Orientador: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: A resistência microbiana causa grande número de mortes todos os anos. Sua emergência e disseminação são fenômenos complexos, que devem ser compreendidos no contexto de redes de assistência. Entre os microrganismos multidroga-resistentes (MDR), causam especial preocupação os bacilos Gram-negativos, especialmente Acinetobacter baumannii e Enterobactérias (Escherichia coli, Klebsiella spp e Enterobacter spp) resistentes aos carbapenêmicos (CRAB e CRE, respectivamente). Nós realizamos dois estudos com o objetivo de descrever o comportamento espaço-temporal de CRAB e CRE. O primeiro deles teve delineamento ecológico e se baseou em notificações de agentes de infecção da corrente sanguínea em Unidades de Terapia Intensiva do Estado de São Paulo. O segundo foi uma revisão sistemática de literatura científica e “literatura cinzenta” para identificar relatos de ocorrência de infecções por CRAB e CRE no Brasil. Nossos resultados no Estado de São Paulo demonstraram tendências temporais opostas para CRAB (redução) e CRE (crescimento). Em ambos os casos a incidência é maior nas Regiões Metropolitanas de São Paulo e Campinas, a partir de onde os microrganismos parecem espalhar-se para outras áreas. Infecções foram mais frequentes em hospitais públicos e naqueles com menor proporção de leitos de UTI. Fatores socio-econômicos e demográficos apresentaram associações variáveis, porém plausíveis, com a incidência dos microrganismos de interesse. Os resultados da revisão sistemática apontam para ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Antimicrobial resistance causes great numbers of deaths every year. Its emergence and dissemination are complex phenomena, which must be understood in the context of healthcare networks. Among multidrug-resistant microorganisms (MDR), carbapenem-resistant Gram-negative bacilli, especially Acinetobacter baumannii (CRAB) and Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp and Enterobacter spp; CRE) are of special concern. We performed two studies with the objective of describing the space-time behavior of CRAB and CRE. The first study had an ecological design and was based on reports of microorganisms causing bloodstream infections in Intensive Care Units in the São Paulo State, Brazil. The second was a systematic review of scientific literature and "gray literature" to identify reports of CRAB and CRE infections in Brazil. Our results in the State of São Paulo showed opposite temporal trends for CRAB (reduction) and CRE (growth). In both cases the incidence is higher in the Metropolitan Regions of São Paulo and Campinas, from where the microorganisms seem to spread to other areas. Infections were more frequent in public hospitals and in those with a lower proportion of ICU beds. Socio-economic and demographic factors presented variable but plausible associations with the incidence of microorganisms of interest. Results of the systematic review point to an initial concentration of CRAB and CRE reports in the Brazilian Southeast, followed by a dispersion in the country. The... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.

Introduction: The carbapenem resistance among bacteria of the family Enterobacteriaceae, particularly Klebsiella pneumoniae, is becoming a serious problem in hospitals through different mechanisms that may act alone or combined, such as changes in outer membrane permeability with the porin loss associated with the overproduction of β-lactamases ESBL and AmpC or the specific production of KPC. These infections by Klebsiella pneumoniae resistant to carbapenems (CRKP) are associated with high morbidity, mortality, and costs. Objectives: In our study, we describe the epidemiology and clinical outcomes associated with CRKP infections as well as the risk factors associated with 30 days hospital mortality among these patients and characterize resistance mechanisms: AmpC, ESBL, MBL and KPC. Methods: Case study (patients with infections CRKP) vs. control (uninfected by KPRC) at a ratio of 1:2, detected by laboratory surveillance and collecting demographics dates, co-morbidities, use of invasive procedures and antimicrobial use and patient outcome by checking medical