Les lipases, protéines ubiquitaires, sont les enzymes les plus étudiées et les plus utilisées dans l’industrie. Elles catalysent un très grand nombre de réactions, d’hydrolyse et de synthèse, conduisant à une grande diversité de molécules, acides, esters, amides…. Les domaines d’applications sont nombreux : les bio-énergies, les arômes, bio-lubrifiants, bio-plastifiants, émulsifiants, produits phytosanitaires et détergents, cosmétiques, synthons pour la chimie fine, produits pharmaceutiques… Aujourd’hui, grâce aux outils génétiques, il est possible de modifier leur activité, spécificité et thermostabilité pour les adapter idéalement aux contraintes industrielles. Dans ce travail de doctorat, nous nous sommes intéressés à quatre lipases d’intérêt industriel. Les 3 premières appartiennent à la famille des lipases de Candida rugosa (Lip1, Lip3 et Lip4). Bien que très homologues, leurs spécificités sont très différentes. Elles se distinguent de toutes les autres lipases par un site actif composé d’un long tunnel avec la triade catalytique à l’entrée de celui-ci. Cela en fait une enzyme particulièrement intéressante pour la conversion et la purification d’acides gras à longue chaîne. La quatrième est une nouvelle lipase identifiée chez la levure oléagineuse, Yarrowia lipolytica. Elle est très active sur les acides gras à longue chaîne, active à pH acide et présentant une grande énantiosélectivité sur des molécules d’intérêt pharmaceutique, les esters d’acide 2- halogéno-aryl acide acétique. Dans un premier temps, un nouveau système d’expression, une souche spécifique de Yarrowia lipolytica, a été étudié pour l’expression de variants construits par mutagenèse dirigée. Cette souche JMY1212 permet une intégration ciblée dans le génome de Y. lipoytica. Nous avons démontré qu’il s’agissait du premier système d’expression permettant de comparer statistiquement l’activité de variants directement à partir du surnageant de culture. Trois des lipases de Candida rugosa ont été clonées avec succès dans cette souche et leurs activités et spécificités vis-à-vis de la longueur de chaines des acides gras ont été étudiées. Lip1 et Lip3 présentent une spécificité pour les acides gras à longueur de chaine moyenne (C8-C10) alors que Lip4 préfère les C18:1. De, plus, pour la première fois, la purification, à partir d’un mélange d’esters éthyliques issu d’huile de poissons, d’acides gras poly-insaturés (PUFAs); acides cis-5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic (EPA) et cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic (DHA), molécules bonnes pour la santé, a été réalisée avec les trois lipases séparées de C. rugosa. Quelle que soit l’enzyme, le rendement de récupération du DHA est supérieur à 93 % (97, 100 et 93 % pour Lip1, Lip3 et Lip4 respectivement. Une pureté maximale en DHA de ~60 % a été obtenue avec Lip3 et Lip4, à partir d’un mélange initial d’esters éthyliques contenant 25% de DHA. Une différence remarquable entre ces trois enzymes est que Lip4 est capable de mieux hydrolyser l’ester d’EPA (60% contre 14 et 16% pour Lip1 et Lip3). Lip4 est même capable d’hydrolyser le DHA (7% contre 3 et 0 % pour Lip1 et Lip3). La deuxième partie de ce travail a été consacrée à l’amélioration de l’énantiosélectivité des deux enzymes étudiées vis-à-vis de synthons d’intérêt dans l’industrie pharmaceutique, les esters de 2-bromo aryl acide acétique. La construction raisonnée d’un double variant de la lipase Lip2 de Y. lipolytica, D97AV232F, a permis d’obtenir une enzyme totalement énantiosélective (E >200). Celle-ci reconnaît l’énantiomère R alors que la lipase sauvage avait une faible préférence pour l’énantiomère S (E=5). Par ailleurs, cette exceptionnelle augmentation de l’énantiosélectivité s’accompagne d’une amélioration de l’activité de l’enzyme qui est ainsi multipliée par 4,5. Sur ce même mélange d’énantiomères, les 3 lipases de C. rugosa se sont avérées remarquables. Malgré leur grande homologie, leur spécificité est différente. Lip1 et Lip3 sont totalement S spécifiques (E>200), alors que Lip4 est R spécifique (E=15). Le docking moléculaire des énantiomères S et R dans le site actif des lipases Lip1 et Lip4 a permis de mieux comprendre ces différences de spécificité et de proposer des cibles de mutagenèse dirigée. L’encombrement et la nature de l’acide aminé présent en position 296 sont cruciaux pour la discrimination de l’enzyme / Lipases, ubiquitous proteins, are the most studied enzymes and the most used in industry. They catalyse a great number of reactions, hydrolysis and synthesis, leading to a great diversity of molecules, acids, esters, amides. There are numerous fields of applications: bio-energies, flavours, bio-lubricants, bio-plasticizers, emulsifiers, detergents, cosmetics, synthons for fine chemistry, and pharmaceutical products. Nowadays, thanks to genetic tools, it is possible to modify their activity, specificity and thermostability to ideally adapt enzymes for the industrial constraints. In this work, we were interested in four lipases of industrial interest. The third ones belong to the lipase family of Candida rugosa (Lip1, Lip3 and Lip4). Although they present high homology, their specificities are very different. They are distinct from the other lipases by the active site composed of a long tunnel with the catalytic triad at the entry of the tunnel. It leads to enzymes particularly interesting for the conversion and the purification of long chain fatty-acids. The fourth one is a new lipase identified from oleaginous yeast, Yarrowia lipolytica. It is one of the most active lipase on long chain fatty-acids; it is very active and stable at acid pH and presents a high enantioselectivity on molecules of pharmaceutical interest, the esters of 2- halogeno-aryl acetic acid. In this work, we first tested a new expression system, a specific strain of Y. lipolytica, for expression of variants obtained by site-directed mutagenesis. This strain JMY1212 enables integration to be targeted to a special locus of the Y. lipoytica genome. We demonstrated that it is the first expression system in which it is possible to