Despite therapeutic advances, opportunistic fungal infectious diseases have increased in prevalence and have become a universal public health problem. Candida albicans (CA) is a commensal fungus that under certain environmental conditions can act as an opportunistic pathogen and colonize mucous membranes and tissues causing local and systemic infections. The emergence of drug resistant strains, as well as the increase of immunosuppressed patients, has limited therapeutic options. Therefore the aim of this study was to evaluate 1) The antifungal activity of Punicalagin (P), alone or in combination with Nystatin (N), against two CA strains. 2) The cytotoxicity effect of P and N, as well as the combination of both, on human primary cells. In the first step, yeasts of CA ATCC 90028 and SC5314 were exposed to P and N for 24 hours. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of P (50 g/mL) and N (3.9 g/mL) were determined by the broth microdilution assay. The Checkerboard Assay was performed to verify the synergism between the combinations (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 and P/2 N/2), which were selected from the 56 combinations initially tested. The fungal metabolism was assessed by the metabolic reduction assay XTT (24h) and Minimum Microbicidal Concentration (MMC) was determined by Colony-forming unit (CFU/mL, 24h). The evaluation of virulence factors gene expression was amplified and quantified by PCR real time (Polymerase Chain Reaction-RT-qPCR, only for P/8 N/4 in 24h). The analysis of proteins related to essential biological processes of the fungus was performed by LC-MS/MS (24h). MIC and MMC of P were significantly reduced in the presence of N, indicating synergism between both. Once the antifungal potential of P was verified, we proposed to evaluate whether this drug acts through the same mechanism of action of N, altering the permeability of the cell membrane of the fungus (binding ergosterol). The evaluation of gene expression has demonstrated upregulation of some genes that may be related to a defense mechanism associated with stress or cell death. The proteomics analysis revealed alterations in the expression of several proteins in the fungi exposed to P/8 N/4 in relation to negative control, correlated with important biological processes, such as, energy metabolism, stress response, drug metabolism, among others. In the second step, cytotoxicity assays involving P and N, as well as the combination of both, were undertaken on human palate epithelial cells (HPEC) and human gingival fibroblasts cells (HGF) by Alamarblue dye. Similarly, P cytotoxicity was reduced when used in combination with N. Based on these in vitro results, the synergistic antifungal activity produced between P and N suggested that the combination of drugs, at the concentrations tested, may be a topical therapeutic or preventive alternative to be used in cases of superficial candidiasis, such as denture stomatitis. / Apesar dos avanços terapêuticos, doenças infecciosas por fungos oportunistas têm aumentado em prevalência e tornaram-se um problema universal de saúde pública. Candida albicans (CA) é um fungo comensal que, sob certas condições ambientais, pode atuar como um patógeno oportunista e colonizar mucosas e tecidos causando infecções locais e sistêmicas. O surgimento de cepas resistentes às drogas convencionalmente utilizadas, assim como aumento de pacientes imunodeprimidos, tem limitado as opções terapêuticas. Portanto o objetivo deste estudo foi avaliar: 1) a atividade antifúngica de Punicalagina (P), com ou sem a associação de Nistatina (N), contra duas cepas de CA. 2) O efeito citotóxico de P e N, assim como suas combinações, em culturas primárias humanas de células epiteliais de palato (CEPH) e de fibroblastos gengivais (FGH). Na primeira etapa, leveduras de CA ATCC 90028 e SC5314 foram expostas a P e N, por 24 horas. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) de P (50 g/mL) e N (3,9 g/mL) foram determinadas pelo método de diluição em caldo. O Ensaio Checkerboard foi realizado para verificar o sinergismo entre as combinações (8: PN, P8 N/4, P/8 N/2, P/8 N, P/4 N/2, P/4 N, P/2 N/4 e P/2 N/2), as quais foram selecionadas a partir de 56 combinações inicialmente testadas. O metabolismo fúngico foi avaliado pelo método do XTT (24h) e a Concentração Mínima Microbicida (CMM) foi realizada através de Unidades formadoras de colônias (UFC/mL, 24h). A avaliação da expressão gênica de fatores de virulência foi amplificada e quantificada por PCR em tempo real (Reação em Cadeia da Polimerase-RT-qPCR, apenas para P/8 N/4 em 24h). A análise proteômica para identificação de proteínas alteradas foi realizada por LC-MS/MS (24h). A MIC e MMC de P foram significativamente reduzidas na presença de N, indicando sinergismo entre ambas. Confirmado o potencial antifúngico, o Ensaio de mecanismo de ação (teste do ergosterol) foi realizado e não foi confirmada a ação de P através da ligação ao ergosterol. A avaliação da expressão gênica demonstrou regulação positiva de alguns genes que pode estar relacionado a um mecanismo de defesa associado ao estress ou a morte celular. A análise proteômica revelou proteínas diferencialmente expressas nos fungos expostos a P/8 N/4 em relação ao controle negativo (sem tratamento), as quais estão relacionadas ao processo de metabolismo energético, resposta ao estress e metabolismo de drogas, dentre outros. Na segunda etapa, CEPH e FGH foram expostas a P e N e suas combinações por 24h para realização dos ensaios de viabilidade por Alamarblue. Combinada à N, a Punicalagina apresentou-se menos citotóxica do que de forma isolada. Com base nesses resultados in vitro, o sinergismo antifúngico produzido entre P e N sugere que a combinação das drogas pode ser uma alternativa terapêutica tópica para ser utilizada nos casos de candidose localizada, como por exemplo, a estomatite protética.