records, between November / 2007 to May/2011. Characterization of phenotypic AmpC, KPC and ESBL performed with the test boronic acid as neutralizing enzyme test and synergism with imipenem-EDTA for MBL. The presence of genotype blaKPC was performed by PCR. Results: In total, 63 patients were included, with 22 patients infected by CRKP in different anatomical sites, predominantly bloodstream infections (40%). Resistance to ertapenem, meropenem and imipenem was 100%, 68.2% and 45.4%, respectively. Statistical analysis by logistic regression of risk factors for infection by CRKP showed the following as independent variables: malignancy (P = 0.025, OR = 63.74, 95% CI 1.69 to 2409.05), Charlson co-morbidity index ≥ 3 (P = 0.033, OR = 7.90, 95% CI, 1.18 to 52.80) and use of fluoroquinolones (P = 0.005, OR = 18.92, 95% CI, 2.42 - 147.81). The ESBL phenotype was most frequent (90.9%), followed by AmpC (63.6%) and blaKPC (14%), and usually combined. The presence of co morbidities ≥ 3 (P = 0.027, OR = 7.65 95% CI, 1.26 to 46.53) and KPRC infection (P = 0.026, OR = 4.91 95% CI, 1, 21 to 20.05) were associated with 30-day hospital mortality, and there was significant mortality in infected patients 54.5% (P = 0.026, OR = 3.72, 95% CI, 1.24 to 11.19) with an attributed mortality rate of 25.2%. Conclusion: The mortality rate associated with CRKP infection and the limited antimicrobial options for treatment highlight the need for improved laboratory detection, mainly KPC producing isolates, points out that it s crucial to implement efficient infection control measures to limit the spread of these pathogens in hospitals from countries with limited resources as Brazil. / Introdução: A resistência aos carbapenêmicos entre as amostras de Enterobacteriaceae, especialmente Klebsiella pneumoniae, está se tornando um grave problema nos hospitais e pode resultar da aquisição de diferentes mecanismos que atuam isolados ou combinados, destacando-se diminuição na permeabilidade da membrana externa pela perda de porina associada com hiperprodução de β-lactamases ESBL, AmpC ou produção específica de carbapenemases. As infecções por Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos (KPRC) estão associadas com altas taxas de morbidade, mortalidade e custos. Objetivos: No nosso estudo, descrevemos a epidemiologia e a evolução clínica associadas com a infecção por KPRC, bem como os fatores de risco associados com a mortalidade hospitalar no prazo de 30 dias entre estes pacientes e caracterizamos os mecanismos de resistência: AmpC, ESBL, MBL e KPC. Métodos: Estudo modelo caso (pacientes com infecções por KPRC) vs. controle (pacientes não infectados por KPRC) na proporção de 1:2, detectados por vigilância laboratorial e coleta de dados demográficos, das co-morbidades, dos procedimentos invasivos e uso de antimicrobianos, bem como evolução nos respectivos prontuários, realizado entre novembro/2007 e maio/2011. A caracterização fenotípica de AmpC, ESBL e KPC foi realizada pelo teste do ácido borônico como neutralizante de enzima e o de sinergismo com imipenem-EDTA para MBL. A pesquisa de presença de genótipo blaKPC foi realizada pela reação de PCR. Resultados: No total, foram incluídos 63 pacientes, com 22 pacientes infectados por KPRC em diferentes sítios anatômicos, com predomínio de corrente sangüínea (40%). A resistência ao ertapenem, meropenem e imipenem foi de 100%, 68,2% e 45,4%, respectivamente. A análise estatística dos fatores de risco para infecção por KPRC por regressão logística mostrou as seguintes variáveis como independentes: neoplasia (P=0,025; OR=63,74, 95% IC, 1,69-2409,05), índice de co-morbidade Charlson ≥ 3 (P=0,033; OR=7,90, 95% IC, 1,18-52,80) e uso da fluorquinolona (P=0,005; OR=18,92, 95% IC, 2,42-147,81). O fenótipo de resistência mais freqüente foi o ESBL (90,9%), seguido de AmpC (63,6%) e blaKPC (14%), usualmente combinados. A presença de ≥ 3 co-morbidades (P=0,027; OR=7,65 95% IC, 1,26-46,53) e infecção por KPRC (P=0,026; OR=4,91 95% IC, 1,21-20,05) foram associadas à mortalidade total hospitalar no prazo de trinta dias, esta foi significativa nos pacientes infectados 54,5% (P=0,026; OR=3,72, 95% IC, 1,24-11,19) e com freqüência de mortalidade atribuída de 25,2%. Conclusão: A taxa de mortalidade associada com infecção por KPRC e a limitação das opções terapêuticas enfatizam a necessidade da melhoria na detecção laboratorial, principalmente dos produtores de KPC, assim como implementar medidas de controle de infecção eficientes para limitar a disseminação desses patógenos em hospitais de países com recursos limitados como o Brasil. / Mestre em Ciências da Saúde

