Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / Las levaduras del género Candida son patógenos oportunistas que se encuentran como comensales en la cavidad oral. Candida glabrata ha emergido como un importante agente patogénico en la mucosa oral. Recientemente, se ha descrito la colonización por levaduras en pacientes con periodontitis, estimándose que aproximadamente un 20 % de éstos portan levaduras en sacos periodontales. Hay pocos estudios que identifiquen aislados de C. glabrata en sujetos con periodontitis. En un estudio previo realizado en el laboratorio de Bioquímica y Biología Oral, se identificaron presuntivamente 60 aislados de la especie C. glabrata en diversos nichos orales de sujetos periodontalmente sanos y pacientes con periodontitis crónica y agresiva. El propósito de este estudio fue corroborar la identidad de las especies presuntivamente identificadas y medir la variabilidad genética y diversidad genotípica de estos aislados dentro y entre individuos. La re-identificación de levaduras se realizó mediante la prueba bioquímica API ID32C y la técnica de PCR-RFLP, amplificando la región ITS1-5.8S-ITS2 rDNA y cortando el amplicón con la enzima MspI. La variabilidad genética, la diversidad genotípica y el análisis de agrupamiento se realizaron mediante la técnica de RAPD-PCR, usando dos partidores de la serie operón y la asistencia del programa computacional TreeCon. De los 60 aislados analizados, sólo el 93,3 % fue re-identificado como C. glabrata, el resto, 6,7 %, correspondió a 4 aislados de un sujeto periodontalmente sano que fueron identificados como C. albicans. El coeficiente de similitud promedio ( S ) fue de 0,849. Se obtuvieron 10 genotipos en total y dos clusters genotípicos principales, constituidos por aislados no relacionados entre sí, evidenciando heterogeneidad genética de éstos dentro y entre individuos. El mayor S promedio y la mayor diversidad genotípica ( G ) fueron encontrados en los aislados de levaduras recuperados de un paciente con periodontitis crónica y agresiva, respectivamente. La realización de este estudio es importante porque permitirá aportar al conocimiento de esta especie, sus características fenotípicas y genéticas y ayudar AB 1 AB así a esclarecer la posible relación entre la presencia de levaduras del género Candida en sitios subgingivales enfermos.

<p>&Scaron;iroka upotreba imunosupresivnih terapija zajedno sa antimikotičnim terapijama &scaron;itokog spektra značajno je povećala učestalost povr&scaron;inskih i sistemskih infekcija uzrokovanih patogenim kvascem Candida glabrata. Zbog povećane rezistentnosti vrste C. glabrata na klasične antimikotike, javila se potreba za pronalaskom novih alternativa u prevenciji i lečenju infekcija izazvanih ovim patogenom. Tokom poslednjih nekoliko godina se u velikoj meri razmatra potencijalni benefit probiotskih mikroorganizama na zdravlje ljudi. Pored primene brojnih probiotskih bakterija, Saccharomyces boulardii je jedina vrsta kvasca za koju je dokazano da poseduje svojstva koja karakteri&scaron;u probiotike.<br />Cilj istraživanja ove doktorske disertacije je ispitivanje uticaja probiotskog kvasca S. boulardii na adheziju kvasca C. glabrata na polistitren povr&scaron;inu pri različitim temperaturama, pH vrednostima i u prisustvu različitih koncentracija tri klinički važna antimikotika kao &scaron;to su flukonazol, itrakonazol i amfotericin B. Hidrofobnost povr&scaron;ine ćelije (CSH) sojeva kvasca C. glabrata je određena u cilju procene korelacije između ove fizičko-hemijske osobine i adhezije na polistiren povr&scaron;inu. Pored toga, ispitana je adhezija kvasca C. glabrata u ko-kulturi sa drugim vrstama mikroorganizama. Testirana su tri soja kvasca C. glabrata, kvasci Candida krusei i Saccharomyces cerevisiae, kao i dve vrste probiotskih bakterija Lactobacillus rhamnosus i Lactobacillus casei. Metoda kori&scaron;ćena za procenu adhezije bila je bojenje kristal violetom, dok je hidrofobnost povr&scaron;ine ćelije sojeva kvasca C. glabrata određena testom Mikrobne adhezije na ugljovodonike.<br />Na&scaron;i rezultati su pokazali da uprkos neadhezivnosti ćelija probiotskog kvasca S. boulardii, ovaj probiotik je značajno uticao na sposobnost adhezije kvasca C. glabrata. Ovaj efekat je bio veoma zavisan od sojeva vrste C. glabrata, i bio je antagonistički ili sinergistički. &Scaron;to se tiče faktora životne sredine, temperatura nije pokazala značajan uticaj na modulatorni efekat probiotskog kvasca S. boulardii, dok pri visokoj pH vrednosti, probiotski kvasac nije uspeo da potisne adheziju sojeva kvasca C. glabrata. Sličan efekat je primećen u eksperimentima sa antimikoticima, gde su povećane koncentracije antimikotika smanjile modulatorni efekat S. boulardii na adheziju C. glabrata. Sojevi vrste C. glabrata u ko-kulturi sa neadhezivnim patogenim sojevima vrsta C. krusei i S. cerevisiae su pokazali slabiju adheziju nego u ko-kulturi sa neadhezivnim probiotskim sojevima vrste S. boulardii, L. rhamnosus i L. casei. &Scaron;to ukazuje da se adhezivnost dve odvojene kulture ne može korisiti za predviđanje adhezivnosti njihove ko-kulture. Nije utvrđena korelacija između hidrofobnosti povr&scaron;ine ćelije i adhezije na polistiren povr&scaron;inu sojeva kvasca C. glabrata, &scaron;to ukazuje da hidrofobnost ćelijskog zida ne mora uvek da bude precizna mera adhezivnog potencijala.</p> / <p>Following the widespread use of immunosuppressive therapy together with broadspectrum antimycotic therapy, the frequency of mucosal and systemic infections caused by the pathogenic yeast Candida glabrata has increased in the past decades. Due to the resistance of C. glabrata to existing azole drugs, it is very important to look for new strategies helping the treatment of such fungal diseases. An increasing number of potential health benefits are being attributed to probiotic treatments. They include various bacterial probiotics, while among yeast only Saccharomyces boulardii (nom. nud.) is used extensively as a probiotic and often marketed as a dietary supplement.