A candidose bucal acomete grande número de pessoas mundialmente, sendo associada a condições como imunossupressão, radioterapia, tabagismo, higiene bucal, idade, xerostomia e uso de próteses removíveis. Uma importante abordagem terapêutica para essas infecções consiste nos medicamentos antifúngicos, que podem apresentar efeitos colaterais e resultar na resistência dos patógenos. Nesse contexto, a terapia fotodinâmica (PDT) faz-se interessante como alternativa capaz de minimizar essas limitações. Protocolos de PDT poderão ser mais facilmente assimilados à prática clínica se empregarem materiais já aprovados para uso odontológico. Sendo assim, este estudo propõe avaliar o uso de PDT com eritrosina como fotossensibilizador, irradiada por um LED azul, usando-se um modelo animal. Quarenta camundongos tiveram candidose induzida sobre o dorso da língua por meio de imunossupressão e inoculação com Candida albicans. Após estabelecimento da lesão durante cinco dias, os animais receberam um dentre quatro tratamentos possíveis: aplicação da eritrosina 5% seguida de irradiação pelo LED (E+L+); aplicação de eritrosina, somente (E+L-); salina seguida pela irradiação (EL+); e somente salina (E-L-). A fim de distinguir possíveis efeitos colaterais, os mesmos tratamentos foram aplicados em 12 camundongos sem a indução de candidose. O número de unidades formadoras de colônia de C. albicans foi contado após o tratamento, e a mucosa foi submetida à análise histológica para determinar o grau de inflamação. Os dados dos grupos foram comparados por meio de ANOVA e teste de Kruskal-Wallis, (α=0,05). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos testados quanto à contagem de colônias de C. albicans e o grau de inflamação. O infiltrado inflamatório foi classificado como discreto na maioria dos casos. Os animais com candidose bucal induzida e os saudáveis que foram submetidos aplicação de eritrosina 5% e irradiação pelo LED apresentaram infiltrado inflamatório mais acentuado e lesões mais evidentes na camada epitelial, sugerindo que este protocolo ocasionou danos aos tecidos orais. / Oral candidosis affects many people worldwide and is associated with conditions such as immunosuppression, radiation, smoking, oral hygiene, age, xerostomia and use of removable prostheses. An important therapeutic approach for these infections consists of antifungal drugs, which have side effects and can result in the resistance of pathogens. In this context, photodynamic therapy (PDT) is an interesting alternative able to overcome those limitations. PDT protocols can be more easily assimilated in clinical practice if they employ materials already approved for use in dentistry. Thus, this study evaluate the PDT with the use of erythrosine as a photosensitizer, irradiated by a blue LED light, using an animal model. Forty mice had candidosis induced on the tongue by the immunosuppression and inoculation with Candida albicans. After five days that the lesion is established, the animals received one of four possible treatments: application of 5% erythrosine and irradiation by the LED (E+L+); erythrosine application, only (E+L- ); saline followed by irradiation (E-L+); and only saline (E-L-). In order to distinguish potential side effects, the same treatments were applied in 12 mice without induced candidosis. Colony-forming units (CFU) of C. albicans were counted after treatment, and the mucosa was subjected to histological analysis to determine the degree of inflammation. The data of the groups were compared using ANOVA and Kruskal-Wallis test (α=0.05). No significant difference was detected among the groups tested for the number of CFU of C. albicans and the degree of inflammation. The inflammatory infiltrate was classified as mild in most cases. Animals with induced oral candidosis and the healthy ones exhibited more pronounced inflammatory infiltrate and lesions in the epithelial layer following PDT by 5% erythrosine and irradiation by the LED light. Such findings suggest that this protocol resulted in damage to oral tissues.

Oropharyngeal candidiasis is a localised infection in the oropharynx region caused by Candida species, predominately C. albicans. It is commonly spread among immunocompromised patients and aggravated by hyposalivation or xerostomia. Current treatment is by systemic antifungals, which might be accompanied by gastrointestinal tract disorders, headache, allergic reactions and drug interactions or Candida becoming resistant to them. In the present work, the anti-candida activity of chlorhexidine diacetate (CHD) was tested as the drug of choice, it has no systemic side effects and microorganisms do not develop resistance against it. Thymol and farnesol were also tested individually and in combination with CHD to investigate a synergistic effect against Candida planktonic cells. The effects of CHD and thymol were investigated against C. albicans biofilm after two hours exposure by testing the metabolic stress, vacuolar activity and protein content. The results of the anti-Candida activity of CHD and thymol based on the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum biocidal concentration (MBC) were 2.5 and 5 μg/ml for the former and 125 and 250 μg/ml for the later. Farnesol did not show an MIC and MBC at the investigated concentrations, however, it increased the MIC and MBC of CHD to 5 and 40 μg/ml and of thymol to 250 and >250 μg/ml, respectively. The antibiofilm activity of CHD and thymol was concentration dependent and CHD was more potent than thymol. A concentration of 20 μg/ml and 2 hours treatment of Candida biofilm grown for 24 hours showed an 85% decrease in oxidative stress, 78% and 60% loss of vacuolar activity and protein content, respectively. The combination of both drugs showed a limited increase in the activity. The cytotoxic effects of CHD and thymol were tested on human embryo kidney epithelial cell line (HEK 293); the metabolic stress, lysosomal activity and protein content were tested. The cytotoxic effects were also concentration dependent and the combination have increased the cytotoxicity. A concentration of 20 μg/ml and 2 hours treatment showed a 40% decrease in oxidative stress and neither the lysosomal activity nor protein content of HEK 293 cells was affected by the treatment Finally, a mucoadhesive hydrogel buccal tablets for the controlled release of CHD were designed and prepared to increase the residence time of an effective concentration of CHD in the oral cavity for two hours. They were prepared using Poloxamer 407 (P407), hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) and either sorbitol, mannitol or xylitol at different ratios. The tablets were investigated for their physical properties, ex vivo mucoadhesion, the rate of hydration, gelling efficiency using image analysis, differential scanning calorimetry (DSC), Fourier transforms infrared spectroscopy (FTIR), X-ray diffractometry (XRD) and in vitro dissolution using Apparatus I and a novel method based on controlled flow rate to mimic salivary drug delivery in the oral cavity. Based on the antibiofilm activity and the cytotoxic effect of CHD a concentration of 20 μg/mL was chosen to be released from the tablets to maintain both efficacy and safety. Accordingly, to maintain this concentration the final formulations were prepared with a 2.5 mg dose of CHD. Tablets analysis showed no chemical interaction with the excipient based on DSC, FTIR and XRD. Furthermore, a novel dissolution method was developed based on a constant flow rate of the dissolution media to mimic oral salivary flow. By comparing CHD release using App I and the flow rate method it was shown that hydrogel-forming tablets successfully controlled the release of CHD regardless of the volume of the dissolution media with approximately 90% release and an average release concentration of 19 μg/ml and 1 ml/min flow rate. This making it a potential candidate for future application for treatment of candidiasis in all types of patients.

