A resistência bacteriana a antibióticos é um grave e crescente problema de saúde pública de âmbito mundial. O principal, e mais eficiente, mecanismo de resistência aos &#946-lactâmicos em bacilos Gram-negativos é a produção de &#946-lactamases, que possuem a capacidade de hidrolisar o anel &#946-lactâmicos e consequentemente inativar essa classe de antibióticos. Vale ressaltar, que atualmente os antibióticos &#946-lactâmicos são os mais utilizados clinicamente, particularmente em infecções graves. Dentre as &#946-lactamases existentes destacam-se as carbapenemases, enzimas capazes de inativar a maioria dos antibióticos &#946-lactâmicos. Uma grande preocupação é o fato dessas enzimas, em sua maioria, serem codificadas por plasmídeos, o que propicia a disseminação desses genes de resistência; portanto, é de extrema importância a realização de um rápido e efetivo monitoramento da presença de patógenos portadores desses genes de resistência, para que assim se possa prevenir a disseminação desses determinantes. Foram incluídos neste estudo 230 amostras únicas de Acinetobacter e Pseudomonas aeruginosa resistentes a imipenem detectados em pacientes internados em hospitais privados da cidade de São Paulo durante o período de fevereiro a outubro de 2013. As amostras foram avaliadas quanto à hidrólise de imipenem por espectrofotometria, quanto à presença de genes de carbapenemases por PCR e sequenciamento, e quanto à clonalidade por eletroforese em campos pulsados (PFGE) ou ERIC-PCR. Foram realizados ensaios de conjugação, transformação e sequenciamento completo de plasmídeos. Dentre as amostras de Acinetobacter spp. 80% (88) foram capazes de hidrolisar o imipenem. Dentre esses 76,1% (67) foram positivos para blaOXA-51-like, 19,3% (17) foram positivos para blaOXA-72. blaOXA-23, blaOXA-482 e blaIMP-1 foram detectados isoladamente em isolados distintos. O gene blaIMP-1 foi detectado em A. ursingii inserido em integron de classe 1 e representa a primeira descrição no Brasil. Uma nova carbapenemase OXA-482-like foi detectada em A. baumanii. Utilizando-se ERIC-PCR, observou-se uma grande diversidade de grupos clonais, com o máximo de quatro isolados por grupo. Dentre as amostras de P. aeruginosa, apenas 35,3% foram capazes de hidrolisar o imipenem. Dessas amostras, 14 possuíam o gene blaSPM-1, e isolados únicos possuíam, individualmente, os genes blaIMP, blaVIM, blaKPC-2 ou blaGES-23. O gene blaKPC-2 foi detectado inserido em contexto genético diferente dos descritos anteriormente, em plasmídeo IncU de 32 Kb, mobilizável, mas não conjugativo. Esta é a primeira descrição da sequencia completa de plasmídeo albergando o gene blaKPC-2 em P. aeruginosa no Brasil. Nas demais amostras (20) com atividade hidrolítica, não foram detectados genes de carbapenemase conhecidos, o que sugere a presença de genes de carbapenemase ainda não descritos. Em três amostras foi possível obter transformantes com plasmídeos, resistentes a carbapenêmicos. As amostras com blaSPM-1 apresentaram perfis de PFGE estreitamente relacionados. Em contraste, os perfis de PFGE das amostras com potenciais novas carbapenemases apresentaram índice de similaridade de Dice inferior ix a 80%, evidenciando grande diversidade clonal. Nossos achados evidenciam que a carbapenemase não intrínseca predominante em Acinetobacterem hospitais privados da cidade de São Paulo é OXA-72, e em hospitais privados há uma grande diversidade clonal. Em P. aeruginosa, a carbapenemase predominante é SPM-1, cuja disseminação é mediada por um único clone. Há