compare statistically variant activities directly from the supernatant of the culture. Secondly, three lipases of C. rugosa were cloned successfully in this strain and their activities and specificities with respect to fatty acid chain lengths were studied. Lip1 and Lip3 have specificity for the fattyacids of medium chain (C8-C10) whereas Lip4 prefers C18: 1. Moreover, for the first time, purification, from a mixture of ethyl esters issued from fish oil, polyunsaturated fatty acids (PUFAs); cis-5, 8, 11, 14, 17- eicosapentaenoic acid (EPA) and cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenoic acid (DHA), molecules with health benefits, was realised with the three C. rugosa lipases, separately. Whatever the enzyme the recovery of DHA is superior to 90 % (97, 100 and 93 % for Lip1, Lip3 and Lip4 respectively. The maximal DHA purity ~60 % was obtained with Lip3 and Lip4, with an initial ethyl ester mixture containing 25% DHA. A remarkable difference between these enzymes lies in the fact that Lip4 is able to better hydrolyse the EPA esters (60% against 13% and 16% respectively for Lip1 and Lip3). Lip4 is also able to hydrolyse DHA (7% against 3 and 0 % for Lip1 and Lip3 respectively). The third part of this work was devoted to the improvement of the enantioselectivity of the two enzymes studied with respect to the resolution of a racemic mixture of pharmaceutical industry, the R, S esters of 2-bromo aryl acetic acid. The rational construction of a double variant of Lip2 lipase from Y. lipolytica, D97A V232F was realized to obtain a total enantioselective enzyme (E > 200). This variant recognizes the enantiomer R whereas wild-type lipase had a weak preference for the enantiomer S (E=5). In addition, this exceptional increase in the enantioselectivity is accompanied by a 4.5 fold improvement of the activity. With the same mixture of enantiomers, the 3 lipases of C. rugosa proved to be remarkable from the point of view of enantioselectivity. In spite of their high homology, their specificity is different. Lip1 and Lip3 are completely specific for the S enantiomer, whereas Lip4 is R specific (E=15). The molecular docking of the S and R enantiomers in the active site of Lip1 and Lip4 lipases enables the observed differences in specificity to be better understood and targets for site-directed mutagenesis to be proposed. We demonstrated that the nature of the amino acid present in position 296 is crucial for the discrimination of these enzymes

FREITAS, M. F. M. Produção de lipases por leveduras isoladas do bagaço de caju utilizando fontes alternativas de Carbono e Nitrogênio. 2017. 103 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química)-Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by pgeq ufc (pgeq@ufc.br) on 2017-11-21T19:19:47Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_mfmfsales.pdf: 1907549 bytes, checksum: 22fee806e690e6f63b1598b0a1542349 (MD5) / Rejected by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br), reason: Prezada Fátima: Vc realizou muitas alterações sugeridas, mas faltam ainda algumas para vc corrigir. Por esse motivo, sugerimos consultar o modelo de template, para ajudá-la nesta tarefa, disponível em: http://www.biblioteca.ufc.br/educacao-de-usuarios/templates/ Vamos agora as correções sempre de acordo com o template: 1. Na capa, na parte inferior da folha coloque a informação da cidade e o ano em negrito. 3. Na ficha Catalográfica, o seu nome deve estar de acordo com a folha de rosto e capa. Voce suprimiu o ultimo nome. Sendo assim a entrada: Sales, Maria de Fátima Matos de Freitas (Não de Freitas) No corpo da ficha coloque seu nome completo por extenso. 4. Retire os hifens de separação na LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS. 7. No sumário na seção terciária (3 dígitos) a partir do 4.2.1 os numerais não estão em itálico. Favor colocar em toda a lista. A palavra CONCLUSÃO Por ser seção primária deve ser toda maiúscula. Retire o numeral 7 da palavra REFERÊNCIAS 8. Na lista de referencias, A palavra que deve ser usada é REFERÊNCIAS (sem o numeral 7), em negrito e centralizada na folha. 9. Na lista de REFERENCIAS, dê uma revisada em toda a lista para colocar o espaço depois do ponto de abreviação (v. n. p. ) nos artigos de revistas. Ex; v.2, n. 3, 2012. Coloque espaço após v. 2, n. 3, 2012 Reenvie novo arquivo para a secretaria com as correções que enviaremos o nada consta por e-mail. Att. Marlene mmarlene@ufc.br 3366-9620 on 2017-11-22T11:23:36Z (GMT) / Submitted by pgeq ufc (pgeq@ufc.br) on 2017-11-24T19:13:19Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_mfmfsales.pdf: 1891030 bytes, checksum: b360634c75b70dda334f156745c6be57 (MD5) / Rejected by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br), reason: Alteração de Maria de Fátima Matos de Freitas Sales Prezada Fátima: Vc realizou muitas alterações sugeridas, mas faltam ainda algumas para vc corrigir. Por esse motivo, sugerimos consultar o modelo de template, para ajudá-la nesta tarefa, disponível em: http://www.biblioteca.ufc.br/educacao-de-usuarios/templates/ Vamos agora as correções sempre de acordo com o template: 3. Verifiquei que houve alteração no seu nome em relação ao arquivo passado, portanto vc tem que alterar em todas as folhas em que é citada. Faltou alterar na folha de aprovação, pois seu nome ainda permanece com SALES. Na ficha então deve ficar: Freitas, Maria de Fátima Matos de (Não de Freitas). No corpo da ficha coloque seu nome completo por extenso. 7. No sumário na seção terciária (3 dígitos) a partir do 4.2.1 os numerais não estão todos em itálico. Favor colocar em toda a lista. Faltou vc colocar em itálico: 5.9.1 Efeito da temperatura e pH na atividade da enzima produzida. 5.9.2 Eletroforese. 