O gênero Candida abriga várias espécies de importância médica e embora algumas venham adquirindo interesse crescente, Candida albicans continua sendo a mais importante e responsável pelo maior número de infecções. Encontrada na microbiota de seres humanos saudáveis, é responsável pela infecção oral fúngica mais comum, em relação bastante estreita com a estomatite sob prótese (EP). Esta é um processo inflamatório da mucosa oral, comum em portadores de próteses dentárias, parciais ou totais subjacentes a uma prótese, onde também podem estar outros microrganismos, interagindo com diversos fatores, ligados ao hospedeiro e aos próprios microrganismos presentes no biofilme da superfície interna da prótese. A maioria dos casos é assintomática e alguns pacientes relatam dor, prurido ou sensação de ardência. O diagnóstico é clínico, complementado por exames tais como o citológico e o micológico direto. O tratamento é quase sempre empírico, sem a clara certeza se o indivíduo é portador da levedura e se outras espécies, estão envolvidas. Os meios cromogênicos possibilitaram avanço no diagnóstico das candidíases orais. Sua utilização facilita a identificação destas leveduras, com resultados em menor tempo que os dos métodos já padronizados para outras espécies de Candida. O CHROMagar Candida (CC) é a referência, fornecendo resultados em 48 horas após semeadura direta do material coletado. O meio denominado Candida Chromogenic Agar (CCA), foi recentemente lançado em nosso mercado e tendo em vista o seu baixo custo parece ser mais uma ferramenta para o diagnóstico da candidíase, embora não haja, ainda, literatura disponível sobre o seu emprego. O objetivo do presente trabalho, foi comparar esse novo meio ao CHROMagar Candida, quanto à sensibilidade e especificidade no isolamento de espécies do gênero Candida da mucosa oral de portadores de próteses totais superiores, com ou sem sintomas de EP. Participaram do estudo, 61 pacientes, de ambos os gêneros, portadores de próteses totais (45,9%) ou uni maxilares superiores (54,1%). Dentre as 61 amostras coletadas, 45 (73,77%) foram positivas para leveduras em CC, sendo C. Albicans (38 amostras, 24 únicas e e 14 (36,84%) mistas. Destas, 8 de C. Albicans + C. Tropicalis (21,05%); 3 de C. Albicans + C. glabrata (7,89%); 3 de C. albicans + C. tropicalis + C. glabrata (7,89%). Outras espécies presentes foram, 15 C. tropicalis (33,33%). Duas únicas (13,33%), duas mistas, C. tropicalis + C. glabrata (13,33%) e uma C. tropicalis + C. parapsilosis (6,66%). Em CCA, das 45 amostras, 39 foram positivas (86,6%). C. albicans, foi a mais frequente, com 33 isolados (84,6%), sendo, 25 únicas (75,75%) e 8 mistas (24,25%). Assim, C. albicans + C. tropicalis (5 12,82%); C. albicans + C. glabrata (2 5,13%); C. albicans + C. tropicalis + C. glabrata (uma 2,56%). Outras espécies isoladas foram: C. tropicalis (3 7,7%), e C. glabrata, C. krusei e C. parapsilosis (uma de cada 2,56%). Foi possível concluir que o CHROMagar Candida foi mais sensível (100% x 65%) e mais específico para albicans (84,4% x 73,3%); tropicalis (33,3% x 20,0%) e glabrata (17,7 % x 8,8%). Ambos apresentaram a mesma especificidade (2,2%), para krusei e parapsilosis. / The genus Candida includes several species of medical importance and although some will acquire increasing interest, Candida albicans remains the most important and responsible for more infections. Found in the microbiota of healthy humans, is responsible for the most common oral fungal infection in very close relation with denture stomatitis (EP). This is a frequent inflammation of the oral mucosa in complete or partial dentures wearers, where may also be present other microorganisms, interacting with several factors linked to the host and the microorganisms present themselves, in the inner surface of the biofilm of the prostheses. Most cases are asymptomatic and some patients report pain, itching or burning sensation. The diagnosis is clinical, supplemented by tests such as cytological and mycological. Treatment is often empiric, with no clear certainty whether the individual is only a carrier of yeast and if other species are involved. The chromogenic media enabled advances in the diagnosis of oral candidiasis. Its use facilitates the identification of these yeasts, resulting in less time than those of already standardized methods for other species of Candida. The CHROMagar Candida (CC) is the reference, providing results in 48 hours from the material collection. The medium called Chromogenic Candida Agar (CCA) was recently launched in our market and in view of its low cost seems to be one more tool for the diagnosis of candidiasis, although there is a lack of literature available on it. The objective of this study was to compare this new medium to CHROMagar Candida for sensitivity and specificity in the isolation of species of genus Candida from the oral mucosa of patients with upper dentures with or without symptoms of EP. Sixty one patients of both genders were recruited wearing complete dentures (45.9%) or uni upper jaw (54.1%) prostheses. Among the 61 samples, 45 (73.77%) were positive for yeasts in CC, and C. albicans (38 samples, 24 unique and 14 (36.84%) mixed. From these, 8 of C. albicans + C. tropicalis (21.05%), 3 of C. albicans + C. glabrata (7.89%), 3 of C. tropicalis + C. albicans + C. glabrata (7.89%). Other species were present, being 15 C. tropicalis (33.33%). Two unique isolates (13.33%), two mixed: C. tropicalis + C. glabrata (13.33%) and C. tropicalis + C. parapsilosis (6.66%). In CCA, from the 45 samples, 39 were positive (86.6%). C. albicans was the most frequent, with 33 isolates (84.6%), being unique in 25 (75.75%) and eight in mixed cultures (24.25%). Thus, C. albicans + C. tropicalis (5 - 12.82%); C. albicans + C. glabrata (2 - 5.13%), C. tropicalis + C. albicans + C. glabrata (1- 2.56%). Other species isolated were C. tropicalis (3 7.7%) and C. glabrata, C. krusei and C. parapsilosis (one of each - 2.56%). It was possible to conclude that CHROMagar Candida was more sensitive (100% vs. 65%) and more specific for C. albicans (84.4% vs. 73.3%), C. tropicalis (33.3% vs. 20.0%) and C. glabrata (17.7% vs. 8.8%). Both media showed the same specificity (2.2%), for C. krusei and C. parapsilosis.

