de poliéter funcionalizado com um grupo amina que é ancorado à uma matriz de agarose. Foram preparadas duas classes de ligantes para a modificação de agarose que diferem na estrutura do espaçador, a primeira contém uma unidade de ácido succínico entre o organocalcogeneto e o derivado de poliéter (ligantes de Classe I) e a outra, isenta dessa unidade de ácido succínico, possui um grupo amino ionizável (ligantes catiônicos de Classe II). A rota de preparação dos ligantes de classe I envolveu uma sequencia sintética de seis etapas com rendimentos globais de 26% e 19% e os ligantes de Classe II foram preparados em uma sequencia de duas etapas com rendimentos globais de 43% e 22%, para os selenetos e teluretos, respectivamente. A oxido-redução do ligante de telúrio da classe II se mostrou rápido e satisfatório nos estudos preliminares, dando bons indícios para aplicação como ligante na cromatografia de afinidade. Por fim, os ligantes foram imobilizados na agarose funcionalizada com brometo de cianogênio e avaliados com papaína, utilizada como modelo de biotiol nesse trabalho. Notadamente os ligantes de telúrio apresentaram um comportamento distinto do que os de selênio quanto à eluição da papaína da matriz sólida, requerendo maior volume de solução com agente redutor para a eluição da proteína. Coletivamente os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que matrizes sólidas funcionalizadas com organocalcogenetos são funcionais para a retenção e liberação de biomoléculas tioladas (funcionalidade "catch & release"), abrindo perspectivas para o estudo mais aprofundado da interação entre calcogenetos com tióis e, ainda para produção, caracterização e estudo de aplicações de diversas matrizes funcionalizadas com organocalcogenetos. / In recent years the role of biological properties of selenium compounds and tellurium compounds has increased, and other activities besides the well-described antioxidant properties have also been demonstrated. In this context, enzymatic inhibition promoted by hypervalent species of selenium and tellurium have been reported for cysteine proteases and tyrosine phosphatases. This activity is due to the particular reactivity of thiols with the chalcogenides atom in their hypervalent state. Apart from these enzymes, one can envisage a plenty of other potential reactive thiols in cellular systems that are prone to react with organocalcogenuranes which are still unknown. As the identification of these unknown targets would be helpful to understand therapeutical and toxicological aspects of these compounds, efforts in this direction are required. One strategy for this purpose consists in using the affinity purification technique using organochalcogenides as ligands, this is proposed in the present work. To achieve this goal, the use of organochalcogenides derived from benzylamines as ligands in affinity chromatography. The structure of this ligands contains a phenylchalcogenide moiety, a polyether spacer group functionalized with an amino group to attach it to an agarose substrate. Two different spacer classes were prepared, the first has a succinic acid spacer between the organochalcogenide and the polyether (Class I ligand); the second class has the polyether moiety directly linked to the phenylchalcogenide group and has an ionizable secondary amine (Class II cationic ligand). The preparation route of the class I ligands involved a six-step synthetic sequence in overall yields of 26% and 19%, and the Class II ligands were prepared in a two-step sequence in global yields of 43% and 22% of the selenides and tellurides, respectively. The studied oxidation and reduction reactions of Class II tellurium ligands revealed fast processes, suitable for a practical application of these novel organochalcogenides in affinity chromatography. Finally, ligands were immobilized in cyanogen bromide activated agarose and the modified matrices evaluated with papain as a model biothiol. Noteworthy, the selenide ligands released papain promptly by washing the matrix with dithiothreitol solution whereas telluride ligands showed the opposite behavior. Collectively, the results presented in this work demonstrate that organochalcogenide-modified agarose is a new class of functional materials for the retention and release of biothiols presenting a "catch & release" functionality. This work brings new perspectives for a more detailed study of the interaction between chalcogenides with thiols and also to the production, characterization and the study of novel applications of organochalcogenide-modified solid matrices.

