O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / Los camélidos poseen tres subclases de Inmunoglobulina G (IgG): IgG1, IgG2 e IgG3. Las dos últimas, carecen de cadena liviana, conociéndose como anticuerpos de cadena pesada (AcCP). Su sitio de unión al antígeno, formado por los dominios variables de las cadenas pesadas, posee un peso molecular de 15 kDa, pudiendo generarse biotecnológicamente (nanobody). Este hecho facilita su producción, biodistribución, penetración tisular y neutralización de proteínas de membrana que participan en el proceso de infectividad. La proteína Calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) participa en la infectividad y evasión del sistema inmune por parte del parásito. Nanobodies anti-TcCRT podrían ser utilizados para disminuir su infectividad. En este contexto, previamente, dos llamas (Lama glama) inmunizadas con TcCRT recombinante (rTcCRT) produjeron un suero anti-rTcCRT. Con el fin de averiguar qué subclase de IgG es responsable de esta reactividad, esta Memoria de Título propuso determinar la(s) subclase(s) de IgG que reconocen rTcCRT en estos sueros inmunes. Para ello, se generó una columna de sefarosa unida a rTcCRT en la que se incubaron los sueros inmunes de ambas llamas, obteniéndose fracciones purificadas cuya reactividad anti-rTcCRT fue comprobada mediante Western Blot. Los sueros purificados fueron cargados en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio al 12%, en condiciones reductoras y no reductoras, que se tiñeron con azul de Coomassie. Se observaron bandas cuyo peso molecular concuerda con IgG1. Se concluye, que las llamas inmunizadas produjeron IgG1 contra rTcCRT, sin embargo, para comprobar la generación de IgG2 e IgG3 se requerirán estudios adicionales / The camelids have three subclasses of immunoglobulin G (IgG): IgG1, IgG2 and IgG3. IgG2 and IgG3 lack of a light chain, called heavy chain antibodies (HCAbs). The site of binding to the antigen consists of the variable domains of both heavy chains and has a molecular weight of 15 kDa, being possible to generate it biotechnologically (nanobody). This fact allows its easy production, better biodistribution, tissue penetration and neutralizaztion of membrane proteins participating in the infectious process. Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT) is a protein involved in the infectivity and evasion of the host immune system. Nanobodies anti-TcCRT could be used to decrease the parasite infectivity. In this context, previously, two immunized llamas (Lama glama) with recombinant TcCRT (rTcCRT) produced an anti-rTcCRT serum. To find out the subclass of IgG responsible of this reactivity, this Undergraduate Thesis proposed to determine the IgG subclass(es) of IgG (IgG1, IgG2 and IgG3) able to recognize rTcCRT in these immune sera. For this, it was generated a Sepharose column linked to rTcCRT in which were incubated both llama immune sera. We obtained purified anti-rTcCRT fractions whose reactivity were tested by Western Blot. Purified sera were loaded on a 12% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate under reducing and non-reducing conditions and stained with Coomassie blue. Observed bands were consistent with the molecular weight of IgG1. In conclusion, both immunized llamas produced IgG1 against rTcCRT, however, additional studies may be performed to demonstrate the generation of IgG2 and IgG3

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La calreticulina (CRT) es una proteína chaperona del retículo endoplásmico, que está ampliamente distribuida en las células eucariotas. Diversos estudios in vitro e in vivo han demostrado que la CRT tiene un importante rol en la cicatrización de heridas cutáneas y diversos procesos asociados con la reparación cutánea, como la proliferación y migración celular. La CRT está constituida por tres dominios distintos, estructural y funcionalmente hablando, donde el dominio P y C contienen sitios de interacción con calcio y el dominio N contiene una secuencia de señal dirigida al retículo endoplásmico. Asimismo, se sabe que el dominio "N" es el responsable del efecto antiangiogénico y antitumoral descrito para ésta proteína, y el subdominio "S" de la inhibición de la vía clásica del sistema del complemento humano. Sin embargo, no han sido determinados aún los dominios específicos de CRT implicados en el proceso de cicatrización de heridas. El objetivo principal de esta memoria de título fue analizar los dominios responsables de la proliferación y migración celular, lo cual se realizó comparando el efecto de Calreticulina de Trypanosoma cruzi recombinante (rTcCRT) con dos de sus dominios (N y S), en cicatrizaciones de heridas in vitro, con fibroblastos dérmicos de ratas. rTcCRT completa indujo un mayor porcentaje de migración celular en comparación a los