O aumento na incidência de infecções fúngicas e a alta toxicidade ou elevado índice de resistência associado aos antimicóticos comerciais, criou um mercado carente de novas drogas. Neste contexto, os peptídeos antimicrobianos (AMPs) surgem como uma alternativa promissora ou fonte de conhecimento por desempenhar ação inibidora de crescimento e/ ou letal contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, fungos, parasitas e/ ou vírus, além de atividade antitumoral e efeito imunomodulador. Como os mecanismos pelos quais eles o fazem são diferentes daqueles das drogas não peptídicas, os AMPs estão pouco associados ao desenvolvimento de resistência microbiana. A hemoglobina (Hb) é uma fonte de peptídeos com funções biológicas diversas. O fragmento 33-61 (Hb33-61) da cadeia α da Hb bovina foi o primeiro AMP descrito a ser gerado in vivo no trato gastrointestinal do carrapato Boophilus microplus. Nossos estudos posteriores usando CD e H1-RMN revelaram que a amidação C-terminal deste fragmento o tornava ainda mais ativo que o primeiro e que em presença de micelas de SDS o Hb33-61a apresenta uma dobra β na porção N-terminal (Lys40-Phe43) e outra (Ser49- Ser52) seguida de α-hélice no C-terminal (Ala53-Ala60), bem como um segmento Pro44-Leu48 capaz de mover-se independentemente e agir como uma dobradiça. Nossas investigações usando análogos sintéticos truncados do Hb33-61a mostraram que o Hb40-61a poderia ser sua porção mínima ativa por apresentar comportamento conformacional idêntico. Nossos estudos subsequentes enfocando as suas propriedades evidenciaram a sua capacidade de causar morte rápida de cepas de Candida, incluindo C. albicans resistentes ao fluconazol e extravasamento de conteúdo e formação de poros em LUVs, revelando sua ação permeabilizante de membrana. Em continuidade ao estudo do Hb40-61a, investigamos no presente trabalho as suas propriedades e o seu mecanismo de ação contra C. albicans. Para isso, sintetizamos, purificamos e caracterizamos esta hemocidina, o seu análogo inteiro composto por D aminoácidos (ent-Hb40-61a) e o seu análogo marcado com 5 (6) carboxifluoresceína (FAM-Hb40-61a). Ensaios com eritrócitos humanos confirmaram a baixa atividade hemolítica desses AMPs em meio de alta e baixa força iônica. O análogo ent-Hb40-61a apresentou a mesma atividade antifúngica que o análogo L, evidenciando um mecanismo de ação não-estereoespecífico. Análises de células de Candida tratadas com FAM-Hb40-61a por microscopia confocal mostraram que em ½ MIC e MIC o peptídeo deposita-se na membrana plasmática e é internalizado, respectivamente. Citometria de fluxo demonstrou que na MIC cerca de 97% das células encontram-se marcadas pelo peptídeo, confirmou a influência negativa da alta força iônica em sua atividade, mostrou que a internalização celular na MIC é independente da temperatura e que a alteração no metabolismo energético da célula afeta de maneira negativa a internalização do peptídeo. Ensaios de permeabilidade celular com Syto 09 e iodeto de propídeo confirmaram danos progressivos à membrana plasmática de C. albicans com o aumento da concentração do Hb40-61a. Experimentos usando DiBAC4(5) e de DPH revelaram que o Hb40-61a altera o potencial de membrana e afeta sua fluidez, respectivamente. Imagens preliminares das células tratadas e não tratadas com Hb40-61a por microscopia de força atômica (AFM) sugeriram alterações nas células de C. albicans após tratamento com a hemocidina. Medidas preliminares do diâmetro médio das células de C. albicans revelaram que elas diminuem após o tratamento com o peptídeo, o que pode ser mais um indício de dano à membrana plasmática por formação de poros e extravasamento de conteúdo intracelular. Assim, obtivemos fortes indícios de que o alvo do Hb40-61a é, de fato, a membrana plasmática das células de Candida, de que ele apresenta potencial de uso tópico para tratamento de candidíase e pode servir como modelo para o desenho de novas drogas antimicrobianas, peptídicas ou não, com propriedades ainda mais valiosas e índices terapêuticos mais elevados. Testes preliminares mostraram que é possível a adsorção do Hb40-58a à nanopartículas de PSS e que, em relação ao peptídeo livre, este arranjo mantém a atividade antifúngica com MIC superior e apresenta menor atividade hemolítica. / The increased incidence of fungal infections and the high toxicity or high level of resistance associated with conventional antimycotics created a demand for new drugs. Antimicrobial peptides (AMPs) constitute a promising alternative and/or an important source of knowledge due to their growth inhibitory action and/or lethality against Gram-positive and Gram-negative bacteria, fungi, parasites and/or viruses. Besides, AMPs display antitumoral and immunomodulator effects. As their mechanisms of action are different from those of non-peptide drugs, AMPs are less associated with the development of antimicrobial resistance. Hemoglobin (Hb) is a source of peptides with diverse biological functions. The fragment 33-61 (Hb33-61) of bovine Hb α chain was the first AMP reported to be generated in vivo in gastrointestinal tract of Boophilus microplus. Our studies of Hb33-61 using CD and H1-NMR showed that amidation of its C-terminal (Hb33-61a) increases its activity; in the presence of SDS micelles, Hb33-61a is characterized by a central hinge joining the C-terminal region (containing a β turn followed by a helical element) to the N-terminal region (that presents only a β turn). Our previous investigations using synthetic truncated analogues of Hb33-61a suggested that Hb40-61a could be its minimal active portion as it presented equal biological and structural properties. Our subsequent studies focusing on its properties showed its ability to quickly kill Candida albicans strains (including those resistant to fluconazole) and to cause leakage of the contents of LUVs and pore formation in GUVs, revealing its membrane permeabilizing action. We further investigated the properties of Hb40-61a and its possible mechanism of action against C. albicans. To do it, we synthesized, purified and chemically characterized it, its all-D analogue (ent-Hb40-61a) and its analogue labeled with 5 (6) carboxyfluorescein (FAM-Hb40-61a). Tests using human erythrocytes