<br />The aim of this doctoral dissertation is to investigate the effect of the probiotic yeast S. boulardii on the adhesion of C. glabrata to polystyrene surface at different temperatures, pH values, and in the presence of three clinically important antifungal drugs, namely fluconazole, itraconazole, and amphotericin B. The cell surface hydrophobicity (CSH) of the tested C. glabrata strains has been determined as well in order to test for a possible correlation between this physico-chemical property and the ability to adhere to polystyrene surface. In addition, Candida krusei, Saccharomyces cerevisiae, two bacterial probiotics Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus casei were tested in a co-culture with C. glabrata as well. The method used to assess adhesion was crystal violet staining. The CSH of C. glabrata strains was determined using the Microbial Adhesion To Hydrocarbon (MATH) test. Our results showed that despite the nonadhesiveness of S. boulardii cells, this probiotic significantly affected the adherence ability of C. glabrata. This effect was highly dependent on C. glabrata strain and was either antagonistic or synergistic. Regarding the extrinsic factors, temperature did not indicate any significant influence on this S. boulardii modulatory effect, while at high pH, S. boulardii did not manage to repress the adhesion of C. glabrata strains. Similar effect was observed in the experiments with antimycotics, where increased concentrations of antimycotic reduced the modulatory effect of S. boulardii on C. glabrata adhesion. C. glabrata strains in the co-cultures with non-adhesive pathogenic strains C. krusei and S. cerevisiae showed weaker adhesion than in co-cultures with non-adhesive probiotic strains S. boulardii, L. rhamnosus and L. casei. This indicates that the adhesiveness of two separate cultures could not be used to predict the adhesiveness of their co-culture. Further, there is no correlation between cell surface hydrophobicity and adhesion of C. glabrata strains to the polystyrene surface, which indicates that the hydrophobicity of the cell wall must not always be the precise measure of the adhesive potential.</p>

Orientador: Altair Antoninha Del Bel Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-17T15:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gomes_PriscilaNogueira_D.pdf: 18801720 bytes, checksum: 026aef1649b772f202792184935cb7cb (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O biofilme de Candida spp. formado na superfície de próteses removíveis, é o principal fator etiológico da candidose, sendo a C. albicans e a C. glabrata as espécies mais prevalentes nesta condição. O antifúngico fluconazol (FLZ) é frequentemente utilizado no tratamento da candidose, porém o sucesso tem sido limitado devido a resistência desenvolvida pela Candida a esse medicamento. Considerando a importância da estrutura e morfologia do biofilme de Candida na candidose, o objetivo neste estudo foi avaliar o efeito de FLZ na bioatividade, bioestrutura e morfologia celular de biofilmes de Candida spp. desenvolvidos na presença deste antifúngico. Espécimes (10 mm x 2 mm) foram confeccionados utilizando resina de poli(metilmetacrilato) (PMMA), polimerizada por banho de água quente. Películas de saliva foram formadas na superfície da PMMA, e biofilmes de um isolado referência e dois isolados clínicos de C. albicans (ATCC 90028, P01, P34) e C. glabrata (ATCC 2001, P11, P31) foram desenvolvidos por 48h. Dois grupos foram formados: controle e experimental. FLZ a 2,56 µg/mL, concentração biodisponivel na saliva, foi adicionado ao meio de cultura do grupo experimental. Os meios de cultura do grupo controle e experimental foram trocados a cada 24 h. As bioatividades dos biofilmes foram avaliadas utilizando análise colorimétrica de redução por XTT. A bioestrutura analisada através do Microscópio Confocal à Laser e a morfologia celular avaliada utilizando o Microscópio Eletrônico de Transmissão. Os dados foram analisados pelo Test t de Student com nível de significância de 5%. A presença do FLZ reduziu a bioatividade de todos os biofilmes de C. albicans (p<0.001), porém não alterou a estrutura e morfologia da C. albicans P34. Quanto à bioatividade e bioestrutura dos biofilmes de C. glabrata, não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos controle e experimental. Pode-se concluir que as alterações da bioatividade, bioestrutura e morfologia celular, como resposta ao tratamento com FLZ, na concentração biodisponível na saliva, depende da cepa de Candida spp. avaliada. / Abstract: Candida spp. biofilm formed on removable denture surfaces is considered the main etiologic factor of candidosis, being the C. albicans and C.glabrata the species most frequently found in this condition. The antifungic fluconazol (FLZ) is commonly used in the treatment of candidosis, however its success is limited due to the resistance developed by Candida to this medicament. Considering the importance of the structure and morphology of Candida biofilms in the candidosis, the aim of this study was to evaluate the effect of FLZ on the bioactivity, biostructure and morphology of Candida spp. biofilms formed in the presence of this antifungal agent. Specimens (10 mm x 2 mm) were fabricated using water bath poly(methylmethacrylate) resin (PMMA). Salivary pellicles were formed on the PMMA surface, and biofilms of a reference strain and two clinical isolates of C. albicans (ATCC 90028, P01, P34) and C. glabrata (ATCC 2001, P11, P31) were developed for a period of 48h. Two groups were formed: control and experimental. FLZ at 2.56 