dominios N y S. Por otro lado, los dominios N y N+S indujeron mayor aumento en el número de células viables. Estos resultados sugieren que el dominio N-terminal de rTcCRT es el que estimula proliferación celular y el dominio C, es el posible responsable de la inducción de migración celular generada por rTcCRT. / Calreticulin (CRT) is a chaperone protein of the endoplasmic reticulum, which is widely distributed in eukaryotic cells. Various studies in vitro and in vivo have shown that CRT plays an important role in wound healing and various processes associated with skin repair, such as wound cell proliferation and migration. CRT is comprised of three distinct structural and functionally speaking domains, where P and C domain contain calcium interaction sites and N domain contains a signal sequence to the endoplasmic reticulum. It is also known that the "N" domain it is responsible for the anti-angiogenic and antitumor effect described for this protein, and "S" subdomain of the inhibition of classical pathway of human complement system. However, they have not yet been determined CRT specific domains involved in the wound healing process. The main aim of this research was to analyze the responsible domains for cell proliferation and migration, this was done comparing the effect of the recombinant Trypanosoma cruzi Calreticulin (rTcCRT) and their two domains, N and S, in scarring wounds in vitro, with rat dermal fibroblasts. Complete rTcCRT showed a higher percentage of cell migration compared to N and S domains. On the other hand, N and N+S domains induced grater increase in the number of viable cells. These results suggest that the N-terminal domain stimulates cell proliferation and C-domain, is possible responsible for the induction of cell migration by rTcCRT. / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 11130257.

Memoria para optar el título de Bioquímico / En Chile, la tasa de mortalidad por enfermedades oncológicas ha ido aumentando año a año, siendo las cifras cada vez más preocupantes. Es por eso, que cualquier aporte que pueda hacerse en este ámbito puede ser fundamental para combatir el cáncer. Uno de los frentes de lucha dentro de la ciencia es la Inmunología, que, mediante la comprensión de los procesos de defensa del cuerpo contra distintos patógenos o agentes causales de enfermedades, estudia como contrarrestar los mecanismos tumorales de evasión inmune. Dentro del Sistema Inmune (SI) una función fundamental la cumplen las células Natural Killers (NK), componentes principales de la respuesta inmune innata antitumoral. Distintos tumores han desarrollado estrategias para evadir esta respuesta. En este contexto, NKG2D representa uno de los receptores más importantes en la inducción de la respuesta de citotoxicidad por parte de NK humanas. Los principales ligandos de NKG2D humano, NKG2DL, son moléculas no clásicas del complejo principal de histocompatibilidad de clase I, MICA y MICB, que corresponden a la cadena relacionada al MHC clase I (MIC), y se expresan en la superficie de tumores, células infectadas por virus y estresadas. Pese a la existencia de estos ligandos en la superficie del tumor, que alertan al SI de la existencia de éste, existen mecanismos oncológicos con los cuales se logra evadir la inmunovigilancia. Son varias las formas por las que ocurre este proceso. Se ha descrito la participación de citoquinas que estarían disminuyendo la expresión de los NKG2DL en la superficie, o metalopreoteasas que los cortarían liberándolos al medio, procesos que tendrían una relación directa con la disminución del ataque de las células NK al tumor. Al respecto, en nuestro laboratorio hemos detectado que IL-10 disminuye la expresión de MICA en la superficie de las células de melanoma. Además, creemos que otra forma por la cual el tumor podría estar evadiendo la inmunovigilancia por parte de las células NK, sería a través de la retención de los NKG2DL en el interior de la célula tumoral blanco. Al respecto creemos que una candidata a estar involucrada en el proceso es Calreticulina (Crt), que forma parte del complejo de proteínas chaperonas, Calnexina-Calreticulina-ERp57, involucradas en el procesamiento de las moléculas MHC-I. Crt es una molécula chaperona del Retículo Endopasmático (RE) presente en todas las células del organismo, y cuya función fundamental es unir Calcio y participar en el procesamiento de glicoproteínas. Se ha visto que la sobreexpresión de esta regula negativamente la expresión y capacidad funcional en superficie de algunas proteínas de membrana. Por ende, bajo la luz de los antecedentes, nuestro objetivo es determinar, en líneas celulares de melanoma, si Crt retiene o altera la expresión de MICA y MICB, y si esto es influenciado de alguna forma por IL-10, como mecanismo de evasión de la inmunovigilancia de las