5.9.3 Processo de purificação 9. Na lista de REFERENCIAS, dê uma revisada em toda a lista para colocar o espaço depois do ponto de abreviação (v. n. p. ) nos artigos de revistas. Ex; v.2, n. 3, 2012. Coloque espaço após v. 2, n. 3, p. 513-523, 2012 . Vc ainda não corrigiu o espaçamento solicitado em toda a lista. Reenvie novo arquivo para a secretaria com as correções que enviaremos o nada consta por e-mail. Att. Marlene mmarlene@ufc.br 3366-9620 on 2017-11-27T13:25:15Z (GMT) / Submitted by pgeq ufc (pgeq@ufc.br) on 2017-11-30T11:40:13Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_mfmfsales(1).pdf: 1894579 bytes, checksum: 225db412b0fb510a23717698c92cd485 (MD5) / Rejected by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br), reason: Danilo, Favor renomear o arquivo para: 2017_tese_mfmfreitas Depois me envie novamente. Marlene on 2017-11-30T12:52:03Z (GMT) / Submitted by pgeq ufc (pgeq@ufc.br) on 2017-11-30T12:58:25Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_mfmfreitas.pdf: 1894579 bytes, checksum: 225db412b0fb510a23717698c92cd485 (MD5) / Approved for entry into archive by Marlene Sousa (mmarlene@ufc.br) on 2017-11-30T14:20:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_mfmfreitas.pdf: 1894579 bytes, checksum: 225db412b0fb510a23717698c92cd485 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-30T14:20:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_mfmfreitas.pdf: 1894579 bytes, checksum: 225db412b0fb510a23717698c92cd485 (MD5) Previous issue date: 2017-06-13 / Lipolytic enzymes can catalyse a wide variety of reactions and are highly specific. For biotechnology, the need arises for the search for new microrganisms for this production. The objective of this work was to evaluate lipase production by two yeasts isolated from cashew bagasse, Candida tropicalis URM 7057 and Meyerozyma caribbica LABIOTEC 4 and to compare it with C. rugosa yeast NRRL Y-95. Synthetic culture media were initially tested for production of the enzyme. Synthetic medium C (containing glucose, KH2PO4, yeast extract, MgSO4 .7H2O, peptone and oleic acid) showed the best intracellular activity results (282 ± 14 in 48 h of cultive). Then, alternative medium culture was formulated with residues, in addition to ammonium sulfate and peptone, and evaluated the production of the enzymes of interest. Medium culture 01 contained molasses, medium culture 02, corn steep liquor (CSL), medium culture 03, olive mill wastewater (OMW) and medium culture 04, all of them. Medium 04 was better because it allowed the production of larger amounts of lipase, probably because it had a higher amount of nutrients for yeast. An experimental design was conducted to verify the influence of the concentrations of residues on lipase production. Corn steep liquor (CSL) had a positive effect on this production, providing extracellular lipase activity of 587 ± 5 U/L, in 24 h of cultive. The use of stirred tank bioreactors favored the production of lipases, since the activities of the lipase produced by C. rugosa in bioreactor were higher than those produced in flasks (600 U/L in bioreactor and 400 U/L in flasks, after 48 h of cultive) and for yeast C. tropicalis the enzymatic activity also presented in a larger quantity (close to 500 U/L, compared to 400 U/L in flasks). Biomass growth of yeast biomass C. tropicalis, in flasks and in bioreactor, was similar up to 48 h. The enzyme produced by C. rugosa has a molar mass close to 60 KDa, with an optimum pH of 7.0 and an optimum temperature of 40 °C. The partial biochemical characterization of the lipase produced by C. tropicalis showed that it presents an optimum temperature of 60 °C for the intracellular extract and 70 °C for the extracellular extract, optimum pH equal to 7.0. After adsorption of the enzyme in octyl-agarose, it was possible to identify, by zymogram analysis and by electrophoresis, bands close to those obtained for C. rugosa commercial lipase (60 KDa, 45 KDa and 22 KDa). / As enzimas lipolíticas são capazes de catalisar uma grande variedade de reações e são altamente específicas. Para a biotecnologia surge a necessidade da busca de novos micro-organismos para essa produção. O objetivo desse trabalho foi avaliar a produção de lipases por duas leveduras isoladas do bagaço de caju, Candida tropicalis URM 7057 e Meyerozyma caribbica LABIOTEC 4 e comparar pela levedura C. rugosa NRRL Y-95. Inicialmente foram testados meios de cultura sintéticos para a produção da enzima. O meio sintético C (contendo glicose, KH2PO4, extrato de levedura, MgSO4.7H2O, peptona e ácido oleico) foi o que apresentou melhor resultados de atividade intracelular (282 ± 14 U/L em 48 horas de cultivo). Em seguida, 4 meios de cultura alternativos foram formulados com resíduos, além de sulfato de amônia e peptona, e avaliados na produção da enzima de interesse. O meio 01 continha melaço, o meio 02, milhocina (CSL - corn steep liquor), o meio 03, águas residuais da produção do azeite (olive mill wastewater - OMW) e o meio 04, todos eles. O meio 04 se mostrou melhor por permitir a produção de maiores quantidades da enzima lipolítica, provavelmente por apresentar uma quantidade maior de nutrientes para levedura. Um planejamento fatorial fracionado foi conduzido para se verificar a influência das concentrações dos resíduos na produção da lipase. A milhocina apresentou efeito positivo nessa produção, propiciando atividade extracelular de lipase de 587 ± 5 U/L, em 24 horas de cultivo. O uso de biorreator tipo tanque agitado favoreceu a produção de lipases, visto que as atividades da lipase produzida por C. rugosa em biorreator foram maiores que as produzidas em frascos (600 U/L em biorreator e 400 U/L em frascos, após 48 horas de cultivo), e para levedura C. tropicalis a atividade enzimática também se apresentou em quantidade maior (próximo a 500 U/L, comparado a 400 U/L em frascos). O crescimento da biomassa da levedura C. tropicalis em frascos e em biorreator foi similar até 48 horas. A enzima produzida por C. rugosa tem massa molar próxima a 60 KDa, com pH ótimo em torno de 7,0 e temperatura ótima de 40 °C. A caracterização bioquímica parcial da lipase produzida por C. tropicalis mostrou que ela apresenta temperatura ótima de 60 ºC para o extrato intracelular e 70 °C para o extracelular, pH ótimo igual a 7.0. Após adsorção da enzima em octil-agarose, foi possível identificar, por análise de zimograma e por eletroforese, bandas próximas às obtidas para a lipase de C. rugosa comercial (60 KDa, 45 KDa e 22 KDa).