µg/mL, concentration bioavailable in saliva, was added to the medium of the experimental group. The culture mediums of the control and experimental groups were changed at 24 hours. The bioactivities of the biofilms were evaluated with XTT reduction colorimetric assay. The biostructure was analyzed by the Confocal Scanning Laser Microscopy and the cell morphology analyzed by the Transmission Electron Microscopy. The data were analyzed by Student's t-test, with significance level set at 5%. The presence of FLZ decreased the bioactivity of all C. albicans biofilms (p<0.001), it did not change the structure and morphology of P34. As regards C. glabrata biofilms bioactivity and biostructure, no statistically significant differences were found between control and experimental groups for biofilms of all strains. It could be concluded that the alterations in bioactivity, biostructure and cell morphology in response to the treatment with fluconazole, bioavailable concentration present in saliva, depends on the Candida spp. strain / Doutorado / Protese Dental / Doutor em Clínica Odontológica

Orientadores: Altair Antoninha Del Bel Cury, Wander José da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-16T00:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AnaPaulaCoelho_M.pdf: 9359911 bytes, checksum: ce3ea88b4fe614a7aecf6b9d7b4454ed (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os reembasadores para base de prótese, após a exposição à cavidade bucal, apresentam alterações de superfície facilitando a adesão e a colonização por micro-organismos. Para a limpeza de superfície desses materiais são indicados os limpadores químicos para evitar os danos mecânicos que podem ser provocados pelas cerdas das escovas dentais. Assim, o objetivo nesta pesquisa foi avaliar a eficácia de limpadores químicos na remoção de biofilme de Candida spp. desenvolvido sobre a superfície de um reembasador classificado como permanente à base de poli-metilmetacrilato e na prevenção da re-colonização dessa superfície, especialmente a Candida spp., comumente associada ao desenvolvimento da candidíase. Espécimes (10 mm diâmetro X 3 mm altura) de resina acrílica reembasada com um reembasador mais representativo disponível comercialmente teve sua rugosidade de superfície mensurada antes (baseline) e biofilme de C. albicans ATCC 90028 ou C. glabrata ATCC 2001 foi desenvolvido sobre os mesmos. Após a formação dos biofilmes os espécimes foram aleatorizados e submetidos aos tratamentos (n=16): AD - Água destilada (Controle), 15 min; POL - Polident 3 minutos, 3 min; EFF - Efferdent, 15 min; HPS - Hipoclorito de sódio a 0,5%, 10 minutos. Metade destes espécimes (n=8) foi utilizada para determinação da eficácia dos limpadores, utilizando contagem de células viáveis, enquanto os espécimes remanescentes (n=8), após os tratamentos, foram novamente colocados em meio de cultura estéril e incubados por mais 48 h a fim de determinar o efeito dos limpadores na prevenção da recolonização. Após os tratamentos os espécimes tiveram a rugosidade de superfície determinada, considerada pós-tratamento. Alguns espécimes de cada uma das espécies de Candida tiveram a superfície analisada após os tratamentos, por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey HSD em nível de significância de 5%. A rugosidade de superfície foi significantemente maior após os tratamentos (P<0,05). Quantos aos tratamentos, o HPS mostrou-se efetivo tanto para a desinfecção quanto na recolonização de ambas as espécies de Candida, pois houve ausência total de crescimento. Na avaliação da desinfecção, imediatamente após os tratamentos, quando C. albicans foi considerada, não houve diferença significativa entre os peróxidos alcalinos (p>0,05) e ambos diminuíram o número de células fúngicas (p<0,05) comparado ao tratamento com AD. Entretanto, para C. glabrata, os tratamentos com ADD e peróxidos alcalinos não se diferenciaram entre si (p>0,05). Na análise dos resultados para a recolonização foi observada que houve inversão no comportamento, pois enquanto, para C. albicans, os tratamentos com AD e peróxidos alcalinos não diferiram entre si (p>0,05), para C. glabrata os tratamentos com peróxidos alcalinos apresentaram valores similares e menores (p>0,05),quando comparados com o tratamento com AD (p<0,05). Na comparação entre as espécies de Candida observou-se que C. glabrata apresentou os maiores níveis de células viáveis quando os dados foram avaliados na situação de imediatamente após os tratamentos com os peróxidos alcalinos e foi diferente de C albicans (p<0,05). Entretanto não houve diferença para a recolonização (p>0,05). Os resultados sugerem que os limpadores a base de peróxidos alcalinos não foram efetivos na remoção total dos micro-organismos e também não impediram a recolonização por Candida spp / Abstract: The denture liners exhibits surface changes in oral environment by constant loss of its constituent elements, which facilitate microorganisms adherence that leads to biofilm formation. Denture liners surface can be cleaned by brushing or using denture cleaners, which are recommended, in order to avoid mechanic injuries to denture liners by brushing it. Therefore, the aim of this study was to evaluate the long term efficacy of denture cleansers on Candida spp. biofilm recolonization on liner surface. Specimens of poly (methylmethacrilate) were lined according to manufacturer instructions (10 mm diameter X 3.0 mm thickness). Surface roughness was measured at baseline and after the treatments. Next, biofilms of C. albicans ATCC 90028 and C. glabrata ATCC 2001 were allowed to develop on liner surface for 48 h. Subsequently, the specimens were randomly assigned for the cleaning treatments (n=16): distilled water (DW - control), 15 min; Polident 3 minutes (POL) - 3min; Efferdent (EFF)-15 min; sodium