potencialmente um número significativo de novas carbapenemases em Acinetobacter e P. aeruginosa, algumas delas mediadas por plasmídeos. / Bacterial resistance to antibiotics is a serious and growing public health problem worldwide. The main and most efficient mechanism of resistance to &#946-lactams in Gram-negative bacilli is the production of &#946-lactamases, which have the ability to hydrolyze the &#946-lactam ring and consequently inactivate this class of antibiotics. It is worth mentioning that currently &#946-lactam antibiotics are the most used clinically, particularly in severe infections. Among the existing &#946-lactamases, carbapenemases are capable of inactivating most &#946-lactam antibiotics. A major concern is that these enzymes are mostly encoded by plasmids, which facilitates the spread of these resistance genes; therefore, it is of extreme importance to carry out a rapid and effective monitoring of the presence of pathogens bearing these resistance genes, in order to prevent the dissemination of these determinants. This study included 230 unique samples of imipenem-resistant Acinetobacterand Pseudomonas aeruginosa detected in patients hospitalized in private hospitals in the city of São Paulo during the period from February to October 2013. The samples were evaluated for the imipenem hydrolysis by spectrophotometry, the presence of carbapenemase genes by PCR and sequencing, and concerning clonality by pulsed field electrophoresis (PFGE) or ERIC-PCR. Conjugation, transformation and complete sequencing of plasmids were performed. Among Acinetobacter spp. samples, 80% (88) were able to hydrolyze imipenem. Among these, 76.1% (67) were positive for blaOXA-51-like genes and 19.3% (17) were positive for blaOXA-72. The blaOXA-23, blaOXA-482 and blaIMP-1 genes were detected alone in distinct isolates. The blaIMP-1 gene was detected in A. ursingii inserted in class 1 integron and represents the first description in Brazil. A novel OXA-482-like carbapenemase was detected in A. baumanii. Using ERIC-PCR, a great diversity of clonal groups was observed, with a maximum of four isolates per group. Among P. aeruginosa samples, only 35.3% were able to hydrolyze imipenem. Of these samples, 14 had the blaSPM-1 gene, and single isolates individually possessed the blaIMP, blaVIM, blaKPC-2 or blaGES-23 genes. The blaKPC-2 gene was found inserted in a genetic context different from those described previously, in a mobilizable, but not conjugative, 32 Kb IncU plasmid. This is the first description of the complete nucleotide sequence of a plasmid harboring the blaKPC-2 gene in P. aeruginosa in Brazil. In the remaining samples (20) with hydrolytic activity, no known carbapenemase genes were detected, suggesting the presence of carbapenemase genes not yet described. In three samples it was possible to obtain transformants with plasmids, resistant to carbapenems. Samples with blaSPM-1 showed closely related PFGE profiles. In contrast, the PFGE profiles of the samples with potential new carbapenemases showed Dice similarity index lower than 80%, evidencing a great clonal diversity. Our findings show that the predominant non-intrinsic carbapenemase in Acinetobacter in the city of São Paulo is OXA-72, and in private hospitals there is great clonal diversity. In P. aeruginosa, the predominant carbapenemase is SPM-1, the spread of this enzyme is mediated by a single clone. There are potentially a significant number of new carbapenemases in Acinetobacter and P. aeruginosa, some of them plasmid mediated.