Made available in DSpace on 2015-02-20T12:56:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 90.pdf: 3851149 bytes, checksum: e4dbb69d527e33af273cdc8bef40b262 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / O ambiente tem sido fortemente impactado por uma diversidade de poluentes, principalmente, devido ao crescimento populacional e ao aumento da atividade industrial. Neste contexto, a contaminação de corpos d água por efluentes de indústrias têxteis tem tido destaque, pois os efluentes produzidos por este setor são constituídos por uma complexa mistura de poluentes. Os corantes mais extensivamente usados, os do tipo azo, quando lançados no meio aquático sofrem degradação podendo gerar aminas aromáticas e benzidinas, potentes agentes carcinogênicos e mutagênicos que além de afetar o ambiente podem causar danos à saúde humana. A persistência de resíduos perigosos no ambiente é um problema público que leva à necessidade da atuação de segmentos relacionados à Saúde Pública, inclusive a Vigilância Sanitária, na eliminação ou mitigação das conseqüências adversas decorrentes deste processo. A seleção de fungos capazes de descolorir e detoxificar esses corantes é uma alternativa promissora para substituir ou complementar os tratamentos convencionais. Sedimentos de vinte reservatórios de água do Parque Nacional da Serra da Capivara, área de preservação ambiental encravado na caatinga no Estado do Piauí, com clima semi-árido, foram avaliados com o objetivo de selecionar consórcios de fungos com capacidade de descolorir e detoxificar três azo corantes (Vermelho Reativo 198, Azul Reativo 214 e Vermelho Reativo 141), e destas amostras de sedimento selecionar fungos que apresentem esta mesma capacidade isoladamente. / O ambiente tem sido fortemente impactado por uma diversidade de poluentes, principalmente, devido ao crescimento populacional e ao aumento da atividade industrial. Neste contexto, a contaminação de corpos d’água por efluentes de indústrias têxteis tem tido destaque, pois os efluentes produzidos por este setor são constituídos por uma complexa mistura de poluentes. Os corantes mais extensivamente usados, os do tipo azo, quando lançados no meio aquático sofrem degradação podendo gerar aminas aromáticas e benzidinas, potentes agentes carcinogênicos e mutagênicos que além de afetar o ambiente podem causar danos à saúde humana. A persistência de resíduos perigosos no ambiente é um problema público que leva à necessidade da atuação de segmentos relacionados à Saúde Pública, inclusive a Vigilância Sanitária, na eliminação ou mitigação das conseqüências adversas decorrentes deste processo. A seleção de fungos capazes de descolorir e detoxificar esses corantes é uma alternativa promissora para substituir ou complementar os tratamentos convencionais. Sedimentos de vinte reservatórios de água do Parque Nacional da Serra da Capivara, área de preservação ambiental encravado na caatinga no Estado do Piauí, com clima semi-árido, foram avaliados com o objetivo de selecionar consórcios de fungos com capacidade de descolorir e detoxificar três azo corantes (Vermelho Reativo 198, Azul Reativo 214 e Vermelho Reativo 141), e destas amostras de sedimento selecionar fungos que apresentem esta mesma capacidade isoladamente. As culturas de fungos em consórcio oriundas do Caldeirão Escuridão foram as mais eficientes na descoloração e detoxificação dos três corantes. A partir deste consórcio foi possível isolar três fungos identificados como Candida rugosa, Trichosporon ovoides e Mucor sp. Destes isolados a levedura C. rugosa apresentou importantes resultados de descoloração e detoxificação quando comparada à cepa de referência Lentinula edodes. C. rugosa foi mais eficiente na descoloração de dois dos corantes testados e obteve melhor desempenho na detoxificação dos três corantes frente a L. edodes. Este é o primeiro trabalho descrevendo a capacidade de C. rugosa tanto na degradação quanto na detoxificação de corantes têxteis. Assim, este fungo se apresenta como um potencial agente na biorremediação de efluentes têxteis.

No defrontar-se com os problemas relacionados às condições de saúde humana ou animal, mais especificamente as doenças infecciosas, os seres humanos das mais diversas culturas produzem conhecimentos e recursos para debelá-las. Esse reconhecimento tem despertado em investigadores em ciência o interesse pelo desenvolvimento de pesquisas etnográficas, como acontece aqui no estado do Rio Grande do Sul, visando o levantamento de espécies de plantas medicinais utilizadas por diferentes comunidades. A possibilidade de encontrar entre as plantas nativas alguma propriedade antimicrobiana constitui-se um grande desafio principalmente em um momento com relatos de resistência de microrganismos a inúmeros fármacos e desinfetantes convencionais existentes. Nesse sentido objetivando avaliar a ação desinfetante de plantas consideradas medicinais no Rio Grande do Sul assim como de desinfetantes convencionais como fungicidas, foram utilizadas cepa de Candida albicans ATCC e 21 isolados de Candida krusei, nove isolados de Candida rugosa e um isolado de Candia albicans, em mastite bovina. As plantas foram selecionadas por pesquisa bibliográfica cujo teor tivesse relação com estudos etnográficos no Rio Grande do Sul e, na sequência, foram realizados testes de triagem na forma de decocção e extrato hidroetanólico hidratado (EH), obtido de maceração hidroetanólica 70º GL, desalcoolizada e hidratada ao volume inicial, ambas as formas na proporção 5g/100 mL, frente as densidade as populacionais 105, 104 e 103 UFC/mL da cepa padrão, nos tempo de contato de uma e 24 horas. Da etapa de triagem foi selecionada a planta “Macela” Achyrocline saitureioides na forma de EH para teste com os isolados com as mesmas densidades populacionais usadas na triagem e tempos de contato iniciando em 15 minutos até o tempo em que não mais se observava o crescimento de colônias. Os desinfetantes convencionais Iodóforo e Amônia Quaternária (QAC – cloreto de cetil trimetilamônio) nas concentrações de 100%, 50% e 25%, foram confrontados com a cepa padrão e os 31 isolados de campo na densidade populacional de 106UFC/mL, nos tempos de contato de 15, 30 e 60 minutos, baseado na técnica do teste de suspensão na avaliação quantitativa da atividade fungicida e leveduricida de desinfetantes e antissépticos. A forma de decoto não apresentou diminuição logarítmica nas densidades populacionais testadas, nos tempos preconizados e a forma EH demonstrou diminuição logarítmica e tendo a marcela inibido o crescimento da cepa padrão já na primeira hora de contato sendo, por isso, escolhida para os testes com os isolados que apresentaram inativação entre os tempos contato de 30 minutos e 12 horas. Nos desinfetantes convencionais a menor concentração testada, no menor tempo de contato já foi capaz de inativar as células de leveduras, como era esperado. Em relação a atuação de Achyrocline satureioides a mesma apresentou na forma EH 5g/mL ação que nos permite sua utilização no controle da densidade populacional da levedura Candida spp. / When faced with problems related to the conditions of human or animal health,, specifically infectious diseases, human beings of diverse cultures produce knowledge and resources to quenching them. This recognition has attracted the interest of researchers to develop ethnographic studies, as it happens here in the state of Rio Grande do Sul, aiming at the survey of medicinal plants used by different communities. The possibility of finding native plants with antimicrobial property constitutes a major challenge especially in a moment with reports of microrganisms resistance to several drugs and conventional disinfectants. In this way, the aim of this study was to evaluate the Disinfectant activity of medicinal plants from Rio Grande do Sul and the fungicidal activity of conventional disinfectants. The Candida strains used was Candida albicans ATCC and Candida spp strains isolated from bovine mastitis cases (21 isolates of