confirmed the low toxicity of these hemocidins at high or low ionic strength. The ent-analogue was as active as the all-L compound suggesting a non stereospecific mechanism of action. Confocal microscopy analysis of Candida cells treated with FAM-Hb40-61a showed that at ½ MIC and MIC, the peptide deposits on the plasma membrane and is internalized, respectively. Flow cytometry results showed that at the MIC about 97% of the cells are marked by the peptide, confirmed the negative influence of high ionic strength on its antifungal activity and showed that the cellular internalization at the MIC is partially dependent on ATP, but independent on the temperature. Cell permeabilization assays using Syto 09 and propidium iodide confirmed progressive damage of the membrane as a function of Hb40-61a concentration. Experiments employing DiBAC4 (5) and DPH revealed that the Hb40- 61a alters the membrane potential and affects its fluidity, respectively. Preliminary atomic force microscopy (AFM) images of C. albicans cells before and after treatment with Hb40-61a suggested morphological changes in the plasma membrane. Preliminary measurements of the average diameters of the fungal cells indicated size reduction after treatment with the Hb40-61a probably resulting from pore formation and leakage of cell contents. Thus, we obtained strong evidences that the target of this peptide is indeed the plasma membrane of Candida cells. Thus, this hemocidin have the potential to be used topically for treating candidiasis and/or serve as model for the design of new antimicrobial drugs, peptide or non-peptide, with even more valuable properties and improved therapeutic indexes. Preliminary tests confirmed the possibility of adsorbing Hb40-58a to nanoparticles of polystyrene sulfate (PSS) and that resulting assembly is still active and less hemolytic than the free peptide.

Este estudo clínico-laboratorial identificou as espécies de Candida do palato e prótese de indivíduos desdentados totais com estomatite relacionada à prótese (ERP) e avaliou o efeito de soluções desinfetantes para higiene de próteses totais sobre Candida spp.. Sessenta participantes foram distribuídos aleatoriamente em 04 grupos paralelos (n=15); orientados a escovar as próteses e o palato 3 vezes ao dia e imergi-las nas soluções salina (C controle), Hipoclorito de sódio a 0,25% (HS0,25%), Ricinus communis a 10% (RC10%) ou Cloramina T a 0,5% (CT0,5%) por 20 minutos. Amostras de biofilme foram coletadas da prótese e palato no Baseline, após 7 e 37 dias do uso das soluções e semeadas em meio CHROMagar Candida. Após período de incubação foi realizada a identificação presuntiva, verificação da incidência e quantificação de crescimento das espécies de Candida (contagem de UFC). Cepas ATCC das espécies mais incidentes clinicamente foram avaliadas no estudo laboratorial. Biofilmes de C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata foram formados sobre espécimes em resina acrílica termopolimerizável e imersos nas soluções por 20 minutos. Água destilada foi utilizada como controle. As variáveis de resposta foram crescimento de colônias (contagem de UFC), metabolismo celular (método de XTT), produção de enzimas hidrolíticas (kits específicos), formação de hifas (contagem de células em câmara de Newbauer) e quantificação de células vivas (microscopia de epifluorescência). A capacidade de remoção de biofilme pelas soluções também foi avaliada por meio de microscopia de epifluorescência. Para o estudo clínico, análises descritivas foram utilizadas para interpretação dos dados quanto às características sociodemográficas da amostra, identificação e incidência das Candida spp. Os resultados de crescimento celular (UFC) foram analisados pelos Testes Kruskal-Wallis e Friedman. Para o estudo laboratorial, os resultados foram analisados por teste Anova (One-way) e Tukey (capacidade de crescimento e metabolismo celular de C. albicans e C. tropicalis), teste de Kruskal-Wallis (metabolismo celular de C. glabrata; produção de enzimas hidrolíticas; formação de hifas; capacidade de remoção de biofilme) e teste de Wilcoxon (comparação entre quantidade de biofilme vivo e biofilme total). Empregou-se um nível de confiança de 95% (α= 0,05). As espécies mais incidentes foram C. albicans, seguida de C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei. O HS 0,25% reduziu a incidência das três espécies na prótese e palato nos períodos de 7 e 37 dias; o CT 0,5% promoveu redução de Candida spp. somente nas próteses totais. O R. communis diminuiu a incidência de C. tropicalis em ambos os sítios de coleta. Para contagem de UFC, o HS 0,25% e CT 0,5% causaram redução significativa para cepas clínicas e ATCC. O R. communis, in vitro, reduziu a quantidade de UFC de C. glabrata. O HS 0,25% obteve os melhores valores contra atividade metabólica, formação de hifas, manutenção de células vivas e remoção do biofilme das espécies de Candida. As soluções de RC 10% e CT 0,5% causaram diminuição da atividade metabólica. Não houve diferença significante na produção de proteinase por C. albicans e C. tropicalis após exposição às diferentes soluções desinfetantes, com exceção da C. glabrata, em que todas as soluções causaram aumento significativo da produção desta enzima. As soluções não influenciaram a produção de fosfolipase. A CT 0,5% e RC 10% apresentaram resultados intermediários para manutenção de células vivas. A Cloramina T foi mais eficiente que o R. communis para remoção do biofilme de C. albicans e C. tropicalis e menos eficiente para remoção de biofilme de C. glabrata. As soluções de Hipoclorito de sódio a 0,25% e Cloramina T a 0,5% apresentaram os melhores resultados como solução de imersão frente às variáveis estudadas, podendo ser indicadas para uso clínico como desinfetantes para próteses totais. / This clinical-laboratory study identified the Candida species from the palate and complete dentures of edentulous individuals with prosthesis-related stomatitis (PRS) and evaluated the effect of disinfectant solutions for denture hygiene on Candida spp. Sixty participants were randomly assigned in 04 parallel groups (n = 15); They were oriented to brush their prostheses and the palate 3 times a day and immerse them in saline solution (C-control), 