Notre travail de thèse a porté sur la recherche des bactéries multirésistantes zoonotiques dans les fèces des animaux du bassin méditerranéen, région pour laquelle peu de données sont disponibles. Cette thèse s’articule autour de quatre objectifs principaux ; (1) épidémiologie et prévalence des bactéries productrices de β-lactamases et de carbapénèmases chez les poulets d’Algérie, (2) étude et détection de la résistance plasmidique à la colistine chez les animaux d’Algérie, (3) recherche de vecteur et/ou réservoirs de bactéries zoonotiques résistantes à la colistine, (4) épidémiologie des bactéries résistantes à la colistine chez les humains en France, au Laos et au Liban. A travers ces investigations nous avons montré l’émergence et la dissémination du gène mcr-1 chez les animaux (poulets et caprins) dans plusieurs sites en Algérie. Nous avons également rapporté la détection de souches résistantes à la colistine dans des isolats humains en France et au Liban. Ces travaux ont participé à la description de l’épidémiologie du gène mcr-1 dans le monde chez les animaux et les humains et soulèvent la question du devenir de l’usage de la colistine chez l’homme et l’animal. Pour faire face à ces risques, nous pensons que des mesures de restriction d’usage des antibiotiques (y compris de la colistine) chez les animaux doivent s’appliquer, notamment en Algérie, pour limiter la propagation de ces gènes de résistance à l’homme. Il apparait donc nécessaire et urgent de mettre en place des enquêtes de surveillance de l’usage des antibiotiques chez les animaux notamment en Algérie pour éviter la propagation de souches résistantes chez l’homme. / This thesis is divided into 6 chapters with four objectives; (1) the epidemiology and prevalence of β-lactamases in chickens from Algeria, (2) contribution to the study and detection of plasmid resistance to colistin in animals from Algeria, (3) vectors/ reservoirs of zoonotic bacteria resistant to colistin, and (4) Epidemiology of bacteria resistant to colistin in humans in France, Laos and Lebanon.Throughout these investigations, we can conclude that there is an emergence and spread of mcr-1 in animals (chickens and goats) in several sites in Algeria. We also noted the detection of colistin-resistant bacteria in human isolates in France and in Lebanon. This indicates a spread of mcr-1 and colistin resistance genes worldwide in animals and humans and raises the question on the colistin usage in animals. To prevent this end, we believe that restrictions on the use of antibiotics (including colistin) should be applied, particularly in Algeria, to limit the spread of these resistance genes. Use control of colistin should be routinely performed in humans and animals through colistin resistance surveys in animals and humans.

The prevalence of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and carbapenemases is increasing worldwide. Therapeutic options for infections with these bacteria are limited not only by the production of ESBLs and carbapenemases, which confer resistance to cephalosporins and carbapenems, but also by frequent co-resistance to other antibiotics. The overall aim of this thesis was to obtain a better understanding of multidrug-resistant E. coli and K. pneumoniae in relation to epidemiology, selection and susceptibility to antibiotic therapy. In a prospective study ESBL-producing E. coli was found to spread easily through international travel. Twenty-four of 100 Swedes travelling outside Northern Europe acquired ESBL-producing E. coli in the intestinal flora. The risk was highest for travelers visiting India and those suffering from gastroenteritis during travel. To minimize selection of ESBL-producing K. pneumoniae during a hospital outbreak with these bacteria, an educational antibiotic intervention was performed at Uppsala University Hospital in 2006. The primary aim of the intervention was to reduce the consumption of parenteral cephalosporins. An immediate and radical reduction of cephalosporins was demonstrated with interrupted time series analysis. The outbreak declined during 2007 and no increased resistance to replacement antibiotics was detected. The impact of ESBL production on the antibacterial activity of ertapenem was studied in time-kill experiments. It was shown that porin-deficient subpopulations with reduced susceptibility to ertapenem frequently emerged in ESBL-producing E. coli during exposure to ertapenem at concentrations simulating human pharmacokinetics. Further, the antibacterial effects of antibiotic combinations against four strains of K. pneumoniae producing carbapenemases of the metallo-beta-lactamase type were studied in time-kill experiments. Double and triple combinations of aztreonam, fosfomycin, meropenem, rifampin and colistin at clinically relevant static concentrations were effective despite that the bacteria were frequently resistant to the individual drugs. These results indicate that there is a largely unexplored potential of antibiotic combination therapy for multidrug-resistant K. pneumoniae.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