Candida krusei, nine isolates of Candida rugosa and one isolate of Candida albicans). The plants were selected by bibliographic research related to ethnographic studies in Rio Grande do Sul. Later, it was performed screening of decoction and hydrated hydroethanolic extract (HE), obtained by maceration hydroethanol 70 º GL, dealcoholized and hydrated to the initial volume, in the proportion 5 g/100 mL, front standard Candida albicans population densities of 105, 104 and 103 CFU.mL-1, in a contact time of 1 h and 24 h. After screening, the selected plant was “Macela” Achyrocline saitureioides. The hydrated hydroethanolic extract of Achyrocline saitureioides was tested front isolates with the same population densities used in screening and the time of contact begin at 15 minutes until the time that does not observe growth of colonies. The disinfectants iodophor (I) and quaternary amonium (QAC - cetyl trimethylammonium chloride), at concentrations 100%, 50% and 25%, were confronted with standard strain and 31 isolates from mastitis cases, population density of the initial inoculum was 106 CFU /mL, for contact times of 15, 30 and 60 minutes. The method used was dilution by the quantitative suspension test for evaluation of fungicidal and yeasticidal activities of Disinfectants and Antiseptics Chemicals. The decoction form does not present logarithimic reduction of tested population densities, at the recommended time and HE demonstrated logarithimic reduction; Marcela inhibited the growth of the standard strain within the first hour of contact and because of that it was chosen to the tests on isolates. Isolates showed inactivation between 30 minutes to 12 hours of contact time. It was observed that the lowest concentrations of the conventional disinfectants, at the lowest time of contact, inactivated all tested yeasts, as it was expected. Regarding the performance of Achyrocline satureioides, the extract (5g/mL) presented action that allows us to use it in the control of population density of the yeast Candida spp.

No defrontar-se com os problemas relacionados às condições de saúde humana ou animal, mais especificamente as doenças infecciosas, os seres humanos das mais diversas culturas produzem conhecimentos e recursos para debelá-las. Esse reconhecimento tem despertado em investigadores em ciência o interesse pelo desenvolvimento de pesquisas etnográficas, como acontece aqui no estado do Rio Grande do Sul, visando o levantamento de espécies de plantas medicinais utilizadas por diferentes comunidades. A possibilidade de encontrar entre as plantas nativas alguma propriedade antimicrobiana constitui-se um grande desafio principalmente em um momento com relatos de resistência de microrganismos a inúmeros fármacos e desinfetantes convencionais existentes. Nesse sentido objetivando avaliar a ação desinfetante de plantas consideradas medicinais no Rio Grande do Sul assim como de desinfetantes convencionais como fungicidas, foram utilizadas cepa de Candida albicans ATCC e 21 isolados de Candida krusei, nove isolados de Candida rugosa e um isolado de Candia albicans, em mastite bovina. As plantas foram selecionadas por pesquisa bibliográfica cujo teor tivesse relação com estudos etnográficos no Rio Grande do Sul e, na sequência, foram realizados testes de triagem na forma de decocção e extrato hidroetanólico hidratado (EH), obtido de maceração hidroetanólica 70º GL, desalcoolizada e hidratada ao volume inicial, ambas as formas na proporção 5g/100 mL, frente as densidade as populacionais 105, 104 e 103 UFC/mL da cepa padrão, nos tempo de contato de uma e 24 horas. Da etapa de triagem foi selecionada a planta “Macela” Achyrocline saitureioides na forma de EH para teste com os isolados com as mesmas densidades populacionais usadas na triagem e tempos de contato iniciando em 15 minutos até o tempo em que não mais se observava o crescimento de colônias. Os desinfetantes convencionais Iodóforo e Amônia Quaternária (QAC – cloreto de cetil trimetilamônio) nas concentrações de 100%, 50% e 25%, foram confrontados com a cepa padrão e os 31 isolados de campo na densidade populacional de 106UFC/mL, nos tempos de contato de 15, 30 e 60 minutos, baseado na técnica do teste de suspensão na avaliação quantitativa da atividade fungicida e leveduricida de desinfetantes e antissépticos. A forma de decoto não apresentou diminuição logarítmica nas densidades populacionais testadas, nos tempos preconizados e a forma EH demonstrou diminuição logarítmica e tendo a marcela inibido o crescimento da cepa padrão já na primeira hora de contato sendo, por isso, escolhida para os testes com os isolados que apresentaram inativação entre os tempos contato de 30 minutos e 12 horas. Nos desinfetantes convencionais a menor concentração testada, no menor tempo de contato já foi capaz de inativar as células de leveduras, como era esperado. Em relação a atuação de Achyrocline satureioides a mesma apresentou na forma EH 5g/mL ação que nos permite sua utilização no controle da densidade populacional da levedura Candida spp. / When faced with problems related to the conditions of human or animal health,, specifically infectious diseases, human beings of diverse cultures produce knowledge and resources to quenching them. This recognition has attracted the interest of researchers to develop ethnographic studies, as it happens here in the state of Rio Grande do Sul, aiming at the survey of medicinal plants used by different communities. The possibility of finding native plants with antimicrobial property constitutes a major challenge especially in a moment with reports of microrganisms resistance to several drugs and conventional disinfectants. In this way, the aim of this study was to evaluate the Disinfectant activity of medicinal plants from Rio Grande do Sul and the fungicidal activity of conventional disinfectants. The Candida strains used was Candida albicans ATCC and Candida spp strains isolated from bovine mastitis cases (21 isolates of Candida krusei, nine isolates of Candida rugosa and one isolate of Candida albicans). The plants were selected by bibliographic research related to ethnographic studies in Rio Grande do Sul. Later, it was performed screening of decoction and hydrated hydroethanolic extract (HE), obtained by maceration hydroethanol 70 º GL, dealcoholized and hydrated to the initial volume, in the proportion 5 g/100 mL, front standard Candida albicans population densities of 105, 104 and 103 CFU.mL-1, in a contact time of 1 h and 24 h. After screening, the selected plant was “Macela” Achyrocline saitureioides. The hydrated hydroethanolic extract of Achyrocline saitureioides was tested front isolates with the same population densities used in screening and the time of contact begin at 15 minutes until the time that does not observe growth of colonies. The disinfectants iodophor (I) and quaternary amonium (QAC - cetyl trimethylammonium chloride), at concentrations 100%, 50% and 25%, were confronted with standard strain and 31 isolates from mastitis cases, population density of the initial inoculum was 106 CFU /mL, for contact times of 15, 30 and 60 minutes. The method used was dilution by the quantitative suspension test for evaluation of fungicidal and yeasticidal activities of Disinfectants and Antiseptics Chemicals. The decoction form does not present logarithimic reduction of tested population densities, at the recommended time and HE demonstrated logarithimic reduction; Marcela inhibited the growth of the standard strain within the first hour of contact and because of that it was chosen to the tests on isolates. Isolates showed inactivation between 30 minutes to 12 hours of contact time. It was observed that the lowest concentrations of the conventional disinfectants, at the lowest time of contact, inactivated all tested yeasts, as it was expected. Regarding the performance of Achyrocline satureioides, the extract (5g/mL) presented action that allows us to use it in the control of population density of the yeast Candida spp.

