Die Inositolmonophosphatase (IMPase) reguliert als Schlüsselenzym des Phosphatidyl-Inositol-Signalwegs den Abbau des second messenger Inositoltrisphophat (IP3). Als wahrscheinliche molekulare Zielstruktur in der Behandlung der Bipolar Affektiven Störung ist die Erforschung der Regulation der IMPase von hoher medizinischer Relevanz. Seit Jahrzehnten werden Lithiumsalze, die die IMPase in therapeutischen Konzentrationen hemmen, in der Prophylaxe manischer Phasen eingesetzt. Die Therapie mit Lithiumsalzen birgt jedoch die Gefahr zahlreicher schwerwiegender Nebenwirkungen. Außerdem besitzt das Medikament eine geringe therapeutische Breite. Dies macht die Untersuchung alternativer Regulationsmöglichkeiten der IMPase als möglichem Ansatzpunkt für neue pharmakologische Therapien der Bipolar Affektiven Störung hochinteressant. In den letzten Jahren mehrten sich die Hinweise auf eine Regulation der IMPase durch Ca2+-bindende Proteine. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels verschiedener in vitro-Methoden der Einfluss der Ca2+-bindenen Proteine Calbindin D28k (CB) sowie Calmodulin (CaM) auf die Enzymaktivität der IMPase untersucht. Hierzu wurden die Proteine heterolog in E. coli exprimiert und ein Phosphat-Akkumulationsassay zur Untersuchung der Enzymaktivität der IMPase etabliert. Für die funktionellen Untersuchungen mit CB konnte eine signifikante Steigerung der Aktivität der IMPase nachgewiesen werden. Im Vorfeld der funktionellen Untersuchungen der Enzymaktivität mit CaM konnte eine Ca2+-abhängige Bindung von CaM an die IMPase mittels zweier unabhängiger Experimente gezeigt werden. Da die freie Ca2+-Konzentration einen hemmenden Einfluss auf die Aktivität der IMPase hat, wurde die Ca2+-Bindung durch CaM mit einem Fluoreszenz-Assay kontrolliert. Hierdurch konnten die funktionellen Experimente mit CaM unter genau definierten Ca2+-Konzentrationen durchgeführt werden. In den funktionellen Untersuchungen mit CaM zeigte sich keine Modulation der IMPase. Weiterführende Experimente sollten der Identifizierung möglicher zusätzlicher Interaktionspartner der IMPase dienen. Dazu würden sich Immunpräzipitationsexperimente anbieten. Außerdem sollte eine Untersuchung der Interaktion zwischen IMPase und CaM in einem eukaryotischen Zellsystem erfolgen. Dies würde eine Aussage unter physiologischen Bedingungen ermöglichen.

Behavioral responses to social odors in Syrian hamsters are regulated by brain structures including the medial amygdala (Me) and bed nucleus of the stria terminalis (BNST). The role of these areas in regulating social behaviors has been previously studied in detail. However, the chemical phenotypes of neurons in these areas have not been well defined. Based on previous literature, we hypothesize that there is an increase in Me GABAergic signaling in response to social odors in male hamsters. To test this, we quantified colocalization of Calbindin and Fos in the Me of male hamsters after odor exposure. There were no significant differences in the percentage of Fos+ cells that were CB+ between odor conditions, but the percentage of CB+ cells that were Fos+ was higher in subjects exposed to conspecific odors versus clean odors. This implies that CB+ neurons transmit social information in the Me of male hamsters.

Neurodegeneration in Alzheimer's disease is characterised by multiple pathologies including disrupted calcium homeostasis and elevated Zn2+ levels. Calbindin D28k (CB-D28k), which buffers Ca2+ and can bind Zn2+, was suspected to be involved in these abnormalities. The PDB structure of this EF-hand protein shows that not all hands are well formed. Docking and molecular dynamics calculations were employed to achieve the two goals in this project. The first goal was to get a better structure of CB-D28k to improve our understanding of its behavior. Calculations improved the structure protein: helix-loop-helix sequences were formed in all hands and most canonical interactions were formed in the four functional hands. The second goal was to test the Ca2+ binding capacity of Zn2+-bound CB-D28k. Analysis of calculated structures showed that the Ca2+ binding capability of Zn2+ bound protein was significantly compromised, permitting only half of the correct canonical interactions with the loop residues.