Orientador: Telma Teixeira Franco / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-28T03:46:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sousa_KathiaAssisde_M.pdf: 2724531 bytes, checksum: 3490f460776b8b8cf4564482c815165b (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Foram investigadas estabilidade frente a pH e temperatura e condições ótimas da enzima peroxidase do extrato bruto da casca da soja (Glycine max). Foi verificada a afinidade entre a enzima e íons cobre imobilizados no gel "Chelating Sepharose FastFlow" (CSFF) e também foi estudado o efeito do pH sobre a adsorção desta enzima. Foram construídas isotennas de adsorção para a peroxidase do extrato bruto de casca da soja e para as peroxidases padrão de soja e de nabo (horseradish), para verificar a capacidade máxima de adsorção do complexo CSFF-IDA-CU2+ para estas enzimas. Curvas de ruptura para a peroxidase do caldo bruto de casca da soja foram construídas para estudar a eficiência do complexo na adsorção da enzima. A purificação da peroxidase do extrato bruto da casca da soja foi estudada na coluna HR 5/5 empacotada com o complexo CSFF­IDA-CU2+ equilibrado com tampão fosfato de sódio O,IM a pH 6,0. Foi verificado que a peroxidase do extrato bruto da casca da soja apresentou condições ótimas de atividade a pH 4,5, mostrou-se estável por três horas em temperaturas entre 1 e 55°C. Foi observado que a adsorção mais seletiva da peroxidase do extrato bruto de casca da soja se deu a pH 6,0, quando 51% da enzima foi retida após dez minutos de contato entre a peroxidase e o complexo CSFF -IDA-Cu2+ a 25°C em tampão fosfato de sódio O,IM. A adsorção das peroxidases da casca da soja, padrão comercial de nabo e padrão comercial de soja no complexo CSFF-IDA-Cu2+ obedeceu ao modelo proposto por Langmuir. Com a construção das curvas de ruptura foi verificado que a pH 6,0 houve a melhor seletividade na separação da atividade de peroxidase, quando 96,9% de atividade foi recuperada. Na adsorção da peroxidase do extrato bruto da casca da soja na coluna HR 5/5 empacotada com CSFF-IDA-CU2+ a pH 6,0, foi obtido um fator de purificação de 5,9 vezes com um rendimento de 83,4% / Abstract: The conditions for the soybean hull peroxidase activity were investigated for pH and temperature. It was observed that the best pH for maximum activity was at 4.5, however the activity was only 5% reduced at pH values 5.0 and 5.5 and was 20% reduced for pH's between 6.0 and 7.0 and 45% reduced at pH 8.0. It was stable at this pH interval for four hours period, however, it lost 20% activity at pH 4.5 after one hour incubation. Best temperature for the enzyme active was 55 °C and it was stable from 1 to 55 °C for at least three hours. The affinity between the soybean hull peroxidase and copper ions immobilized in a solid matrix was investigated. The maximum capacity ofthe CSFF-IDA-CU2+ to interact with the enzyme was calculated by plotting the concentrations of the proxidase found in the liquid phase in equilibrium with the peroxidase concentrations found in the solid phase (isotherms). Breakthrough curves were built to study the efficiency ofCSFF-IDA-CU2+ bed to adsorb the peroxidase of soybean hulI and also two standards peroxidases commercially available from soybean and ITom horseradish. The effect of pH on the adsorption of the enzyme was also investigated and it was observed that the most selective adsorption of the soybean hulI peroxidase was at pH 6.0. Purification of the soybean hull peroxidase was studied in the column HR 5/5 packed with the complex CSFF-IDA-CU2+ in 100 mM phosphate buffer at pH 6.0. The adsorption of the soybean hull peroxidase, soybean and horseradish peroxidases by the CSFF-IDA-CU2+ was observed to folIow Langmuir model. The final peroxidase purified by the process developed in this work showed that the specific activity of the enzyme was about 5.9 fold higher than that of cru de extract and the yield was about 