No defrontar-se com os problemas relacionados às condições de saúde humana ou animal, mais especificamente as doenças infecciosas, os seres humanos das mais diversas culturas produzem conhecimentos e recursos para debelá-las. Esse reconhecimento tem despertado em investigadores em ciência o interesse pelo desenvolvimento de pesquisas etnográficas, como acontece aqui no estado do Rio Grande do Sul, visando o levantamento de espécies de plantas medicinais utilizadas por diferentes comunidades. A possibilidade de encontrar entre as plantas nativas alguma propriedade antimicrobiana constitui-se um grande desafio principalmente em um momento com relatos de resistência de microrganismos a inúmeros fármacos e desinfetantes convencionais existentes. Nesse sentido objetivando avaliar a ação desinfetante de plantas consideradas medicinais no Rio Grande do Sul assim como de desinfetantes convencionais como fungicidas, foram utilizadas cepa de Candida albicans ATCC e 21 isolados de Candida krusei, nove isolados de Candida rugosa e um isolado de Candia albicans, em mastite bovina. As plantas foram selecionadas por pesquisa bibliográfica cujo teor tivesse relação com estudos etnográficos no Rio Grande do Sul e, na sequência, foram realizados testes de triagem na forma de decocção e extrato hidroetanólico hidratado (EH), obtido de maceração hidroetanólica 70º GL, desalcoolizada e hidratada ao volume inicial, ambas as formas na proporção 5g/100 mL, frente as densidade as populacionais 105, 104 e 103 UFC/mL da cepa padrão, nos tempo de contato de uma e 24 horas. Da etapa de triagem foi selecionada a planta “Macela” Achyrocline saitureioides na forma de EH para teste com os isolados com as mesmas densidades populacionais usadas na triagem e tempos de contato iniciando em 15 minutos até o tempo em que não mais se observava o crescimento de colônias. Os desinfetantes convencionais Iodóforo e Amônia Quaternária (QAC – cloreto de cetil trimetilamônio) nas concentrações de 100%, 50% e 25%, foram confrontados com a cepa padrão e os 31 isolados de campo na densidade populacional de 106UFC/mL, nos tempos de contato de 15, 30 e 60 minutos, baseado na técnica do teste de suspensão na avaliação quantitativa da atividade fungicida e leveduricida de desinfetantes e antissépticos. A forma de decoto não apresentou diminuição logarítmica nas densidades populacionais testadas, nos tempos preconizados e a forma EH demonstrou diminuição logarítmica e tendo a marcela inibido o crescimento da cepa padrão já na primeira hora de contato sendo, por isso, escolhida para os testes com os isolados que apresentaram inativação entre os tempos contato de 30 minutos e 12 horas. Nos desinfetantes convencionais a menor concentração testada, no menor tempo de contato já foi capaz de inativar as células de leveduras, como era esperado. Em relação a atuação de Achyrocline satureioides a mesma apresentou na forma EH 5g/mL ação que nos permite sua utilização no controle da densidade populacional da levedura Candida spp. / When faced with problems related to the conditions of human or animal health,, specifically infectious diseases, human beings of diverse cultures produce knowledge and resources to quenching them. This recognition has attracted the interest of researchers to develop ethnographic studies, as it happens here in the state of Rio Grande do Sul, aiming at the survey of medicinal plants used by different communities. The possibility of finding native plants with antimicrobial property constitutes a major challenge especially in a moment with reports of microrganisms resistance to several drugs and conventional disinfectants. In this way, the aim of this study was to evaluate the Disinfectant activity of medicinal plants from Rio Grande do Sul and the fungicidal activity of conventional disinfectants. The Candida strains used was Candida albicans ATCC and Candida spp strains isolated from bovine mastitis cases (21 isolates of Candida krusei, nine isolates of Candida rugosa and one isolate of Candida albicans). The plants were selected by bibliographic research related to ethnographic studies in Rio Grande do Sul. Later, it was performed screening of decoction and hydrated hydroethanolic extract (HE), obtained by maceration hydroethanol 70 º GL, dealcoholized and hydrated to the initial volume, in the proportion 5 g/100 mL, front standard Candida albicans population densities of 105, 104 and 103 CFU.mL-1, in a contact time of 1 h and 24 h. After screening, the selected plant was “Macela” Achyrocline saitureioides. The hydrated hydroethanolic extract of Achyrocline saitureioides was tested front isolates with the same population densities used in screening and the time of contact begin at 15 minutes until the time that does not observe growth of colonies. The disinfectants iodophor (I) and quaternary amonium (QAC - cetyl trimethylammonium chloride), at concentrations 100%, 50% and 25%, were confronted with standard strain and 31 isolates from mastitis cases, population density of the initial inoculum was 106 CFU /mL, for contact times of 15, 30 and 60 minutes. The method used was dilution by the quantitative suspension test for evaluation of fungicidal and yeasticidal activities of Disinfectants and Antiseptics Chemicals. The decoction form does not present logarithimic reduction of tested population densities, at the recommended time and HE demonstrated logarithimic reduction; Marcela inhibited the growth of the standard strain within the first hour of contact and because of that it was chosen to the tests on isolates. Isolates showed inactivation between 30 minutes to 12 hours of contact time. It was observed that the lowest concentrations of the conventional disinfectants, at the lowest time of contact, inactivated all tested yeasts, as it was expected. Regarding the performance of Achyrocline satureioides, the extract (5g/mL) presented action that allows us to use it in the control of population density of the yeast Candida spp.