hypochlorite (HYP) - 10 min. After the treatments, specimens (n=8) were sonicated for biofilm disruption and the viable cells were counted (cell/mL). To determine the long term effectiveness of the cleaning process, a set of cleaned specimens (n=8) were submitted to new biofilm growth conditions. After 48 h, biofilm were disrupted by sonication and cell number estimated. Scanning electron microscopy was performed to analyze the specimen topography after denture cleanser treatment. Data were analyzed by ANOVA and Tukey's HSD test was used as post-ANOVA employing a significance level fixed at 5%. The liner surface was rougher after the treatments (P<0.05). Results showed significant differences in cleanliness among the treatments (p<0.05), however for Candida species (p<0.05) no significant difference was observed in the recolonization condition (p>0.05). Alkaline denture cleansers showed similar cleaning performance and both showed lower cells counts compared with the control (p<0.05). Hypochlorite was the only effective treatment as no viable cells were detected even after the recolonization test. Within the limits of this study, it can be concluded that alkaline denture cleansers were not effective on biofilm removal, once denture liner surface by Candida spp biofilm recolonization was not prevented / Mestrado / Protese Dental / Mestre em Clínica Odontológica

Orientador: Altair Antoninha Del Bel Cury / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T17:01:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_MariaAureaFeitosa_D.pdf: 2857977 bytes, checksum: 7b67b3ca7a58610f31bdf75ed5e2f13b (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Candida albicans está associada com a etiologia da estomatite protética, patologia que acomete entre 11 a 67% dos usuários de próteses removíveis. Entretanto, mais recentemente, a Candida glabrata tem se destacado por apresentar hidrofobicidade e adesão à superfície de resina acrílica superior à da Candida albicans. Em acréscimo, características de superfície dos materiais como rugosidade (Ra) e energia livre de superfície (ELS) podem contribuir para a adesão de microrganismos. Desse modo, o objetivo desta pesquisa foi avaliar a rugosidade e energia livre de superfície dos rembasadores de próteses à base de poli - metilmetacrilato (Coe Soft e Kooliner) e silicone (Ufi Gel P) antes da contaminação com C. albicans ATCC 90028 e C. glabrata ATCC 2001, bem como verificar a eficácia dos limpadores químicos à base de peróxidos (Polident 3 minutes e Efferdent) e Hipoclorito de sódio a 0,5% na remoção desses microrganismos.Assim, para cada material rembasador foram confeccionadas 64 bases de resina acrílica Onda CryI (25 x 12 x 1mm), preparadas conforme as instruções do fabricante e, reembasadas constituindo dessa forma os corj'i>osde prova. Estes tiveram a rugosidade e energia de superfície determinadas. A seguir, foram separadas aleatoriamente em 2 grupos constituídos de 32 amostras cada, conforme o tipo de Candida. Em seguida, estes foram subdivididos em 4 grupos de 8 de acordo com os tratamentos: G1 - Água destilada (Controle); G2 - Polident ; 3 minutes; G3 - Efferdent; G4 - Hipoclorito de sódio 0,5%. Todas as amostras foram imersas em saliva humana durante'30 minutos para a formação da película adquirida. Posteriormente, foram submetidas ao teste de adesão durante período de 2 horas com uma das candidas, e então submetidos aos tratamentos nos tempos de: G1 - 15 minutos; G2 - 3 minutos; G3 -15 minutos e G4 -10 minutos. A contagem das células remanesce.ntes após o tratamento foi realizada em microscópio de luz (400x). Os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (rugosidade de superfície e aderência fúngica) e ANOVA on Ranks para ELS, com nível de significância de 5%. O rembasador à base de silicone (Ufi Gel P) apresentou os menores valores de rugosidade comparados aos rembasadores à base de poli-imetil metacrilato (Coe 50ft e Kooliner), p<0,05. Entretanto, todos os materiais diferiram entre si para a energia de superfície (p<0,05), sendo que o Coe 50ft e o Ufi Gel P apresentaram os maiores e menores valores, respectivamente. Candida glabrata apresentou o maior número de células remanescentes aderidas, independente do rembasador utilizado (p<0,01). Dentre os limpadores, apenas o hipoclorito de sódio 0,5% diferiu do controle (p=0.001), apresentando um menor número de células remanescentes aderidas. Condui-se que o hipoclorito de sódio a 0,5% foi eficaz na remoção das células aderidas dos rembasadores, independente da espécie de Candida / Abstract: Candida albicans is associated with denture stomatitis etiology, pathology which affect about 11 to 67% of removable prostheses users. However, more recently, the Candida glabrata has been highlighted for presenting superior hydrophobicity and resin acrylic surface adherence when compared to the C. albicans. In addition, surface characteristics' materiais such roughness (Ra) and surface free energy (EL8) may contribute to the microorganisms' adhesion. Thus, the purpose of this study was to evaluate the surface roughness and surface free energy of methyl methacylate liners materiais (Coe 80ft and Kooliner) and silicone (Ufi Gel P) before contamination with C. albicans (ATCC 90028) and C. glabrata (ATCC2001), as well to verify the peroxide chemical denture cleansers efficacy (Polident 3 minutos and Efferdent) and 0.5% sodium hypochlorite - NaOCl, in the miaoorganisms' removing. Thus, 64 rectangular bases measuring 25 x 12 x 1 mm using microwave-polymerized acryli~ resins, following manufacturers' recommendations, to each material were made, then were relined and after surface roughness and surface free energy were measured. Next, the samples were randomly separated by lottery into two groups of 32 each, according to the fungus and these were