Neurodegeneration in Alzheimer's disease is characterised by multiple pathologies including disrupted calcium homeostasis and elevated Zn2+ levels. Calbindin D28k (CB-D28k), which buffers Ca2+ and can bind Zn2+, was suspected to be involved in these abnormalities. The PDB structure of this EF-hand protein shows that not all hands are well formed. Docking and molecular dynamics calculations were employed to achieve the two goals in this project. The first goal was to get a better structure of CB-D28k to improve our understanding of its behavior. Calculations improved the structure protein: helix-loop-helix sequences were formed in all hands and most canonical interactions were formed in the four functional hands. The second goal was to test the Ca2+ binding capacity of Zn2+-bound CB-D28k. Analysis of calculated structures showed that the Ca2+ binding capability of Zn2+ bound protein was significantly compromised, permitting only half of the correct canonical interactions with the loop residues.

Die Inositolmonophosphatase (IMPase) reguliert als Schlüsselenzym des Phosphatidyl-Inositol-Signalwegs den Abbau des second messenger Inositoltrisphophat (IP3). Als wahrscheinliche molekulare Zielstruktur in der Behandlung der Bipolar Affektiven Störung ist die Erforschung der Regulation der IMPase von hoher medizinischer Relevanz. Seit Jahrzehnten werden Lithiumsalze, die die IMPase in therapeutischen Konzentrationen hemmen, in der Prophylaxe manischer Phasen eingesetzt. Die Therapie mit Lithiumsalzen birgt jedoch die Gefahr zahlreicher schwerwiegender Nebenwirkungen. Außerdem besitzt das Medikament eine geringe therapeutische Breite. Dies macht die Untersuchung alternativer Regulationsmöglichkeiten der IMPase als möglichem Ansatzpunkt für neue pharmakologische Therapien der Bipolar Affektiven Störung hochinteressant. In den letzten Jahren mehrten sich die Hinweise auf eine Regulation der IMPase durch Ca2+-bindende Proteine. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels verschiedener in vitro-Methoden der Einfluss der Ca2+-bindenen Proteine Calbindin D28k (CB) sowie Calmodulin (CaM) auf die Enzymaktivität der IMPase untersucht. Hierzu wurden die Proteine heterolog in E. coli exprimiert und ein Phosphat-Akkumulationsassay zur Untersuchung der Enzymaktivität der IMPase etabliert. Für die funktionellen Untersuchungen mit CB konnte eine signifikante Steigerung der Aktivität der IMPase nachgewiesen werden. Im Vorfeld der funktionellen Untersuchungen der Enzymaktivität mit CaM konnte eine Ca2+-abhängige Bindung von CaM an die IMPase mittels zweier unabhängiger Experimente gezeigt werden. Da die freie Ca2+-Konzentration einen hemmenden Einfluss auf die Aktivität der IMPase hat, wurde die Ca2+-Bindung durch CaM mit einem Fluoreszenz-Assay kontrolliert. Hierdurch konnten die funktionellen Experimente mit CaM unter genau definierten Ca2+-Konzentrationen durchgeführt werden. In den funktionellen Untersuchungen mit CaM zeigte sich keine Modulation der IMPase. Weiterführende Experimente sollten der Identifizierung möglicher zusätzlicher Interaktionspartner der IMPase dienen. Dazu würden sich Immunpräzipitationsexperimente anbieten. Außerdem sollte eine Untersuchung der Interaktion zwischen IMPase und CaM in einem eukaryotischen Zellsystem erfolgen. Dies würde eine Aussage unter physiologischen Bedingungen ermöglichen.