células NK. Para estudiar esto, en primer lugar, realizamos ensayos de Microscopía Confocal (MC) con el fin de estudiar en células de melanoma la distribución de los ligandos MICA y MICB, y su relación con Crt, además de ver si su comportamiento era o no influenciado por IL-10. Posteriormente, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación (IP) para verificar si existía una interacción directa de Crt con MICA y MICB. Finalmente, y con el fin de estudiar si Crt tenía alguna incidencia en la expresión de MICA y MICB en la superficie de las células, se realizó una mutagénesis sitiodirigida a Vasostatina, fragmento N-terminal de Crt que cumple la función de chaperona, de forma que no pudiese interactuar con ligandos, además de, en forma paralela, sobreexpresarla. Los productos resultantes fueron clonados y expresados en células HEK. Para detectar si existía alguna variación en el patrón de expresión superficial de MICA y MICB en las células, producto de la mutación o sobreexpresión de Vasostatina, se realizó un ensayo de Citometría de Flujo (CF), además de un ensayo de Western Blot (WB) para ver si era posible detectar Vasostatina sobreexpresada en las células a nivel proteico. En nuestros resultados logramos observar que MICA y MICB se co-expresan frecuentemente en líneas celulares de melanoma, detectándose compartimentalizados en el interior del citoplasma, RE, además de observarse su presencia en el núcleo. Mediante IP observamos que MICA y MICB tienen un patrón de migración de doble banda, además de una tercera banda de mucho menor tamaño, cuando se revela con anticuerpo específico. Lo anterior indicaría que MIC soluble se podría estar generando en el interior de la célula, en forma complementaria a su liberación desde la superficie celular por efecto de metaloproteasas. Por su parte, por IF, observamos que Crt colocaliza con MICA y MICB, en el interior de las células de melanoma, lo cual también se produce en el núcleo. Además, por IP, vimos que Crt que inmunoprecipita con MICA, solamente en la banda que corresponde a la segunda de menor peso molecular. Por otro lado, mediante IF no logramos detectar que IL-10 afectase la distribución citoplasmática de MICA y MICB. Finalmente, al sobreexpresar y mutar Vasostatina no logramos apreciar algún efecto importante sobre el nivel de expresión de MICA y MICB en la superficie de las células HEK. Como conclusión podemos decir que MICA y MICB se encuentran agrupados en el interior de las células de melanoma y que interactúan con Crt, requiriéndose estudios posteriores a fin de determinar si esto constituye o no un mecanismo de evasión de la inmunovigilancia de las células NK

O carrapato Boophilus microplus é um dos mais importantes ectoparasitas dos rebanhos bovinos, estando em todas as áreas tropicais e subtropicais entre o paralelo 32 °N e 32 °S, abrangendo regiões que se dedicam à pecuária na América, África, Ásia e Oceania. O controle do carrapato B. microplus é realizado principalmente com o uso de acaricidas, entretanto devido a crescente preocupação com os problemas criados pela poluição química do ambiente, ao alto custo e toxicidade das drogas e ao aparecimento de carrapatos resistentes aos acaricidas, alternativas para o controle do B. microplus devem ser encontradas. A sobrevivência dos carrapatos depende grandemente da sua capacidade de evadir o sistema imunológico dos hospedeiros, portanto antígenos da glândula salivar poderiam ser alvos para intervenção imunoprofilática. Neste trabalho foram isolados cDNAs não previamente descritos correspondentes a antígenos presentes na glândula salivar. cDNAs que codificam para proteínas similares a paramiosina e calreticulina foram seqüenciados, expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes purificadas, tendo sido produzidos soros policlonais contra as proteínas recombinantes em coelhos. As seqüências foram caracterizadas e alinhamentos múltiplos com outras seqüências foram determinados. O gene da calreticulina mostrou ser expresso em todos os estágios e tecidos testados, tanto em experimentos de RT-PCR quanto de Western blot, tendo sido demonstrado também a sua secreção pela saliva. Análise filogenética indica o agrupamento do gene de B. microplus com seqüências de outros artrópodos. Soros de bovinos infestados não reconhecem a calreticulina recombinante, apesar dela ser reconhecida pelo soro de cães infestados pelo carrapato Rhippicephalus sanguineus. A paramiosina mostrou-se, em ensaios de Western blot, também estar presente em todos os estágios testados, porém não na saliva. A paramiosina recombinante foi capaz de ligar colágeno e IgGs. Ambas as proteínas correspondem a proteínas multi-funcionais possivelmente envolvidas na imunomodulação do hospedeiro, tendo sido sugeridas como imunógenos protetores contra outros parasitas.

Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La enfermedad de Chagas, una zoonosis que afecta al continente Americano, es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi y su principal vía de transmisión es vectorial, a través de insectos hematófagos de la subfamilia Triatominae. Epidemiológicamente, en Chile el vector más importante es Triatoma infestans. La saliva de artrópodos hematófagos tiene propiedades vasodilatadoras e inmunomoduladoras que favorecen la ingestión de sangre, sin daño aparente para el hospedero. Extractos de glándula salival de algunos de estos organismos inhiben la ruta clásica y alterna de activación del sistema del complemento humano. Se ha aislado en la saliva de otros artrópodos hematófagos a calreticulina (CRT), una proteína altamente pleiotrópica que está presente en todos los linajes celulares, excepto eritrocitos. En este estudio se demostró la presencia de CRT en extracto de glándula salival de T. infestans (TiCRT), usando criterios antigénicos y funcionales. Se analizó el extracto completo de glándula salival de T. infestans mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% p/v, en presencia de dodecil sulfato de sodio y β2-mercaptoetanol (SDS- PAGE). Una réplica fue sometida a electrotransferencia, donde anticuerpos heterólogos reconocieron TiCRT putativa. Funcionalmente, y de acuerdo a lo esperado, se verificó que la TiCRT putativa presente en el extracto de glándula salival se unió específicamente al componente C1q, módulo de reconocimiento de señales de peligro de la ruta clásica del sistema del complemento humano. Más aún, el extracto de glándula salival, conteniendo TiCRT, inhibió esa ruta de activación, según lo verificado en ensayos inmunométricos. Muy probablemente, la unión de TiCRT a C1q medió una disminución en el depósito a la fase sólida de C4b. Esta es la unidad central de las convertasas de C3 y de C5 del complemento. Tomados en conjunto, estos resultados permiten proponer que el extracto de glándula salival de T. infestans contiene una molécula con peso aparente y propiedades antigénicas y funcionales compatibles con aquellas conocidas para CRT

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Una de las principales consecuencias producidas por la diabetes mellitus en personas, es el desarrollo de heridas crónicas. Hoy en día, constituyen un problema de salud pública, debido a que son cada vez más frecuentes y se asocian con altos costos de tratamiento, por lo que se han estudiado diversos agentes terapéuticos. La Calreticulina (CRT) es una proteína chaperona y ligadora de calcio del retículo endoplásmico, ampliamente distribuida en las células eucariotas que se expresa en las células de diferentes mamíferos. Esta proteína, mediante estudios in vivo e in vitro, ha demostrado tener un importante rol en la cicatrización de heridas cutáneas y diversos procesos asociados con la reparación cutánea, mejorando la migración y proliferación celular. La aplicación tópica de CRT produjo un marcado aumento de la tasa y calidad de la cicatrización de heridas en modelos experimentales en porcinos, y una disminución significativa en el tiempo para completar el cierre de heridas en ratones genéticamente diabéticos tratados con CRT humana y de conejo. Por otro lado, la calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), además de ser altamente homóloga a su contraparte humana, ha demostrado ser más eficiente que la calreticulina de humano en la aceleración de la cicatrización de heridas. Sin embargo, no hay información con respecto a la aplicación tópica de TcCRT en heridas de pacientes diabéticos. El objetivo principal de esta memoria de título fue analizar el efecto de la proteína TcCRT en dos concentraciones diferentes en la cicatrización de heridas in vivo en ratas diabéticas. Una concentración baja de 2.5 ng/μl fue más efectiva estimulando el proceso de reepitelización, la formación de tejido de granulación y la maduración de la dermis. Estos resultados reafirman el efecto de TcCRT sobre la cicatrización en un modelo experimental realizado en ratas diabéticas, augurando su potencial uso como agente terapéutico tópico en el tratamiento de heridas crónicas. / One of the main consequences produced by diabetes mellitus in people is the development of chronic wounds. Nowadays, they constitute a public health problem, because they are increasingly frequent and are associated with high cost of treatment, thus several therapeutic alternatives have been studied. Calreticulin (CRT) is a calcium-binding, chaperone protein of the endoplasmic reticulum, widely distributed in eukaryotic cells, and expressed in the cells of different mammals. This protein has shown to play an important role in healing of cutaneous wounds and diverse processes associated with skin repair through in vivo and in vitro studies, improving cell migration and proliferation. The topical application of CRT produced a marked