subdivided into four groups of eight as the treatments: G1 - Distilled water (Control); G2 - Polident 3 min. utes; G3 - Efferdent; G4 - 0,5% NaOCI. Ali the samples rested in human whole saliva for 30 minutes to form an acquired pellicle. After, they were submitted to the adherence assay with one of the fungus for two hours, and then, treated, following these times: G1 - Distilled water (15 minutes); 2 - Polident 3 minutes (3 minutes); 3 - Efferdent (15 minutes); 4 - 0,5% sodium hypochlorite (10 minutes). The adhered cells were counted using a light microscope (Axiostar 2 Plus, Carl Zeiss, Jena, Germany) at 400 x magnification. The data were submitted to the analysis of variance and Tukey test (roughness and fungus adherence) and ANOVA on Ranks for EL8, with significance levei of 5%. The silicone-based liner (Ufi Gel P) showed lower values of roughness compared to the methyl methacrilate-based liners (Coe 80ft and Kooliner), (p<0.05). However, ali these materiais were different among them for surface free energy (p<0.05), where the Coe 80ft and Ufi Gel P showed the highest and lowest values, respectively. Candida glabrata showed the highest number of adhered cells for ali materiais (p<0.01). Among evaluated cleansers, only 0.5% sodium hypochlorite differed from the control (p=0.001), showing the lowest number of remaining cells adhered. The conclusion is that the 0.5% sodium hypochlorite was the only one chemical cleanser efficient in the adhered cells removing in ali denture liners independent of the Candida specie / Doutorado / Protese Dental / Doutor em Clínica Odontológica

C. glabrata est une levure commensale de l’Homme à l’origine d’infections opportunistes chez les patients immunodéprimés. Les neutrophiles sont les premières cellules recrutées sur le site de l’infection. La production de formes réactives de l’oxygène par ces cellules, initiée dans le phagosome par la NADPH oxydase 2 est un évènement majeur de la maturation du phagosome et fait l’objet de l’étude réalisée. L’objectif de ce travail était de développer des outils expérimentaux permettant l’évaluation du stress oxydant subi par C. glabrata lors de son internalisation par les phagocytes. La levure non pathogène S. cerevisiae, phylogénétiquement plus proche de C. glabrata, a été choisie comme organisme contrôle permettant une étude comparative entre les deux levures. C. glabrata est efficacement internalisée en absence d’opsonisation, par la lignée PLB-985-neutrophile contrairement à S. cerevisiae. L’utilisation de sondes organiques pour la mesure des FRO dans le phagosome est limitée puisque que le marquage des levures par ces sondes n’est pas spécifiquement localisé. Le développement de biosenseurs de FRO à partir de protéines fluorescentes, dont la localisation est maitrisée grâce à un système de marquage, est présenté. Les études réalisées suggèrent cependant que les protéines fluorescentes subissent des modifications dans le phagosome indépendantes de la production de FRO. Des tests de viabilité effectués sur les levures après phagocytose montrent que l’élimination des levures dépend fortement de facteurs indépendants de la production de FRO. Plusieurs méthodes indiquent néanmoins que les phagosomes avec C. glabrata contiennent moins de FRO que les phagosomes avec S. cerevisiae. C. glabrata semble éliminer les FRO plus efficacement que S. cerevisiae. / C. glabrata is a human commensal yeast responsible for opportunistic infections in immunocompromised patients. Neutrophils are the first cells to be recruited to the infection site. Production of reactive oxygen species (ROS) in the phagosome by the phagocyte NADPH oxidase 2 is a major event of the phagosome maturation and is the subject of the study. The aim of this work was to develop experimental tools allowing the evaluation of the oxidative stress endured by C. glabrata during its internalization by phagocytes. The non-pathogenic yeast S. cerevisiae, phylogenetically close to C. glabrata, was chosen as a control organism allowing a comparative study between the two yeasts. Unlike S. cerevisiae, non-opsonized C. glabrata is efficiently internalized by the PLB-985 cell line. The utilization of organic dyes for the detection of ROS in the phagosome lacks precision since the staining of the yeasts by those dyes is not specifically localized. The development of ROS biosensors based on fluorescent proteins, whose localization can be controlled due to a new staining procedure, is presented here. However the results suggest that fluorescent proteins undergo modifications in the phagosome independently from the ROS production. Viability tests performed on the yeasts after phagocytosis showed that yeast removal depends mainly on factors independent from ROS production. Several methods indicate nevertheless that the phagosomes of C. glabrata contain less ROS than the phagosome of S. cerevisiae. C. glabrata appears to suppress ROS more efficiently than S. cerevisiae.