This thesis describes the development of new methods for thepreparation of enantiomerically pure methyl branched alkylcompounds and their use as building blocks in the synthesis ofstereoisomerically pure pheromones of pine sawflies. The high regioselectivity, enantioselectivity and activityof lipases in organic solvent in conjunction withenvironmentally compatible reaction conditions have madelipase-catalysed synthesis an attractive alternative toconventional synthetic methods in organic chemistry. The lipasefromPseudomonas cepacia(PCL) was used in kineticresolutions of primary 2- methylalcohols by acylation of thealcohols with vinyl acetate/vinyl butyrate. For alcoholsstudied, PCL showed moderate enantioselectivity(E= 10-20) towards 3-alkyl- or 3- cycloalkylsubstitutedprimary 2-methylpropanols, whereas 3-aryl-2-methyl-1-propanolswere accepted with high E-values(E&gt;100). Esterification of substituted methylcarboxylic acids withprimary alcohols catalysed byCandida rugosalipase (CRL) was found to be anenantioselective reaction. In general, CRL showed highselectivity towards(S)-2-methylcarboxylic acids(E= 15-70) and also towards(R)-3-methylcarboxylic acids(E= 15-40). For substrates having a double bond located5-6 bonds from the carbonyl moiety a two-fold enhancement ofenantioselectivity value(E-value) was obtained compared to their saturatedanalogues,E≈ 15-25. Furthermore, the enantioselectivity of CRL towards a seriesof 3- to 8-methyldecanoic acids were studied. CRL surprisinglyshowed enantiorecognition for all of these acids within theE-value range of 2.3-68. Interestingly, whereas the lipaseshowed S-preference when the methyl group was situated ateven-numbered carbons, R-preference was observed for thesubstrates with the methyl group at odd-numbered carbons. In order to establish the stereoisomeric composition of thenatural sex pheromone of the pine sawflyMicrodiprion pallipes, all sixteen individual isomers of3,7,11-trimethyl-2-tridecanol (and their propionate esters)found in this species were synthesised in highdiastereoisomeric purities, 95.3-97.6%. The syntheses werebased on six enantiomerically pure building blocks, the fourstereoisomers of 1-lithio-2,6-dimethyloctane and the twoenantiomers ofcis-3,4- dimethyl-g-butyrolactone. <b>Keywords:</b>lipase,Pseudomonas cepacia,Candida rugosa, enantioselective, enantiomeric ratio,primary 2-methylalcohol, substituted-methylcarboxylic acid,pine sawfly,Microdiprion pallipes, sex pheromone,3,7,11-trimethyl-2-tridecanol, stereoisomer.

<p>This thesis describes the development of new methods for thepreparation of enantiomerically pure methyl branched alkylcompounds and their use as building blocks in the synthesis ofstereoisomerically pure pheromones of pine sawflies.</p><p>The high regioselectivity, enantioselectivity and activityof lipases in organic solvent in conjunction withenvironmentally compatible reaction conditions have madelipase-catalysed synthesis an attractive alternative toconventional synthetic methods in organic chemistry. The lipasefrom<i>Pseudomonas cepacia</i>(PCL) was used in kineticresolutions of primary 2- methylalcohols by acylation of thealcohols with vinyl acetate/vinyl butyrate. For alcoholsstudied, PCL showed moderate enantioselectivity<i>(E</i>= 10-20) towards 3-alkyl- or 3- cycloalkylsubstitutedprimary 2-methylpropanols, whereas 3-aryl-2-methyl-1-propanolswere accepted with high E-values<i>(E</i>>100).</p><p>Esterification of substituted methylcarboxylic acids withprimary alcohols catalysed by<i>Candida rugosa</i>lipase (CRL) was found to be anenantioselective reaction. In general, CRL showed highselectivity towards<i>(</i>S)-2-methylcarboxylic acids<i>(E</i>= 15-70) and also towards<i>(</i>R)-3-methylcarboxylic acids<i>(E</i>= 15-40). For substrates having a double bond located5-6 bonds from the carbonyl moiety a two-fold enhancement ofenantioselectivity value<i>(</i>E-value) was obtained compared to their saturatedanalogues,<i>E</i>≈ 15-25.</p><p>Furthermore, the enantioselectivity of CRL towards a seriesof 3- to 8-methyldecanoic acids were studied. CRL surprisinglyshowed enantiorecognition for all of these acids within theE-value range of 2.3-68. Interestingly, whereas the lipaseshowed S-preference when the methyl group was situated ateven-numbered carbons, R-preference was observed for thesubstrates with the methyl group at odd-numbered carbons.</p><p>In order to establish the stereoisomeric composition of thenatural sex pheromone of the pine sawfly<i>Microdiprion pallipe</i>s, all sixteen individual isomers of3,7,11-trimethyl-2-tridecanol (and their propionate esters)found in this species were synthesised in highdiastereoisomeric purities, 95.3-97.6%. The syntheses werebased on six enantiomerically pure building blocks, the fourstereoisomers of 1-lithio-2,6-dimethyloctane and the twoenantiomers of<i>ci</i>s-3,4- dimethyl-g-butyrolactone.</p><p><b>Keywords:</b>lipase,<i>Pseudomonas cepaci</i>a,<i>Candida rugos</i>a, enantioselective, enantiomeric ratio,primary 2-methylalcohol, substituted-methylcarboxylic acid,pine sawfly,<i>Microdiprion pallipe</i>s, sex pheromone,3,7,11-trimethyl-2-tridecanol, stereoisomer.</p>