Since the development of knockout and transgenic mouse models, mice have become the most widely used mammalian animal model to study bone. Despite the advances in knowledge of bone biology and function that have occurred from use of mouse models, many studies use primarily qualitative techniques, which may result in overlooking important subtle pathophysiologic changes. The hypothesis of this dissertation is that quantitative techniques to measure bone structure and function could identify the physiologic role of carbonic anhydrase II and calbindin-D28k in mouse bone, despite earlier qualitative studies indicating mice without these proteins have normal bone structure and function. Furthermore, a method to quantify bone function in vivo will be tested in a mouse model.Although carbonic anhydrase II deficient mice are less severely affected than patients, the mice demonstrate features of osteopetrosis including metaphyseal widening and a 50% increase in trabecular bone volume. The mice partially compensate for inhibited osteoclast function by increasing osteoclast number.Calbindin-D28k knockout mice demonstrated an increase in bone volume that results from additional bone at the endosteal surfaces. The higher bone volume results in increased stiffness and failure loads, highlighting the potential use of drugs that inhibit calbindin-D28k to treat diseases such as osteoporosis.Finally, calcium phosphate ceramic and hydroxyapatite particles used as strain gauge coatings demonstrated bone bonding to mouse femora after two months in vivo. The use of hydroxyapatite particles to coat strain gauges is the first time this method has been used with all commercially available materials, and will allow other research groups to use this technique. The major limitation to in vivo bone strain measurement in mice is the relatively large size of the sensors, which resulted in increased second moments of inertia in the implanted bones.Overall, this dissertation demonstrates that the use of quantitative techniques, including histology, histomorphometry, µCT imaging, and mechanical testing can measure subtle changes in bone properties that have been previously overlooked. Development of additional quantitative methods to study bone biomechanics in mouse models may encourage other research groups to quantify bone properties if no changes are noted using primarily qualitative methods.

The eggshell of oviparous lizards is a significant source of calcium for embryos, whereas the eggshell of viviparous lizards, when present, contains little calcium. In view of the potential cost to embryonic nutrition occasioned by the loss of eggshell calcium, the large number of independent origins of viviparity among lizards is surprising. Concomitant evolution of viviparity and calcium placentotrophy would ameliorate the loss of eggshell calcium, but a mechanism linking these events has yet to be discovered. Zootoca vivipara, a lizard with geographic variation in its mode of parity, is an excellent model for studying mechanisms of calcium transport to oviparous and viviparous embryos because each is highly dependent on calcium secreted by the uterus (eggshell or placenta) and ontogenetic patterns of embryonic calcium mobilization are similar. We compared developmental expression of the calcium transport protein calbindin-D 28K in yolk splanchnopleure and chorioallantoic membranes of oviparous and viviparous embryos to test the hypothesis that the mechanism of calcium transport does not differ between modes of parity. We found that the ontogenetic pattern of protein expression is similar between reproductive modes and is correlated with calcium uptake from yolk and either eggshell or placenta. Calbindin-D 28K is localized in the chorionic epithelium of embryos of both reproductive modes. These findings suggest that the embryonic calcium transport machinery is conserved in the transition between reproductive modes and that an adaptation of oviparous embryos for calcium uptake from eggshells functions similarly to transport calcium directly from uterine secretions.

The chorioallantoic membrane resides adjacent to either the inner surface of the egg shell or uterine epithelium in oviparous and viviparous reptiles, respectively. Chorionic cells face the shell or uterine epithelium and transport calcium to underlying embryonic capillaries. Calcium transport activity of the chorioallantois increases in the final stages of development coincident with rapid embryonic growth and skeletal ossification. We excised embryos from viviparous Zootoca vivipara females at a stage prior to significant calcium accumulation and incubated them ex utero with and without calcium to test the hypothesis that chorioallantois calcium transport activity depends on developmental stage and not calcium availability. We measured calcium uptake by monitoring incubation media calcium content and chorioallantois expression of calbindin-D28K, a marker for transcellular calcium transport. The pattern of calcium flux to the media differed by incubation condition. Eggs in 0 mM calcium exhibited little variation in calcium gain or loss. For eggs in 2 mM calcium, calcium flux to the media was highly variable and was directed inward during the last 3 days of the experiment such that embryos gained calcium. Calbindin-D28K expression increased under both incubation conditions but was significantly higher in embryos incubated with 2 mM calcium. We conclude that embryos respond to calcium availability, yet significant calcium accumulation is developmental stage dependent. These observations suggest the chorioallantois exhibits a degree of functional plasticity that facilitates response to metabolic or environmental fluctuations.