P. aeruginosa e espécies de Acinetobacter são causas comuns de diversas infecções em pacientes hospitalizados, principalmente nos internados em centros de tratamento intensivo. Além disso, esses microrganismos se destacam por apresentarem resistência, intrínseca e adquirida, a várias classes de antibióticos, conferindo à bactéria fenótipos de multirresistência e panresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação de integrons (elementos genéticos que carreiam genes de resistência), de genes codificadores de metalo--lactamases, da perda de porinas (canais protéicos da membrana externa), e da atividade de efluxo aumentada, como determinantes do fenótipo de multirresistência e panresistência. Foram estudadas 147 P. aeruginosa e 57 Acinetobacter spp. isolados de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, no período de 2003 a 2006. O perfil de sensibilidade destes isolados foi determinado por disco de difusão e utilizado para classificá-las como multirresistentes (MDR) e não multirresistentes (n-MDR). A variabilidade clonal dos isolados foi investigada por PFGE. Os isolados pertencentes aos grupos MDR e n-MDR foram investigados quanto a presença de integrons de classe 1, 2 e 3, por PCR e análise de RFLP. Os cassetes gênicos contidos nestes integrons, assim como genes codificadores de carbapenemases (ex. IMP, VIM e SPM), foram detectados por PCR e identificados por seqüenciamento. Avaliação da expressão gênica de bombas de efluxo (mexB, mexY, mexD e adeB) e de porina (OprD) foi conduzida por real-time RT-PCR. Os dados apresentados para os isolados do grupo MDR foram comparados àqueles do grupo n-MDR e a associação entre os determinantes de resistência e o fenótipo MDR foi calculada estatisticamente. Fenótipo de multiresistência foi observado em 42,2% e 84,2% das P. aeruginosa e Acinetobacter spp. estudadas. Nenhum isolado bacteriano apresentou fenótipo panresistente. Em 65 (44,2%) dos isolados de P. aeruginosa, foram detectados integrons de classe 1. Esses elementos apresentaram relação estatisticamente significativa com fenótipos MDR em P. aeruginosa. Entretanto, a maioria desses integrons não carreava nenhum cassete gênico (43/65) ou continham apenas cassetes gênicos de resistência a aminoglicosídeos (19/65). Entre os isolados de Acinetobacter spp., 11 (17,5%) apresentaram integrons de classe 1 e 30 (47,6%) integrons de classe 2. Apenas os últimos foram estatisticamente associados com fenótipos MDR. A pesquisa de metalo--lactamase (MBL) revelou a produção de enzimas SPM em 24 isolados de P. aeruginosa. Os estudos de expresão gênica demonstraram que, entre os sistemas de efluxo mais relatados para P. aeruginosa, MexXY-OprM foi o que mostrou maior diferença entre o nível de expressão dos grupos MDR e n-MDR, sugerindo que este sistema de efluxo desempenha importante papel no fenótipo MDR. Diminuição, em média de 66,4%, da produçãode OprD também foi um padrão encontrado nos isolados MDRem relação aos n-MDR. Dois grupos clonais de P. aeruginosa e dois de Acinetobacter spp. foram predominantes e tiveram relação com presença de integrons, produção de SPM-1 e com fenótipo MDR. Portanto, esse fenótipo pode ser consequência de acúmulo de determinantes de resistência em clones específicos. / The non-fermenting pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. are important causes of nosocomial infections. Theses species are often associated with a multidrug resistance (MDR) phenotype, due to intrinsic and acquired resistance genes. Some determinants of resistance, such as integrons, carbapenemases, overexpression of efflux systems and porins loss may be associated with the MDR phenotype. The aim of this study was to evaluate the association of non-MDR and MDR phenotypes in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. to the presence of integrons and carbapenemases encoding genes, the overexpression of mexY, mexB, mexD and adeB genes and loss of the outer membrane protein, OprD. These resistance determinants were evaluated in 147 P. aeruginosa and 57 Acinetobacter spp., isolated from in-patients of University Hospital of UFJF. Isolates with different PFGE and non-susceptibility profiles were grouped according to MDR or non-MDR phenotypes. PCR and real-time RT-PCR were used to investigate the presence of class 1, 2 and 3 integrons and carbapenemase encoding genes and the expression of mexY, mexB, mexD and adeB efflux pumps and OprD porin, respectively. Class 1 integrons were one of the most common genetic elements present in MDR P. aeruginosa (44,2%), but the phenotype could not be attributed to these elements, since they showed empty (43/65) or only aminoglycoside gene cassettes (19/65). Class 2 integrons were the most common genetic elements in MDR Acinetobacter spp., and this association was statistically significant. SPM encoding gene was the only carbapenemase gene found in P. aeruginosa and, predominantly, in the PFGE cluster A. Expression of MexXY-OprM determined by real-time RT-PCR was the highest variable between MDR and non-MDR P. aeruginosa isolates (almost 10-fold). Reduction of 66.4% in OprD expression was observed in MDR P. aeruginosa, in comparison with non-MDR ones. It is concluded that the most important genetic determinants in the MDR phenotype of P. aeruginosa were SPM-1 production, followed by MexXY-OprM over expression and diminished production of OprD, while class 2 integrons was the most important genetic determinant of MDR phenotype in A. baumannii.