increase in the rate and quality of wound healing in pig experimental models, and a significant decrease in time to complete the closure of wounds in genetically diabetic mice treated with human and rabbit CRT. On the other hand, Trypanosoma cruzi calreticulin (TcCRT), in addition to being highly homologous to its human counterpart, has shown to be more efficient than human calreticulin in accelerating wound healing. However, there is no information regarding the topical application of TcCRT in diabetic wounds. The main aim of this research was to analyze the effect of the TcCRT protein in two different concentrations on the in vivo wound healing process in diabetic rats. A low concentration of 2.5 ng/μl was more effective in stimulating the reepithelialization process, the granulation tissue formation and the dermis maturation. These results reaffirm the effect of TcCRT on the healing process in an experimental model performed in diabetic rats, augurating its potential use as a topical therapeutic agent in the treatment of chronic wounds. / Proyecto FONDECYT 11130257

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La angiogénesis es la generación de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Fisiológicamente, se produce sólo en casos excepcionales (inflamación crónica, ciclo menstrual, cicatrización, etc.), y es un mecanismo fundamental para el crecimiento de un tumor, desde los 2 mm3. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. CRT humana (HuCRT) y su dominio N- terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis, inhibiendo así la proliferación de células endoteliales. Anteriormente, en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), se ha descrito que CRT de Trypanosoma cruzi (TcCRT) es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo (CAM). Estas propiedades también son expresadas por TcCRT y su dominio N-terminal, en ensayos ex vivo e in vitro, en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies de mamíferos, Rattus rattus y Homo sapiens sapiens. Este efecto se correlaciona, en experimentos in vitro, con la inhibición de la morfogénesis capilar, la proliferación y la migración de las células endoteliales y con la internalización de TcCRT por estas células, también descrito en el LIAM. El objetivo general de este estudio fue validar los resultados antiangiogénicos de TcCRT obtenidos in vivo en aves, así como los generados in vitro y ex vivo, con varias especies de mamíferos, usando ahora un ensayo in vivo en un modelo mamífero. Esto se basa en la posibilidad de que las moléculas que regulan la angiogénesis pueden actuar de forma diferente en diferentes especies. Matrigel es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Entre los ensayos in vivo descritos para medir la angiogénesis, está el ensayo de tapón de Matrigel, que se utilizó en esta investigación, que se basa en la siguiente hipótesis: Dadas las propiedades antiangiogénicas que TcCRT expresa en una variedad de ensayos in vitro, ex vivo, en células mamíferas y, también in vivo en aves, entonces, TcCRT inhibirá la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en mamíferos (Mus musculus). Los objetivos específicos para satisfacer esta hipótesis, fueron: 1. Estandarizar el ensayo de tapón de Matrigel in vivo para medir angiogénesis, 2. Estandarizar la concentración de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) por tapón de Matrigel, 3. Determinar la presencia de TcCRT recombinante (rTcCRT) y HuCRT recombinante (rHuCRT) en extracto proteico de tapones de Matrigel, y 4. Cuantificar el efecto de rTcCRT y rHuCRT sobre la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en ratón. 500μl de Matrigel, que contiene 300ng de bFGF (para promover la infiltración de células endoteliales), fueron inoculados por vía subcutánea a ratones C57BL/6. Siete días más tarde, fue posible diseccionar y analizar los tapones, tanto inmunológica e histológicamente. Además, los anticuerpos mono y policlonales, anti-TcCRT y anti- HuCRT reconocieron las proteínas recombinantes en extracto proteico de tapón de Matrigel. rHuCRT y rTcCRT inhibieron la proliferación de células endoteliales promovido por bFGF en los tapones de Matrigel. En síntesis, se demostró que TcCRT inhibe la migración de células endoteliales a una matriz fisiológica semisólida, tal como el Matrigel ubicado subcutáneamente en ratones. Dado que la migración de células endoteliales es un pre-requisito para la morfogénesis capilar, es muy probable que este ensayo se correlacione con la capacidad de inhibición que la molécula parasitaria ejerce in vivo sobre el crecimiento tumoral. Este es el primer estudio que define un efecto antiangiogénico para la calreticulina parasitaria, in vivo en mamíferos. Aun cuando, más indirectamente, este efecto podría correlacionarse con las propiedades antitumorales de T. cruzi, reportadas por otros laboratorios, y recientemente confirmadas en el LIAM