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T14:08:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 281335.pdf: 2427402 bytes, checksum: fcd04bec714a61e4eedf82f41ef096c9 (MD5) / Candida glabrata é considerado um importante patógeno fúngico emergente devido principalmente ao incremento de pacientes imunossuprimidos, e ao uso indiscriminado de compostos azólicos, resultando em altas taxas de mortalidade pela resistência inata desta levedura aos antifúngicos normalmente utilizados. Estratégias que objetivam a pronta identificação deste patógeno são extremamente importantes já que permitem a pronta implementação de um tratamento medicamentoso apropriado. A utilização de trealose por C. glabrata é apontada como importante metodologia diagnóstica na pratica laboratorial, já que é característica marcante desta levedura a utilização de apenas glicose e trealose como fontes de carbono. Resultados prévios indicavam que esta levedura cresce em trealose graças à secreção no meio de cultura de uma trealase ácida que prontamente hidrolisa o dissacarídeo, permitindo a rápida fermentação da glicose liberada. No genoma de C. glabrata encontramos a ORF CAGL0K05137g, similar ao gene (ATH1) que codifica para a trealase ácida de S. cerevisiae. No intuito de verificar a identidade do gene postulado no genoma de C. glabrata como sendo da trealase ácida, utilizamos tanto estratégias de deleção da ORF do genoma, como subclonagem e expressão heteróloga dessa sequência gênica em S. cerevisiae. A deleção em C. glabrata confirmou a identidade do gene, não só pela ausência de crescimento em meios de cultura contendo trealose como fonte de carbono, como também pela perda da atividade trealase ácida periplasmática e/ou secretada pelas células. Além disso, nossos resultados indicam o envolvimento deste gene na manutenção da homeostase celular durante o estresse salino. A seqüência de DNA correspondente foi também subclonada de forma a sobrexpressar este gene em S. cerevisiae, confirmando o gene CgATH1 como sendo o responsável pela síntese de uma trealase ácida. A ORF clonada foi seqüenciada e comparada à ORF CAGL0K05137g, mostrando uma identidade de 98% entre as sequências. Acreditamos que a caracterização molecular da trealase ácida em C. glabrata permitirá melhorias no diagnóstico laboratorial, bem como uma melhor compreensão do papel desta enzima, e do metabolismo de trealose, na fisiopatologia deste importante patógeno oportunista e de outros fungos de interesse médico. / Candida glabrata is considered an important and emergent fungal pathogen due mainly to an increase in immunosuppressive patients, and to the indiscriminate use of azolic compounds, resulting in high mortality rates by the innate resistance of this yeast towards the normally used antifungals. Strategies that objectify the fast identification of this pathogen are extremely important, because they will allow the immediate implementation of an appropriate medical treatment. The utilization of trehalose by C. glabrata is pointed out as an important diagnostic methodology in the laboratorial practice, since it is a striking feature of the yeast to use only glucose and trehalose as carbon sources. Previous results indicate that this yeast grows in trehalose thanks to the secretion of an acid trehalase in the culture media that promptly hydrolyses the disaccharide, allowing the fast fermentation of the released glucose. In the genome of C. glabrata we found the ORF CAGL0K05137g, similar to the gene (ATH1) encoding for the acid trehalase of S. cerevisiae. In order to verifying the identity of the postulated gene in the genome of C. glabrata as an acid trehalase, we thus utilized strategies for the deletion of the ORF from the genome, as well as cloning and heterologous expression of this genetic sequence in S. cerevisiae. The deletion in C. glabrata confirmed the identity of the gene, not only because of absence of growth in culture media containing trehalose as a carbon source, but also to the loss of periplasmic and/or secreted acid trehalase activity by the cells. Besides, our results indicate the involvement of this gene in the maintenance of cellular homeostasis during a saline stress. The corresponding DNA sequence was also subcloned so that the gene could be overexpressed in S. cerevisiae, confirming the CgATH1 gene as being responsible for the synthesis of an acid trehalase. The cloned ORF was sequenced and compared to the ORF CAGL0K05137g, showing 98% identity between the sequences. We believe that the molecular characterization of the acid trehalase in C. glabrata will allow improvements in the laboratorial diagnostic, as well as a better understanding of this enzyme#s role, and of trehalose metabolism, in the physiopathology of this important opportunistic pathogen and of other fungi of medical interest.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T20:04:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289069.pdf: 722734 bytes, checksum: e7dbc3e1a0538c756cfe254ff14b6aac (MD5) / Candida glabrata é uma levedura encontrada normalmente no trato digestivo humano e mucosas humanas, mas em pacientes imunocomprometidos pode causar infecções sistêmicas de alta morbidade e mortalidade. Esta levedura perdeu vários genes envolvidos no metabolismo de açúcares, sendo capaz de assimilar somente glicose e trealose, uma característica importante no diagnóstico laboratorial deste patógeno emergente. Nosso trabalho se propôs a analisar o metabolismo da trealose, e as enzimas intracelulares (trealase neutra e trealase ácida) envolvidas na degradação deste açúcar. Nossos resultados indicam que embora C. glabrata metabolize a trealose de forma semelhante a outras leveduras (a trealose acumulada na fase estacionária do crescimento é prontamente degradada após suprir as células com glicose), a atividade da trealase neutra nestas células aparentemente não seria responsável pela degradação da trealose uma vez que sua atividade não aumentava no período de maior hidrólise deste açúcar. Nossos resultados também mostram que a alta atividade da trealase ácida presente nas células de C. glabrata, atrapalha a determinação da trealase neutra nestas células (baseado apenas na diferença de pH ótimo da atividade). Neste contexto a utilização de uma linhagem (RY01) deletada no gene CgATH1, e portanto sem atividade trealase ácida, foi fundamental para melhor caracterizar a atividade trealase neutra nesta levedura, e sua possível regulação. Esta enzima não mostrou maior atividade na fase exponencial do crescimento quando a glicose está presente como fonte de carbono, nem ativação por AMPc via proteína cinase A, embora os resultados indiquem que a trealase