P. aeruginosa e espécies de Acinetobacter são causas comuns de diversas infecções em pacientes hospitalizados, principalmente nos internados em centros de tratamento intensivo. Além disso, esses microrganismos se destacam por apresentarem resistência, intrínseca e adquirida, a várias classes de antibióticos, conferindo à bactéria fenótipos de multirresistência e panresistência. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação de integrons (elementos genéticos que carreiam genes de resistência), de genes codificadores de metalo--lactamases, da perda de porinas (canais protéicos da membrana externa), e da atividade de efluxo aumentada, como determinantes do fenótipo de multirresistência e panresistência. Foram estudadas 147 P. aeruginosa e 57 Acinetobacter spp. isolados de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora, no período de 2003 a 2006. O perfil de sensibilidade destes isolados foi determinado por disco de difusão e utilizado para classificá-las como multirresistentes (MDR) e não multirresistentes (n-MDR). A variabilidade clonal dos isolados foi investigada por PFGE. Os isolados pertencentes aos grupos MDR e n-MDR foram investigados quanto a presença de integrons de classe 1, 2 e 3, por PCR e análise de RFLP. Os cassetes gênicos contidos nestes integrons, assim como genes codificadores de carbapenemases (ex. IMP, VIM e SPM), foram detectados por PCR e identificados por seqüenciamento. Avaliação da expressão gênica de bombas de efluxo (mexB, mexY, mexD e adeB) e de porina (OprD) foi conduzida por real-time RT-PCR. Os dados apresentados para os isolados do grupo MDR foram comparados àqueles do grupo n-MDR e a associação entre os determinantes de resistência e o fenótipo MDR foi calculada estatisticamente. Fenótipo de multiresistência foi observado em 42,2% e 84,2% das P. aeruginosa e Acinetobacter spp. estudadas. Nenhum isolado bacteriano apresentou fenótipo panresistente. Em 65 (44,2%) dos isolados de P. aeruginosa, foram detectados integrons de classe 1. Esses elementos apresentaram relação estatisticamente significativa com fenótipos MDR em P. aeruginosa. Entretanto, a maioria desses integrons não carreava nenhum cassete gênico (43/65) ou continham apenas cassetes gênicos de resistência a aminoglicosídeos (19/65). Entre os isolados de Acinetobacter spp., 11 (17,5%) apresentaram integrons de classe 1 e 30 (47,6%) integrons de classe 2. Apenas os últimos foram estatisticamente associados com fenótipos MDR. A pesquisa de metalo--lactamase (MBL) revelou a produção de enzimas SPM em 24 isolados de P. aeruginosa. Os estudos de expresão gênica demonstraram que, entre os sistemas de efluxo mais relatados para P. aeruginosa, MexXY-OprM foi o que mostrou maior diferença entre o nível de expressão dos grupos MDR e n-MDR, sugerindo que este sistema de efluxo desempenha importante papel no fenótipo MDR. Diminuição, em média de 66,4%, da produçãode OprD também foi um padrão encontrado nos isolados MDRem relação aos n-MDR. Dois grupos clonais de P. aeruginosa e dois de Acinetobacter spp. foram predominantes e tiveram relação com presença de integrons, produção de SPM-1 e com fenótipo MDR. Portanto, esse fenótipo pode ser consequência de acúmulo de determinantes de resistência em clones específicos. / The non-fermenting pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp. are important causes of nosocomial infections. Theses species are often associated with a multidrug resistance (MDR) phenotype, due to intrinsic and acquired resistance genes. Some determinants of resistance, such as integrons, carbapenemases, overexpression of efflux systems and porins loss may be associated with the MDR phenotype. The aim of this study was to evaluate the association of non-MDR and MDR phenotypes in P. aeruginosa and Acinetobacter spp. to the presence of integrons and carbapenemases encoding genes, the overexpression of mexY, mexB, mexD and adeB genes and loss of the outer membrane protein, OprD. These resistance determinants were evaluated in 147 P. aeruginosa and 57 Acinetobacter spp., isolated from in-patients of University Hospital of UFJF. Isolates with different PFGE and non-susceptibility profiles were grouped according to MDR or non-MDR phenotypes. PCR and real-time RT-PCR were used to investigate the presence of class 1, 2 and 3 integrons and carbapenemase encoding genes and the expression of mexY, mexB, mexD