Die Neurone der Hirnrinde sind in Mikroschaltkreisen, Modulen und Arealen organisiert. In dieser Doktorarbeit habe ich die Neurobiologie und Hirnrindenstruktur der Etruskerspitzmaus - ein neues Modelltier für neurobiologische Forschung - und die modulare Struktur des entorhinalen Kortex der Ratte untersucht. Die geringe Größe des Gehirns der Etruskerspitzmaus bietet besondere Vorteile für das Verständnis kortikaler Aktivität von Zellgruppen. Die entorhinale Kortex enthält sowohl gut definierte funktionelle als auch anatomische Module und bietet daher eine einzigartige Gelegenheit für das Studium ihrer Wechselbeziehungen. Die Organisation der Hirnrinde der Etruskerspitzmaus reflektiert die Spezialisierung als schnelle, auf taktile Reize spezialisierte Jäger. Mehrere kortikale Regionen, die ein Drittel des kortikalen Volumens ausmachen, reagieren auf taktile Reize. Eine kortikale Hemisphäre enthält nur etwa eine Million Neuronen. Basierend auf der Zellarchitektur und histochemischen Färbungen haben wir 13 kortikale Regionen definiert - eine große Zahl angesichts der geringen Größe des Spitzmausgehirns. Pyramidenzellnester in Schicht 2 des medialen entorhinalen Kortex sind einfach zu identifizieren und eignen sich als Bezugssystem für die verschiedenen modulären Strukturen dieser Hirnregion. Diese Pyramidenzellen bündeln ihre Dendriten hin zu einem Punkt, der sich mit erhöhten Konzentrationen von präsynaptischen cholinergen Markern überschneidet. Cholinerge Transmission ist ein wichtiger Bestandteil des Theta-Rhythmus und unsere Ergebnisse zeigen, daß Pyramidenzellen im Vergleich zu Sternzellen doppelt so stark Theta-moduliert sind. Da fast alle Gitterzellen stark Theta-moduliert sind, ist anzunehmen dass Pyramidenzellen eine wichtige Rolle für die räumliche Navigation spielen. In dieser Arbeit wurden an der Hirnrinde der Etruskerspitzmaus sowie der entorhinalen Hirnrinde der Ratte modellhaft Struktur-Funktions-Beziehungen in der Großhirnrinde aufgeklärt. / Neurons of the cerebral cortex are collectively organized into microcircuits, modules and cortical areas. Here, I study the neurobiology and cortical structure of the Etruscan shrew - a new model animal for neurobiological research - and the modular structure of the entorhinal cortex of the rat. The small size of the Etruscan shrew''s brain offers particular advantages for understanding cortical activity at the multi-cell level, due to its small number of cortical neurons and its intrinsic advantages for optical imaging approaches. The entorhinal cortex contains well-defined functional and anatomical modules and provides a unique opportunity for studying their interrelation. The organization of the cerebral cortex of the Etruscan shrew reflects their behavioral specialization as fast touch-and-kill hunters. Several cortical areas comprising a third of the cortical volume respond to vibrissal touch. One cortical hemisphere contains only about 1 million neurons. Cytoarchitecture and histochemical staining revealed 13 cortical regions - a large number considering the small size of the shrew''s brain. Pyramidal cell clusters in layer 2 of medial entorhinal are reliably identifiable and thus provide common anatomical framework for entorhinal cortex modularity. These cells form geometrically arranged clusters and bundle their dendrites towards a common point overlapping with presynaptic markers of cholinergic inputs. Cholinergic drive is an important component of theta-rhythmicity which we found to be two-fold stronger in pyramidal than in stellate neurons. Since nearly all grid cells are strongly theta modulated, we suggest that pyramidal cells may play an important role in microcircuits for spatial navigation. In this work, we studied the areal architecture of the Etruscan shrew cortex and the modular architecture of the rat medial entorhinal cortex as contributions towards understanding structure-function relations in the cerebral cortex.