0.25% Sodium hypochlorite (HS0.25%), 10% Ricinus communis (RC10%) or 0.5% Chloramine T (CT 0.5%) for 20 minutes. Biofilm samples were collected from the prosthesis and palate in the baseline, after 7 and 37 days of use of the solutions and seeded in CHROMagar Candida medium. After incubation period, the presumptive identification, incidence verification and quantification of Candida species growth (CFU count) were performed. ATCC strains of the most clinically incident species were evaluated in the laboratory study. C. albicans, C. tropicalis and C. glabrata biofilms were formed on heatpolymerised acrylic resin specimens and immersed in the solutions for 20 minutes. Distilled water was used as control. The response variables were colony growth (UFC count), cell metabolism (XTT method), production of hidrolytic enzymes (specific kits), formation of hyphae (counting cells in Newbauer\'s chamber) and quantification of live cells (epifluorescence microscopy). The ability of biofilm removal by the solutions was also evaluated by means of epifluorescence microscopy. For the clinical study, descriptive analyzes were used to interpret the data regarding the sociodemographic characteristics of the sample, identification and incidence of Candida spp. The cell growth results (CFU) were analyzed by the Kruskal-Wallis and Friedman tests. For the laboratorial study, the results were analyzed by the Anova (One-way) and Tukey test (growth capacity and cellular metabolism of C. albicans and C. tropicalis), Kruskal-Wallis test (cellular metabolism of C. glabrata; hidrolytic enzymes production; formation of hyphae; ability to remove biofilm) and Wilcoxon\'s test (comparison of the amount of live biofilm and total biofilm). A confidence level of 95% (α = 0.05) was used. The most incident species were C. albicans, followed by C. tropicalis, C. glabrata and C. krusei. HS 0.25% reduced the incidence of the three species on the prosthesis and palate in the periods of 7 and 37 days; CT 0.5% promoted reduction of Candida spp. only in dentures. R. communis decreased the incidence of C. tropicalis in both collection sites. For CFU counts, HS 0.25% and CT 0.5% caused significant reduction for clinical strains and ATCC. R. communis, in vitro, reduced the amount of CFU of C. glabrata. The HS 0.25% obtained the best values compared to the metabolic activity, hyphae formation, maintenance of living cells and removal of the biofilm of Candida species. The solutions of RC 10% and CT 0.5% caused the decrease in the metabolic activity. There was no significant difference in proteinase production by C. albicans and C. tropicalis after exposure to different disinfectant solutions, except C. glabrata, in which all solutions caused a significant increase in the production of this enzyme. The solutions did not influence phospholipase production. A CT 0.5% and RC 10% presented intermediate results for the maintenance of living cells. Chloramine T was more efficient than R. communis for biofilm removal from C. albicans and C. tropicalis; and less efficient for biofilm removal from C. glabrata. The solutions of 0.25% Sodium Hypochlorite and 0.5% Chloramine T presented the best results as immersion solution compared to the studied variables and can be prescribed for clinical use as disinfectants for total dentures.

A candidíase é a mais freqüente infecção fúngica oportunista, causada por leveduras do gênero Candida, de ocorrência comum na cavidade bucal. O aumento da incidência está relacionado, em grande parte, ao surgimento das terapias e patologias imunossupressoras, embora ela possa ocorrer em indivíduos considerados saudáveis. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a microbiota leveduriforme de pacientes com lesão bucal suspeita de candidíase e compará-la com a de indivíduos saudáveis através da quantificação, produção de enzimas fosfolipase, proteinase e determinação da CIM dos antifúngicos: anfotericina B, itraconazol e fluconazol pelo método de microdiluição em caldo. As leveduras foram isoladas a partir de amostras de saliva não estimulada no meio CHROMagar® Candida, que permitiu a observação de colonização mista e uma identificação presuntiva. Posteriormente os isolados foram identificados pela metodologia clássica, através das provas: formação de tubo germinativo em soro humano, estudo da micromorfologia, crescimento a 37°C e 42°C, provas de assimilação e fermentação de carboidratos. Das 100 amostras de saliva dos pacientes com lesão, 70 apresentaram crescimento de leveduras e foram identificadas 63 C. albicans e 16 C. tropicalis. Entre as 50 amostras de salivas do grupo controle, 16 apresentaram crescimento e foram identificadas 14 C. albicans e 3 C. tropicalis. Quanto à capacidade de síntese das exoenzimas observou-se que 100% das C. albicans de ambos os grupos avaliados produziram as enzimas fosfolipase e proteinase em diferentes níveis de atividade. Os isolados de C. tropicalis não apresentaram produção da fosfolipase, com relação à proteinase 43,8% dos isolados de pacientes com lesão bucal foram positivos. Em relação aos testes de sensibilidade, a faixa da CIM para anfotericina B foi de 0,125 ? 4µg/mL para os isolados de C. albicans e de 2 ? 4 µg/mL para os de C. tropicalis, com o itraconazol o intervalo da CIM foi de 0,03 ? 16µg/mL para as duas espécies e para o fluconazol a faixa da CIM foi de 0,125 - ?64µg/mL para os isolados de C. albicans e de 0,25 - ?64µg/mL para os de C. tropicalis. Com base nos resultados obtidos conclui-se que: a análise de saliva é sensível para detecção de leveduras tanto em pacientes com sinais clínicos de candidíase quanto em indivíduos saudáveis portadores da levedura; C. albicans foi à espécie mais isolada em ambos os grupos; todas os isolados de C. albicans foram produtores das enzimas fosfolipase e proteinase; nenhum isolado de C. tropicalis apresentou atividade da enzima fosfolipase. A maioria dos isolados de C. albicans e C. tropicalis foram sensíveis in vitro aos antifúngicos testados / Candidiasis is the most frequent oportunistic fungal infection. It is caused by Candida yeasts, commonly seen in the oral cavity. Newer therapies and immunosupressive pathologies are related to the increase of oral candidiasis incidence, although