83.4% / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-25T09:14:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mourao_CeciliaAlves_M.pdf: 2559584 bytes, checksum: efe6b17b9b7e5ceb16ade74a6ae30629 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As imunoglobulinas G (IgG) e seus fragmentos Fab, F(ab)¿2 e Fv apresentam aplicações proeminentes nas áreas terapêuticas e de diagnósticos. Em determinadas situações em que a região Fc é dispensável e/ou deletéria, emprega-se preferencialmente fragmentos em relação à IgG não clivada. Tais aplicações requerem um elevado grau de pureza dessas biomoléculas. O elevado custo de obtenção de fragmentos pelas técnicas convencionais justifica a investigação de outras que possam proporcionar a obtenção dessas proteínas, combinando um menor custo com um elevado grau de pureza. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar a eficácia dos adsorventes agarose-CM-Asp-Ni(II), agarose-CM-Asp-Co(II), agarose-CM-Asp-Cu(II) e agarose-CM-Asp-Zn(II) na purificação dos fragmentos Fab de IgG humana policlonal, a partir de uma solução de IgG clivada pela enzima papaína. O efeito do sistema tamponante, do íon metálico e do cloreto de sódio foram avaliados. A seletividade das condições cromatográficas foi avaliada por eletroforese SDS-PAGE, Western Blotting e imunodifusão radial. Os resultados indicaram que nas cromatografias conduzidas com o quelato CM-Asp-Co(II) com Hepes e Tris-HCl, na ausência de sal, os fragmentos Fab foram obtidos separados do Fc nas frações de eluição. Nas cromatografias em CM-Asp-Ni(II) com Hepes e fosfato de sódio na presença de NaCl e em CM-Asp-Cu(II) com Tris-HCl e fosfato de sódio na presença de NaCl, a biomolécula alvo foi obtida seletivamente nas frações não retidas (cromatografia negativa). Nas cromatografias em CM-Asp-Zn(II) não houve a recuperação seletiva dos fragmentos Fab. Os resultados das curvas de ruptura com os quelatos CM-Asp-Ni(II), CM-Asp-Co(II) e CM-Asp-Cu(II) revelaram a recuperação de 3,4 mg, 17,1 mg e 8,6 mg de Fab, respectivamente. Os fragmentos Fab foram obtidos com pureza superior a 90%, sendo que para o ligante CM-Asp-Cu(II), segundo o western blot, os fragmentos Fab foram separados da IgG não clivada. Os resultados obtidos nas condições cromatográficas estudadas evidenciam a potencialidade do emprego dos quelatos CM-Asp-Ni(II), CM-Asp-Co(II) e CM-Asp-Cu(II), imobilizados em agarose, para purificação de fragmentos Fab obtidos da clivagem enzimática da IgG humana policlonal / Abstract: Immunoglobulins G (IgG) and their fragments Fab, F(ab)¿2 and Fv are prominently applied as therapeutic and diagnostic tool. Fragments are preferably used rather than the uncleaved IgG, specially when the Fc portion is dispensable or prejudicial. For the mentioned applications, high purity preparations are required. The high costs associated with the conventional downstream processing of these biomolecules is the driving force to investigate purification techniques that can combine lower cost with high purification factor. Therefore, the goal of this work is to evaluate and compare the efficiency of CM-Asp-Ni(II), CM-Asp-Co(II), CM-Asp-Cu(II) and CM-Asp-Zn(II) adsorbents in the purification of Fab fragments from papain-digested human IgG. The effects of buffers, metal-ion and NaCl addition were also studied. The adsorbent/buffer selectivity towards the targeted molecule was evaluated by SDS-PAGE, Western Blotting and radial immunodiffusion assays. Chromatography with CM-Asp-Co(II) as chelated using Hepes and Tris-HCl buffers resulted in Fab recovery in the elution fractions. Whereas the chromatography with CM-Asp-Ni(II) and CM-Asp-Cu(II) both as chelated using Hepes sodium phosphate buffers with NaCl addition resulted in Fab selective recovery in non-retained fractions (negative chromatography). The adsorbent CM-Asp-Zn(II) did not show Fab selective recovery. Breakthrough curves experiments with CM-Asp-Ni(II), CM-Asp-Co(II) e CM-Asp-Cu(II) showed recovery of 3.4 mg, 17.1 mg and 8.6 mg of Fab, respectively. Fab fragments were recovered with purity higher than 90%. When chelated CM-Asp-Cu(II) was use as ligand, Fab fragments were recovery separated from intact IgG as shown in western blot. Results obtained in the chromatographic conditions studied showed the potential use of CM-Asp-Ni(II), CM-Asp-Co(II) and CM-Asp-Cu(II) immobilized in agarose for the purification of Fab fragments from cleaved human polyclonal IgG / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestra em Engenharia Química