In dieser Arbeit werden Struktur-Funktionsbeziehungen in der medialen entorhinalen Hirnrinde untersucht. Schicht 2 Neurone im medialen entorhinalen Cortex unterteilen sich in calbindin-positive Pyramidenzellen und calbindin-negative Sternzellen. Calbindin-positive Pyramidenzellen bündeln ihre apikalen Dendriten zusammen und formen Zellhaufen, die in einem hexagolen arrangiert sind. Das Gitter von calbindin-positiven Pyramidenzellhaufen ist an Schicht 1 Axonen und dem Parasubiculum ausgerichtet und wird durch cholinerge Eingänge innerviert. Calbindin-positive Pyramidenzellen zeigen stark theta-modulierte Aktivität. Sternzellen sind vertreut in der Schicht 2 angeordnet und zeigen nur schwach theta-modulierte Aktivität, ein Befund, der gegen eine Rolle von zell-intrinsischen Oszillationen in der Entstehung von Theta-Modulation spricht. In der Arbeit wurden Methoden entwickelt, um durch die juxtazelluläre Färbung und Identifikation von Zellen, die räumlichen Feuermuster von Schicht 2 Sternzellen und Pyramidenzellen zu bestimmen. Insbesondere wird gezeigt, dass die zeitlichen Feuermuster von Sternzellen und Pyramidenzellen so unterschiedlich sind, dass auch Daten von nichtidentifizierten extrazellulär abgeleiteten Zellen Sternzellen und Pyramidenzellen zugeordnet werden können. Die Ergebnisse zeigen, dass Gitterzell (engl. grid cell) Feuermuster relativ selten sind und in der Regel in Pyramidenzellen beobachtet werden. Grenzzell (engl. border cell) Feuermuster sind dagegen meistens in Sternzellen zu beobachten. Weiterhin wurde die Anatomie und Physiologie des Parasubiculums untersucht. Die Ergebnisse deuten auf die Existenz eines hexagonalen ‘Gitterzell-gitters’ in der entorhinalen Hirnrinde hin und sprechen für starke Struktur-Funktionsbeziehungen in diesem Teil der Hirnrinde. / Little is known about how medial entorhinal cortical microcircuits contribute to spatial navigation. Layer 2 principal neurons of medial entorhinal cortex divide into calbindin-positive pyramidal cells and dentate-gyrus-projecting calbindin-negative stellate cells. Calbindin-positive pyramidal cells bundled dendrites together and formed patches arranged in a hexagonal grid aligned to layer 1 axons, parasubiculum and cholinergic inputs. Calbindin-positive pyramidal cells were strongly theta modulated. Calbindin-negative stellate cells were distributed across layer 2 but avoided centers of calbindin-positive pyramidal patches, and were weakly theta modulated. We developed techniques for anatomical identification of single neurons recorded in trained rats engaged in exploratory behavior. Furthermore, we assigned unidentified juxtacellular and extracellular recordings based on spike phase locking to field potential theta. In layer 2 of medial entorhinal cortex, weakly hexagonal spatial discharges and head direction selectivity were observed in both cell types. Clear grid discharges were predominantly pyramidal cells. Border cells were mainly stellate neurons. Thus, weakly theta locked border responses occurred in stellate cells, whose dendrites sample large input territories, whereas strongly theta-locked grid discharges occurred in pyramidal cells, which sample small input territories in patches organized in a hexagonal ‘grid-cell-grid’. In addition, we investigated anatomical structures and neuronal discharge patterns of the parasubiculum. The parasubiculum is a primary target of medial septal inputs and parasubicular output preferentially targeted patches of calbindin-positive pyramidal cells in layer 2 of medial entorhinal cortex. Parasubicular cells were strongly theta modulated and carried mostly head-direction and border information, and might contribute to shape theta-rhythmicity and the (dorsoventral) integration of information across entorhinal grid scales.