it may occur in healthy subjects. Therefore, the aim of this work was to evaluate yeasts frequency in the oral cavity from patients with clinical signs of oral candidiasis and compare it with frequency observed in healthy subjects through quantification, phospholipase and proteinase activity tests and antifungal susceptibility (amphotericin B, itraconazole, fluconazole) by broth microdilution test. The yeasts were isolated from unstimulated whole saliva samples in CHROMagar® Candida medium, which allowed association between two or more species observation and presumptive identification. Latter, strains identification were confirmed by classical methodology. Of 100 candidiasis patients samples, yeast growth was observed in 70 samples and 63 C. albicans and 16 C. tropicalis strains were identified. Of 50 healthy subjects samples, yeast growth was observed in 16 samples and 14 C. albicans e 3 C. tropicalis strains were identified. Differential activity of phospholipase and proteinase enzymes was detected in 100% C. albicans strains in both groups. Phospholipase activity was not detected in C. tropicalis strains, and proteinase activity was detected in 43,8% strains from oral candidiasis group. Susceptibility tests showed amphotericin B MIC range from 0,125 ? 4 µg/mL for C. albicans strains and 2 ? 4 µg/mL for C. tropicalis strains; itraconazole MIC range from 0,03 ? 16 µg/mL for both species; fluconazole MIC range from 0,125 - ? 64 µg/mL for C. albicans strains and 0,25 - ? 64 µg/mL for C. tropicalis strains. In conclusion, our study demonstrates that saliva analysis is sensitive to detect yeasts from patients with clinical signs of oral candidiasis and from yeasts carriers; C. albicans was prevalent in both groups; all C. albicans strains showed phospholipase and proteinase activity; None C. tropicalis strains showed phospholipase activity. The majority of C. albicans and C. tropicalis strains were inhibited in vitro by antifungals evaluated

Introdução: A Candida spp é considerada uma das principais causas de infecção fúngica invasiva em unidades de terapia intensivas neonatais (UTIN), sendo a terceira levedura mais comum isolada de culturas de sangue, podendo levar a septicemia e óbito. Objetivos: O objetivo deste estudo foi analisar a incidência da C. parapsilosis em candidemias em UTI-N nos últimos sete anos e investigar as possíveis causas do surto durante este período. Método: Foram revisados os prontuários dos neonatos com candidemia incluídos no estudo entre os anos de 2002 a 2008 e isoladas amostras das mãos dos 71 funcionários que tinham contato direto com os recém-nascidos e do sangue dos recém-nascidos acometidos por candidemia em um surto ocorrido no período de maio de 2004 a julho de 2005. As técnicas utilizadas para a análise das amostras biológicas foram: (i) identificação dos isolados pela micologia clássica e bioquímica (Auxanograma, Zimograma e API ID32), (ii) a análise do DNA genômico por meio do Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE) e Ramdomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) e (iii) seqüenciamento da região conservada ITS1/ 4. Resultados: Os resultados obtidos, no período de 2003 a 2005 demonstraram que houve um aumento significativo de aproximadamente 75% nos casos de C. parapsilosis confirmando a ocorrência de um surto de candidemia. Nos isolados destes recém nascidos, 80% das leveduras recuperadas foram identificadas como C. parapsilosis, e nos funcionários este agente foi recuperado em 11% das amostras. A análise do polimorfismo genômico destas amostras, pelos métodos PFGE e RAPD apresentou baixo poder discriminatório entre os isolados dos recém-nascidos e funcionários, não os correlacionado. Conclusões: Os resultados obtidos confirmam a ocorrência de um surto da C. parapsilosis no período de 2003 a 2005 na UTI-N, apesar de não ter sido possível identificar a fonte de origem deste agente. O aumento da incidência da C. parapsilosis na UTI-N no período de 2002 a 2008 e a caracterização de um surto entre os anos de 2003 a 2005 pode ser utilizado como indicador da necessidade de iniciativas de melhoria nas práticas de controle de infecção hospitalar e profilaxia de infecções na unidade de cuidados intensivos neonatais. / Introduction: Candida spp is considered one of the main causes of fungal invasive infection in the neonatal intensive care unit (NICU), and the third most common yeast isolated in blood cultures that could lead to septicemia and death. Objectives: This studys goal is to analyze the incidence of C. parapsilosis in NICU candidemias in the past seven years and investigate possible causes for an outbreak during this time period. Method: Clinical files of neonates with candidemia included in the study between 2002 and 2008 were revised, and hand samples of 71 employees that came into direct contact with newborns, and neonate candidemia infected blood samples were isolated, which occurred during an outbreak between May 2004 and July 2005. Techniques used to analyze the biological samples, were: (i) isolates identification by classic mycology and biochemistry (Auxanogram, Zymogram and API ID32), (ii) genomic DNA analysis by means of Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and (iii) ITS1/ 4 preserved area sequence. Results: Results obtained between 2003 and 2005 showed a significant increase of approximately 75% in C. parapsilosis cases, confirming the occurrence of a candidemia outbreak. In these neonate isolates, 80% of the retrieved yeast was identified as C. parapsilosis, and on employees this agent was retrieved in 11% of the samples. The genomic polyphormism analysis of theses samples, using PFGE and RAPD methods, presented a non-correlating, low discriminatory strength between neonate and employee isolates. Conclusions: Obtained results confirmed the C. parapsilosis outbreak from 2003 to 2005 in the NICU, although it was not possible to identify the origin source of this agent. The increase of C. parapsilosis incidence in the NICU between 2002 and 2008, and the characteristics of an outbreak from 2003 to 2005, can be used as an indication for the need of improved initiatives in the control of hospital infection and infection prophylaxis in the Neonatal Intensive Care Unit.