neutra de C. glabrata degrada trealose na fase exponencial, pois na cepa deletada RY01 observou-se um queda brusca nos níveis de trealose durante esta fase do crescimento. Diferenças significativas foram também observadas na metabolização de trealose durante o estresse térmico em C. glabrata, quando comparada a outras leveduras. / Candida glabrata is a yeast normally found in the human digestive tract and mucous membranes, but in immunocompromised patients can cause systemic infections with high morbidity and mortality. This yeast has lost many genes involved in sugar metabolism, being able to assimilate only glucose and trehalose, an important feature in the laboratory diagnosis of this emerging pathogen. Our study aimed to analyze the metabolism of trehalose, and the intracellular enzymes (neutral trehalase and acid trehalase) involved in its hydrolysis. Our results indicate that although C. glabrata metabolizes trehalose in a similar way as other yeasts (trehalose accumulated during the stationary phase of growth is rapidly hydrolyzed after supplying the cells with glucose), the neutral trehalase activity in this cells seemed not to be involved in trehalose degradation as its activity did not increase during the period of higher sugar hydrolysis. Our results also show that the high activity of the acid trehalase present in C. glabrata cells, impairs the accurate determination of the neutral trehalase in these cells (based only in optimal pH activity differences). In this context, the use of a strain (RY01) deleted in the CgATH1 gene, and consequently without acid trehalase activity, was pivotal to better characterize the neutral trehalase activity in this cells, and its possible regulation. This enzyme did not show higher activity during the exponential phase of growth when glucose is present as carbon source, neither AMPc activation through protein cinase A, although our results indicate that the C. glabrata neutral trehalase hydrolyses trehalose during the exponential phase, since in the RY01 deleted strain a rapid drop in trehalose levels during this growth phase was observed. Significant differences were also observed in trehalose metabolism during heat stress in C. glabrata, when compared with other yeasts.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T11:58:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 231250.pdf: 874276 bytes, checksum: 846bed5b1854a38b996651a325db6b12 (MD5) / A levedura Candida glabrata tem sido apontada como importante patógeno emergente, sendo a segunda espécie mais comumente envolvida na etiologia das candidíases, infectando principalmente indivíduos imunodeficientes e imunocomprometidos. Devido à resistencia natural aos antifúngicos azólicos e à alta taxa de mortalidade associada a C. glabrata, os testes rápidos para sua identificação constituem importante ferramenta para a escolha terapêutica. Este microrganismo se destaca da maioria das leveduras por ser capaz de apenas consumir dois açúcares: a glicose e o dissacarídeo trealose (Gli 1-1 Gli). De fato, os testes rápidos de identificação têm como princípio justamente a habilidade desta levedura em hidrolisar as moléculas de trealose em duas de glicose. Dada a importância da metabolização da trealose para C. glabrata, no presente trabalho foi realizada uma caracterização bioquímica do catabolismo de trealose por esta levedura. Nossos resultados mostram que C. glabrata consome e fermenta eficientemente a trealose presente no meio de cultura, com parâmetros cinéticos e produtividades de biomassa e etanol semelhantes aos observados durante a fermentação da glicose. De fato, o crescimento em trealose não foi afetado pelo inibidor mitocondrial antimicina A, confirmando a eficiente fermentação deste dissacarídeo por C. glabrata. Na fase exponencial de crescimento em trealose foi detectado acúmulo de até 2,5 g/L de glicose no meio, indicando a possível hidrólise extracelular do dissacarídeo. A análise de uma possível atividade trealase na superficie das células revelou a presença de uma trealase ácida com um pH ótimo de 4,4. Esta enzima é sintetizada durante o crescimento em trealose, mas este açúcar não é aparentemente o indutor da atividade uma vez que níveis altos da enzima foram detectados também após o crescimento em glicerol, o mesmo ocorrendo durante a desrepressão das células após o consumo da glicose. Nossos resultados mostram também que C. glabrata secreta a trealase ácida para o meio de cultura, sendo que aproximadamente 30% da atividade enzimática total é secretada após o crescimento em trealose ou glicerol. A trealase ácida secretada para o meio de cultura apresenta uma massa molecular aparente, deduzida por filtração em gel, de 275 kDa na sua forma ativa. Entretanto, a análise de proteínas através de eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE) revelou uma proteína com massa molecular aparente de aproximadamente 130 kDa, que pelo padrão de migração e forte ligação à lectina concanavalina A, indica tratar-se de uma glicoproteína. Esta glicoproteína apresenta uma massa molecular coincidente com o peso teórico da proteína codificada pelo gene CAGLOK05137g de C. glabrata, gene com ~60% de homologia a outras trealases ácidas de leveduras, sugerindo que a enzima ativa seja um dímero. A trealase ácida secretada por C. glabrata apresentou alta afinidade pela trealose, com valores de Km e Vmax de 3,4 mM e 80 U (mg de proteína)-1, respectivamente, além de possuir relativa estabilidade, mostrando-se altamente específica para seu substrato, a trealose. The yeast C. glabrata has been recognized as an important emergent pathogen, and is considered the second most common cause of candidiasis, infecting predominantly immunodeficient and immunocompromised patients. Due to its low sensitivity to antifungal azoles and high mortality, rapid