and adeB efflux pumps and OprD porin, respectively. Class 1 integrons were one of the most common genetic elements present in MDR P. aeruginosa (44,2%), but the phenotype could not be attributed to these elements, since they showed empty (43/65) or only aminoglycoside gene cassettes (19/65). Class 2 integrons were the most common genetic elements in MDR Acinetobacter spp., and this association was statistically significant. SPM encoding gene was the only carbapenemase gene found in P. aeruginosa and, predominantly, in the PFGE cluster A. Expression of MexXY-OprM determined by real-time RT-PCR was the highest variable between MDR and non-MDR P. aeruginosa isolates (almost 10-fold). Reduction of 66.4% in OprD expression was observed in MDR P. aeruginosa, in comparison with non-MDR ones. It is concluded that the most important genetic determinants in the MDR phenotype of P. aeruginosa were SPM-1 production, followed by MexXY-OprM over expression and diminished production of OprD, while class 2 integrons was the most important genetic determinant of MDR phenotype in A. baumannii.

Les infections dues aux bactéries gram-négatif multi résistantes en particulier la résistance aux carbapénèmes, représentent un problème majeur de santé publique. La hausse des taux de résistance à ces antibiotiques a conduit à la réutilisation de la colistine, comme alternative thérapeutique de dernier recours. Notre travail de thèse s'est concentré sur l'étude épidémiologique de la résistance aux antibiotiques d’isolats cliniques au Liban. Nos travaux se sont scindés en 4 chapitres, avec trois objectifs principaux; (i) l'étude des bactéries résistantes aux carbapénèmes, (ii) l'élucidation des mécanismes moléculaires de la résistance à la colistine (iii) l'émergence de bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine. Initialement, une revue de la littérature sur l'épidémiologie et les facteurs de risque associés à l'infection bactérienne au cours de conflits armés et catastrophes naturelles en Asie et au Moyen Orient a été rédigée. Dans le deuxième chapitre nous avons cherché à voir l'effet du changement de traitement de la combinaison colistine-carbapénème à la colistine en monothérapie sur la résistance d’A. baumannii, en plus de la détection du blaVIM-2 codé par plasmide. Dans le troisième chapitre, nous avons détecté la propagation de bactéries gram-négatif résistantes à la colistine en raison de la mutation des (pmrA /pmrB, phoP/phoQ), ou mgrB. Enfin, nous détectons l'émergence du gène vanA d'E. faecium. Il serait nécessaire de mettre en place des enquêtes de surveillance de l’usage des antibiotiques pour éviter la propagation de souches résistantes à ces antibiotiques au Liban. / Infections due to multidrug-resistant gram-negative bacteria especially the resistance to carbapenems, have become a major public health problem. This increase in resistance to antibiotics has led to the resuscitation of colistin, as a last-resort treatment option. Our PhD work focused on the epidemiological study of the antibiotic resistance of clinical isolates in Lebanon. This thesis is divided into 5 chapters with three main objectives; (1) the investigation of carbapenem-resistant bacteria in Lebanese hospitals. (2) the Elucidation of the molecular mechanisms of colistin-resistant bacteria in Lebanese patients, and (3) the emergence of vancomycin-resistant gram-positive bacteria in Lebanon. At the start of this thesis, we have prepared a literature review on the epidemiology and the risk factors associated with bacterial infection in conflict wounded and natural disaster in Asia and the Middle East. The second chapter aimed to see the effect of the shift of treatment from colistin-carbapenem combination to colistin monotherapy on the prevalence and resistance of A. baumannii, in addition to the detection of the plasmid-encoded blaVIM-2 gene. In the third chapter, we have detected the spread of colistin-resistant gram-negative bacteria due to mutation of the two-component systems (pmrA /pmrB, phoP/phoQ), or mgrB. We detect the emergence of vanA of Enterococcus faecium resistant to vancomycin. This observation confirms that colistin resistance in Gram-negative bacteria is indeed increasing. In conclusion, it appears necessary and urgent to set up surveys to monitor the use of antibiotics to prevent the spread of resistant strains in Lebanon.