A gomesina é um peptídeo antimicrobiano catiônico, purificado dos hemócitos da aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana. Possui amplo espectro de atividade contra bactérias, fungos, protozoários e células tumorais. Candida albicans é uma levedura comensal que faz parte da microbiota humana. O tratamento desta micose geralmente é feito com fluconazol, contudo casos de resistência vêm sendo reportados, com isso vários peptídeos antimicrobianos vêm sendo estudados a fim de se tornarem tratamentos alternativos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficácia do tratamento com a gomesina em um modelo de candidíase disseminada e vaginal. O tratamento de gomesina foi eficaz no controle do fungo. Verificou-se um efeito imunomodulatório, pois seu tratamento aumentou as concentrações de IL-6, TNF-<font face=\"symbol\">a e INF-<font face=\"symbol\">g dos rins dos animais com candidíase disseminada. A gomesina não apresentou nenhum efeito tóxico para os animais. Os dados apresentados neste estudo reforçam o potencial da gomesina para ser um agente. / The gomesin is a cationic antimicrobial peptide, purified from hemocytes of the spider Acanthoscurria gomesiana. It has a broad spectrum of activity against bacteria, fungi, protozoa and tumor cells. Candida albicans is commensal yeast that is part of the human microbiota. The treatment of this mycosis is usually done with fluconazole although cases of resistance have been reported. With the emergence of microorganisms resistance, several antimicrobial peptides have been studied in order to become alternative treatments. This study aimed to evaluate the effectiveness of treatment with gomesin in a model of disseminated and vaginal candidiasis. The treatment with gomesin showed to be effective in controlling the fungus. There was also found an immunomodulatory effect as its treatment increased concentrations of IL-6, TNF-<font face=\"symbol\">a and INF-<font face=\"symbol\">g in the kidneys of animals with disseminated candidiasis. The gomesin did not show any toxic effect to animals. The data presented in this study reinforce the potential of gomesin to be an antifungal agent.

Introdução: A Candida spp é considerada uma das principais causas de infecção fúngica invasiva em unidades de terapia intensivas neonatais (UTIN), sendo a terceira levedura mais comum isolada de culturas de sangue, podendo levar a septicemia e óbito. Objetivos: O objetivo deste estudo foi analisar a incidência da C. parapsilosis em candidemias em UTI-N nos últimos sete anos e investigar as possíveis causas do surto durante este período. Método: Foram revisados os prontuários dos neonatos com candidemia incluídos no estudo entre os anos de 2002 a 2008 e isoladas amostras das mãos dos 71 funcionários que tinham contato direto com os recém-nascidos e do sangue dos recém-nascidos acometidos por candidemia em um surto ocorrido no período de maio de 2004 a julho de 2005. As técnicas utilizadas para a análise das amostras biológicas foram: (i) identificação dos isolados pela micologia clássica e bioquímica (Auxanograma, Zimograma e API ID32), (ii) a análise do DNA genômico por meio do Pulsed Field Gel Eletrophoresis (PFGE) e Ramdomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) e (iii) seqüenciamento da região conservada ITS1/ 4. Resultados: Os resultados obtidos, no período de 2003 a 2005 demonstraram que houve um aumento significativo de aproximadamente 75% nos casos de C. parapsilosis confirmando a ocorrência de um surto de candidemia. Nos isolados destes recém nascidos, 80% das leveduras recuperadas foram identificadas como C. parapsilosis, e nos funcionários este agente foi recuperado em 11% das amostras. A análise do polimorfismo genômico destas amostras, pelos métodos PFGE e RAPD apresentou baixo poder discriminatório entre os isolados dos recém-nascidos e funcionários, não os correlacionado. Conclusões: Os resultados obtidos confirmam a ocorrência de um surto da C. parapsilosis no período de 2003 a 2005 na UTI-N, apesar de não ter sido possível identificar a fonte de origem deste agente. O aumento da incidência da C. parapsilosis na UTI-N no período de 2002 a 2008 e a caracterização de um surto entre os anos de 2003 a 2005 pode ser utilizado como indicador da necessidade de iniciativas de melhoria nas práticas de controle de infecção hospitalar e profilaxia de infecções na unidade de cuidados intensivos neonatais. / Introduction: Candida spp is considered one of the main causes of fungal invasive infection in the neonatal intensive care unit (NICU), and the third most common yeast isolated in blood cultures that could lead to septicemia and death. Objectives: This studys goal is to analyze the incidence of C. parapsilosis in NICU candidemias in the past seven years and investigate possible causes for an outbreak during this time period. Method: Clinical files of neonates with candidemia included in the study between 2002 and 2008 were revised, and hand samples of 71 employees that came into direct contact with newborns, and neonate candidemia infected blood samples were isolated, which occurred during an outbreak between May 2004 and July 2005. Techniques used to analyze the biological samples, were: (i) isolates identification by classic mycology and biochemistry (Auxanogram, Zymogram and API ID32), (ii) genomic DNA analysis by means of Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and (iii) ITS1/ 4 preserved area sequence. Results: Results obtained between 2003 and 2005 showed a significant increase of approximately 75% in C. parapsilosis cases, confirming the occurrence of a candidemia outbreak. In these neonate isolates, 80% of the retrieved yeast was identified as C. parapsilosis, and on employees this agent was retrieved in 11% of the samples. The genomic polyphormism analysis of theses samples, using PFGE and RAPD methods, presented a non-correlating, low discriminatory strength between neonate and employee isolates. Conclusions: Obtained results confirmed the C. parapsilosis outbreak from 2003 to 2005 in the NICU, although it was not possible to identify the origin source of this agent. The increase of C. parapsilosis incidence in the NICU between 2002 and 2008, and the characteristics of an outbreak from 2003 to 2005, can be used as an indication for the need of improved initiatives in the control of hospital infection and infection prophylaxis in the Neonatal Intensive Care Unit.