identification tests are important in order to choose the appropriate therapeutic treatment. This microorganism differs from other yeasts because it assimilates only two sugars: glucose and the disaccharide trehalose (Glu 1-1 Glu). Indeed, the rapid identification tests are based on the ability of this yeast to hydrolyze trehalose into two molecules of glucose. Due to the importance that trehalose metabolism has for C. glabrata, in this work a biochemical characterization of trehalose catabolism by this yeast was performed. Our results show that C. glabrata consumes and ferments efficiently the trehalose present in the medium, with kinetic parameters and biomass and ethanol productivities similar to those observed during glucose fermentation. Indeed, growth on trehalose was not affected by the mitochondrial inhibitor antimycin A, confirming the efficient fermentation of this disaccharide by C. glabrata. During the exponential growth phase on trehalose up to 2.5 g/L of glucose was accumulated in the medium, suggesting the possible extracellular hydrolysis of the disaccharide. The analysis of a putative trehalase activity at the cell surface revealed the presence of an acid trehalase with pH optimum of 4.4. This enzyme is synthesized during growth on trehalose, but this sugar seems not to be an inducer of the activity as high levels of this enzyme were also detected after growth on glycerol, the same occurring during the derepression of the cells after glucose consumption. Our results also indicate that C. glabrata secretes the acid trehalase into the medium, and approximately 30% of the total enzymatic activity is secreted after growth on trehalose or glycerol. The acid trehalase secreted into the culture medium shows an apparent molecular mass, deduced by gel filtration, of 275 kDa in its native form. However, the analysis of proteins by denaturant gel electrophoresis (SDS-PAGE) reveled a protein with a molecular mass of approximately 130 kDa, which due to its migration pattern and strong binding to concanavalin A, indicates is a glycoprotein. This glycoprotein has a molecular mass coincident with the theorical weight of the protein encoded by the C. glabrata CAGLOK05137g gene, a gene with ~60% of homology with other yeast acid trehalases, suggesting that the active enzyme is a dimer. The acid trehalase secreted by C. glabrata shows a relative high affinity for trehalose, with Km and Vmax values of 3.4 mM and 80 U (mg of protein)-1, respectively. In addition, this enzyme was relatively stable, and seem to be highly specific for its substrate, trehalose.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-09Bitstream added on 2014-06-13T20:27:58Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_m_me_sjc.pdf: 644379 bytes, checksum: 1cc6342f5a099baa07f73649f18af2d4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A técnica da espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FT-IR) vem sendo largamente empregada como uma abordagem rápida e simples para a identificação de microrganismos, incluindo a do gênero Candida. A proposta deste estudo foi avaliar o emprego da microespectroscopia FT-IR na identificação e discriminação de 5 cepas clínicas de Candida albicans e 3 de Candida glabrata, as quais foram identificadas previamente por meio de métodos convencionais, e mais duas cepas ATCC de cada espécie. As amostras foram analisadas em triplicata, a partir de culturas independentes, por meio de filmes finos obtidos da suspensão em solução salina estéril a 0,85% da biomassa da colônia que ficou incubada por 24 horas em placas com ágar Saboraud Dextrose. Dez espectros com 32 varreduras foram obtidos na forma de ponto em 10 regiões selecionadas aleatoriamente nas amostras. A média foi obtida dos dez espectros de cada amostra para a análise estatística multivariada, dada pela análise de cluster. Além disso os espectros foram transformados em primeira derivada e três janelas espectrais foram determinadas (900-1250 cm-1, 1300-1600 cm-1, 2800-3000 cm-1). A representação dos resultados foi dada pela construção de um dendograma. Nesse, foi possível separar em dois grupos distintos as duas espécies de Candida estudadas. Dessa forma, pode-se concluir que a microespectroscopia FT-IR foi capaz de identificar e discriminar cepas clínicas de Candida albicans e de Candida glabrata, sendo um método promissor para identificação de leveduras / The technique of infrared spectroscopy Fourier transform (FT-IR) has been widely used as a new approach for rapid identification and simple micro-organisms, including the genus Candida. The purpose of this study was to evaluate the use of FT-IR microspectroscopy for the identification and discrimination of 5 clinical strains of Candida albicans and Candida glabrata 3, which were previously identified by conventional methods, and two-standard strains of each species. The samples were analyzed in triplicate from independent cultures by means of thin films obtained from a suspension in sterile saline and 0.85% of the biomass of the colony that was incubated for 24 hours in Sabouraud dextrose agar plates. Ten spectra with 32 scans were obtained in 10 randomly selected regions in the samples.The average of ten spectra was obtained from each sample for the multivariate analysis, given by cluster analysis. In addition, three windows were determined spectral (900-1250 cm-1, 1300-1600 cm-1, 2800-3000 cm-1) and the spectra were transformed into first derivative. The representation of the results was given by the construction of a dendrogram. In this, we separated into two groups of two Candida species studied. Thus, one can conclude that the FT-IR microspectroscopy was able to identify and distinguish clinical isolates of Candida albicans and Candida glabrata is an important method for identification of yeasts