La synthèse d'esters de l'acide benzoïque par voie enzymatique en milieu hétérogène microaqueux est envisagée. Cette estérification est possible et est catalysée par la lipase de <i>Candida rugosa</i> en suspension dans un mélange hexane/toluène. Le toluène permet la solubilisation de l'acide benzoïque. De nombreux paramètres influencent la synthèse des benzoates de méthyle et de butyle. La teneur en eau initiale agit uniquement sur la cinétique de réaction sans modifier de manière notable la position de l'équilibre de réaction. Il est préférable, dans la mesure du possible, de travailler à une activité en eau fixée au départ pour s'affranchir d'artefacts liés à la désorption de la pellicule aqueuse entourant les grains d'enzyme. Une approche par les plans d'expériences montre l'influence de plusieurs paramètres et de certaines interactions entre facteurs sur la cinétique et sur l'évolution de la réaction. La vitesse initiale spécifique décroit linéairement avec la fraction de toluène dans des milieux organiques contenant plus de 40% de toluène. Par contre, la variation de la Vi(sp) avec la teneur en enzyme est dépendante de la nature de l'alcool et de sa concentration. les effets de la proportion de toluène dans le mélange et de la teneur en enzyme sont expliqués par la variation de la concentration en substrats dans la pellicule aqueuse entourant l'enzyme. La vitesse initiale de production du benzoate de 1-butyle est modélisée et réalisée dans un mélange équivolumique hexane/toluène à une activité en eau initiale de 0,65. La cinétique suit un schéma réactionnel de type bi bi ping-pong avec inhibition par l'alcool si les concentrations en substrats dans la pellicule aqueuse sont prises en compte. En particulier, la concentration en acide benzoïque dans cette phase est dépendante de la concentration en 1-butanol. Ce travail démontre que la technique d'ajout d'eau dans le système, la variation des coefficients de partage des substrats entre milieu organique et pellicule aqueuse, la nature de l'alcool et les phénomènes d'inhibition par les alcools permettent d'expliquer les variations de vitesses initiales spécifiques. Enfin, ce système catalytique permet d'obtenir ces benzoates avec des taux de conversion supérieurs à 95% et peut- être employé à la synthèse d'autres benzoates.

En vue d’effectuer des préparations sélectives de composés hétérocycliques, une étude de la synthèse et de la réactivité de 7-oxanorborna-2,5-diènes portant des groupes électroattracteurs différents sur les positions 2 et 3 a été réalisée. Ces composés sont des formes masquées de composés acétyléniques dissymétriques.Dans un premier temps, nous avons optimisé une nouvelle méthode de synthèse sélective d’acétylènedicarboxylates dissymétriques par mono-transestérification d’acétylènedicarboxylates de dialkyle symétriques avec des alcools en présence de la lipase de Candida rugosa. Cette méthode nous a permis d’obtenir les diesters dissymétriques avec de bons rendements et une haute sélectivité a priori inattendue.Dans un second temps, nous avons développé des synthèses régiosélectives de dérivés de l’acide 7-oxanorborna-2,5-diène-2,3-dicarboxylique selon deux stratégies. Dans une première approche, une réaction de Diels-Alder intramoléculaire entre un furane et un composé acétylénique reliés par une agrafe siliciée a été réalisée, suivie d’une coupure des liaisons Si-C. Cette cycloaddition [4+2] s’effectue uniquement en présence de MeAlCl2 avec des rendements moyens. Dans certains cas, la coupure des liaisons Si-C conduit aux diesters désirés. Dans une deuxième approche, une mono-saponification d’oxanorbornadiène-2,3-dicarboxylates de dialkyle a permis d’accéder régiosélectivement à des monoacides et des réactions de couplage avec des amines ou des alcools ont conduit sélectivement à des dérivés présentant deux groupes électroattracteurs différents.Dans une dernière partie, nous avons effectué la préparation régiosélective de 3-pyrrolines par cycloaddition [2+3] d’un ylure d’azométhine suivie d’une réaction de rétro-Diels-Alder à partir des 7-oxanorbornadiènes comportant deux groupes électroattracteurs différents. La préparation aisée de 3-pyrrolines condensées non décrites dans la littérature a été obtenue par formation inattendue d’un motif succinimide dans le cas des amidoesters.En conclusion, il apparaît que la présence du groupe éthyle en tête de pont des 7-oxanorborna-2,5-diènes semble suffisante pour contrôler la régiosélectivité de ces cycloadditions. / In order to selectively prepare heterocyclic compounds, a study of the synthesis and reactivity of 7-oxanorborna-2,5-dienes with different electron-withdrawing groups on the 2 and 3 positions was performed. These compounds are masked forms of unsymmetrical acetylenic compounds. At first, we have optimized a new method for the selective synthesis of unsymmetrical diesters by transesterification of symmetrical dialkyl acetylenedicarboxylates in the presence of Candida rugosa lipase. This unexpectedly highly selective method allowed us to obtain unsymmetrical acetylenedicarboxylates in good yields.In a second part, we have developed a regioselective synthesis of 7-oxanorborna-2,5-diene-2,3-dicarboxylic acid derivatives according to two strategies. In one approach, an intramolecular Diels-Alder reaction between a furan and an acetylenic compound connected by silicon-containing tethers was performed, followed by a cleavage of the Si-C bonds. This [4+2] cycloaddition was carried in the presence of a Lewis acid, only MeAlCl2 gave the expected product and so in moderate yields. In most cases, the cleavage of Si-C bonds leads to the desired diesters. In a second approach, a mono-saponification of dialkyl oxanorbornadiene-2,3-dicarboxylates provided access regioselectively to mono-acids and coupling reactions with amines or alcohols selectively led to poly-functionalized products containing two different electron-withdrawing groups.In the last part, we have regioselectively prepared 3-pyrrolines by [2+3] cycloaddition of an azomethine ylide to 7-oxanorbornadienes bearing electroattracting groups followed by a retro-Diels-Alder reaction. An easy synthesis of previously unknown condensed 3-pyrrolines was obtained by formation of an unexpected succinimide pattern from amidoesters. In conclusion, it appears that the presence of an ethyl group on the bridgehead carbon atom of 7-oxanorborna-2,5-dienes seems sufficient to control the regioselectivity of these cycloadditions.