Introdução: O gênero Acinetobacter representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, principalmente, à pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV). O aumento de isolados de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos (ABRC) representa um problema mundial, pois limita drasticamente as opções terapêuticas. A produção da carbapenamase OXA-23, uma β-lactamase da classe D de Ambler, representa o principal mecanismo responsável por esta resistência em nosso país. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo padronizar a técnica de PCR em tempo real (qPCR) para a detecção do gene blaOXA-23 diretamente de aspirados traqueais (ATs) de pacientes com suspeita de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) de unidades de tratamento intensivo (UTIs). Métodos e resultados: O DNA das amostras de ATs coletadas de pacientes em ventilação mecânica foi analisado pela técnica de qPCR, utilizando o SYBR green, para a detecção do gene blaOXA-23. Dentre os 20 ATs analisados, ABRC foi isolado em 10, A. baumannii sensível aos carbapemêmicos (ABSC) em 3 e 7 foram negativos na culura bacteriológica. O gene blaOXA-23 foi detectado tanto na colônia quanto no AT em 8 das 10 amostras de ABRC. Em uma amostra não houve detecção do gene por qPCR em nenhum dos materiais e em outra amostra houve detecção só no AT. Dos ABSC, em duas amostras não houve detecção do gene na colônia e no AT enquanto que em uma amostra o gene foi detectado somente no AT. Em nenhuma das amostras de ATs negativas na cultura foi detectado o gene. Conclusão: O estudo sugere que a técnica qPCR pode ser aplicada para a detecção do gene blaoxa-23 diretamente de amostras de AT, reduzindo assim, o tempo para o início de uma terpia antimicrobiana adequada e melhorando, consequentemente, o desfecho clínico deste pacientes. / Background: The genus Acinetobacter is an important pathogen associated with nosocomial infections mainly ventilator-associated pneumonia (VAP). The increasing of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii (CRAB) isolates is a worldwide concern since it limits drastically the range of therapeutic alternatives. The OXA-23 producing, a carbapenemhydrolysing class D β-lactamase, is the major mechanism responsible for CRAB in our country. Objective: The study objective is to develop a real time PCR (qPCR) to detect the Acinetobacter baumannii blaOXA-23 gene directly in endotracheal aspirate (ETA) of patients under mechanical ventilation, with suspected ventilator-associated pneumonia (VAP). Methods and Results: DNA extracted from ETA samples from patients under mechanical ventilation was analyzed by qPCR, using SYBR green, for the presence of blaOXA-23 gene. Among the 20 ETAs examined, CRAB isolates were recovered in 10 quantitative cultures; carbapenem-susceptible A. baumannii (CSAB) in 3 and 7 cultures were negative to A. baumanni. Of the 10 CRAB, 8 were positive for blaOXA-23 on both the colony and ETA. In one blaOXA-23 qPCR was negative in colony and directly from ETA, while the other showed a qPCR negative result in the colony and positive in the ETA. In 3 CSAB, 2 samples showed negative results in colony and ETA and one showed a blaOXA-23 positive result only from the ETA. None of the 7 negative ETAs were positive for blaOXA-23 gene in the qPCR of the ETA. Conclusion: Our study suggests that qPCR can be applied to detect the presence of blaOXA-23 gene directly from ETAs reducing the time to an earlier initiation of appropriate therapy improving, consequently, the clinical outcomes for these patients.