O BPP-10c é um decapeptídeo bioativo, rico em resíduos de prolina e é expresso em uma proteína precursora no cérebro e na glândula de veneno da Bothrops jararaca. Recentemente demonstramos que o BPP-10c tem um potente e sustentado efeito anti-hipertensivo em ratos espontaneamente hipertensos (SHR), sem, no entanto, causar qualquer efeito em ratos normotensos, por um mecanismo farmacológico independente da inibição da enzima conversora de angiotensina (ECA), levando à hipótese de que outro mecanismo poderia estar envolvido na atividade do peptídeo. Neste trabalho, usamos cromatografia de afinidade para isolar e identificar as proteínas renais com afinidade pelo BPP-10c e demonstramos que a argininosuccinato sintase (AsS) é a principal proteína a se ligar ao peptídeo. Além disso, mostramos que essa interação promove um aumento na atividade catalítica da enzima, de forma dose-dependente. A AsS é reconhecida como uma peça chave na regulação do ciclo da citrulina-óxido nítrico (NO), e sua ação é passo limitante na síntese de NO. A interação funcional do BPP-10c com a AsS foi evidenciada pelos seguintes efeitos promovidos pelo peptídeo: i) estimulação da produção de NO por células HUVEC e da produção de arginina por células HEK 293, ii) aumento da concentração plasmática de arginina em SHR. Corroborando esses achados, mostramos a reversão dos efeitos do peptídeo, inclusive sobre a pressão arterial em SHR, quando o MDLA, um inibidor específico da AsS, foi co-administrado. Em conjunto, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que a AsS é fundamental para o efeito anti-hipertensivo do BPP-10c. Tais resultados nos levaram a propor a AsS como um novo alvo terapêutico, e o BPP-10c como molécula-líder para a geração de medicamentos para tratamento de doenças relacionadas à hipertensão arterial / BPP-10c is a bioactive proline-rich decapeptide, part of the C-type natriuretic peptide precursor, expressed in the brain and in the venom gland of Bothrops jararaca. We recently showed that BPP-10c displays a strong, sustained anti-hypertensive effect in spontaneous hypertensive rats (SHR), without causing any effect in normotensive rats, by a pharmacological mechanism independent of angiotensin converting enzyme inhibition; therefore, we hypothesized that another mechanism should be involved in the peptide activity. Here we used affinity chromatography to search for kidney cytosolic proteins with affinity for BPP-10c and demonstrate that argininosuccinate synthetase (AsS) is the major protein binding to the peptide. More importantly, this interaction activates the catalytic activity of AsS in a dose-dependent manner. AsS is recognized as an important player of the citrulline-nitric oxide (NO) cycle that represents a potential limiting step in NO synthesis. Accordingly, the functional interaction of BPP-10c and AsS was evidenced by the following effects promoted by the peptide: i) increase of NO production in human umbilical vein endothelial cell culture, and of arginine in human embryonic kidney cells; ii) increase of arginine plasma concentration in SHR. Moreover, MDLA, a specific AsS inhibitor, significantly reduced the anti-hypertensive activity of BPP-10c in SHR. These results led us to suggest AsS as a new therapeutically useful target for the development of activators, such as BPP- 10c, useful to treat hypertension related diseases