Introdução: O gênero Acinetobacter representa um importante patógeno relacionado a infecções hospitalares, principalmente, à pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV). O aumento de isolados de Acinetobacter baumannii resistentes aos carbapenêmicos (ABRC) representa um problema mundial, pois limita drasticamente as opções terapêuticas. A produção da carbapenamase OXA-23, uma β-lactamase da classe D de Ambler, representa o principal mecanismo responsável por esta resistência em nosso país. Objetivo: O presente estudo tem como objetivo padronizar a técnica de PCR em tempo real (qPCR) para a detecção do gene blaOXA-23 diretamente de aspirados traqueais (ATs) de pacientes com suspeita de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) de unidades de tratamento intensivo (UTIs). Métodos e resultados: O DNA das amostras de ATs coletadas de pacientes em ventilação mecânica foi analisado pela técnica de qPCR, utilizando o SYBR green, para a detecção do gene blaOXA-23. Dentre os 20 ATs analisados, ABRC foi isolado em 10, A. baumannii sensível aos carbapemêmicos (ABSC) em 3 e 7 foram negativos na culura bacteriológica. O gene blaOXA-23 foi detectado tanto na colônia quanto no AT em 8 das 10 amostras de ABRC. Em uma amostra não houve detecção do gene por qPCR em nenhum dos materiais e em outra amostra houve detecção só no AT. Dos ABSC, em duas amostras não houve detecção do gene na colônia e no AT enquanto que em uma amostra o gene foi detectado somente no AT. Em nenhuma das amostras de ATs negativas na cultura foi detectado o gene. Conclusão: O estudo sugere que a técnica qPCR pode ser aplicada para a detecção do gene blaoxa-23 diretamente de amostras de AT, reduzindo assim, o tempo para o início de uma terpia antimicrobiana adequada e melhorando, consequentemente, o desfecho clínico deste pacientes. / Background: The genus Acinetobacter is an important pathogen associated with nosocomial infections mainly ventilator-associated pneumonia (VAP). The increasing of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii (CRAB) isolates is a worldwide concern since it limits drastically the range of therapeutic alternatives. The OXA-23 producing, a carbapenemhydrolysing class D β-lactamase, is the major mechanism responsible for CRAB in our country. Objective: The study objective is to develop a real time PCR (qPCR) to detect the Acinetobacter baumannii blaOXA-23 gene directly in endotracheal aspirate (ETA) of patients under mechanical ventilation, with suspected ventilator-associated pneumonia (VAP). Methods and Results: DNA extracted from ETA samples from patients under mechanical ventilation was analyzed by qPCR, using SYBR green, for the presence of blaOXA-23 gene. Among the 20 ETAs examined, CRAB isolates were recovered in 10 quantitative cultures; carbapenem-susceptible A. baumannii (CSAB) in 3 and 7 cultures were negative to A. baumanni. Of the 10 CRAB, 8 were positive for blaOXA-23 on both the colony and ETA. In one blaOXA-23 qPCR was negative in colony and directly from ETA, while the other showed a qPCR negative result in the colony and positive in the ETA. In 3 CSAB, 2 samples showed negative results in colony and ETA and one showed a blaOXA-23 positive result only from the ETA. None of the 7 negative ETAs were positive for blaOXA-23 gene in the qPCR of the ETA. Conclusion: Our study suggests that qPCR can be applied to detect the presence of blaOXA-23 gene directly from ETAs reducing the time to an earlier initiation of appropriate therapy improving, consequently, the clinical outcomes for these patients.