Introdução: Após o surgimento e disseminação das β-lactamases (BL) de amplo espectro em membros da família Enterobacteriaceae, os antibióticos carbapenêmicos (imipenem, meropenem, ertapenem) têm sido considerados a terapia de escolha pela estabilidade apresentada contra estas enzimas. Infelizmente, em 2005, o primeiro caso de infecção fatal por um isolado de Klebsiella pneumoniae resistente aos carbapenêmicos foi relatado em nosso país. A partir deste, novos casos de infecção, inclusive por outros gêneros da família Enterobacteriaceae como Enterobacter, Providencia e Escherichia, começaram a surgir. Como mecanismo de resistência aos carbapenêmicos, a expressão de enzimas carbapenemases tem sido mundialmente relatada, enquanto que, a impermeabilidade associada à produção de enzimas do tipo AmpC ou ESBL tem sido esporádica. Com relação à mobilização dos determinantes genéticos de resistência, elementos móveis como integrons e plasmídios têm sido associados. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar os mecanismos de resistência aos carbapenêmicos, sua mobilização genética e disseminação clonal em amostras clínicas de enterobactérias isoladas em diversos hospitais brasileiros. Material e métodos: Foram estudadas 28 cepas recuperadas de oito centros hospitalares descritas como resistentes ao imipenem. A caracterização fenotípica foi realizada por: i) determinação da CIM na presença e ausência de inibidores de BL, ii) bioensaio para produção de BL e iii) SDS-PAGE para investigar a ausência de porinas. A confirmação genotípica da resistência mediada por β-lactamases foi realizada por PCR e seqüenciamento e a sua localização plasmidial foi estudada por transformação. Por último, a tipagem molecular foi realizada pela técnica de ERIC-PCR, sendo confirmada pela técnica de PFGE. Resultados: 25 cepas apresentaram resistência para carbapenêmicos (imipenem MIC 8-128 µg/mL), todas com perfil de multiresistência incluindo cefoxitina (CIM90 ≥32 µg/mL). Foram identificados três determinantes de resistência, entre eles, a produção de carbapenemases de tipo MBL (IMP-1) e a enzima KPC-2, recentemente descrita, sendo emergente no país. O mecanismo mais prevalente nas amostras estudadas foi a impermeabilidade de membrana associada à expressão de enzimas do tipo AmpC (CMY-2 plasmidial para E. coli e AmpC cromossômica no caso de Enterobacter aerogenes), as quais mostraram uma contribuição significativa para a resistência aos carbapenêmicos. Dos 28 isolados, 18 apresentaram a perda da porina de 36 kDa, responsável pela entrada de antimicrobianos na bactéria, como os carbapenêmicos. Tanto os genes blaKPC-2 e blaCMY-2 foram transferidos com êxito para E. coli DH10B, confirmando sua localização plasmidial. A co-produção de carbapenemase ou enzimas do tipo AmpC com ESBL do tipo CTX-M foi confirmada em 68% dos isolados. A tipagem molecular mostrou uma disseminação clonal para os isolados carregando determinantes IMP-1 e as enzimas do tipo AmpC cromossômica e plasmidial. Ao contrário, isolados expressando KPC não foram clonalmente relacionadas. Conclusão: A caracterização de resistência apresentada neste trabalho demonstrou uma mudança no perfil de resistência da família Enterobactériaceae devido à sua versatilidade para a aquisição de novos mecanismos de resistência, como sua adaptação aos ambientes hostis. A perda da porina foi o mecanismo mais freqüente nesta família e a co-produção de BL foi um evento associado. Finalmente, os dados obtidos na tipagem molecular denotaram uma disseminação majoritariamente clonal na cidade de São Paulo, com exceção das cepas produtoras de KPC-2, cuja presença tem sido relatada em outras cidades do país, sugerindo a participação de uma transferência horizontal. / Introduction: After emergence, and dissemination of extended spectrum β-lactamases (ESBL) in members of the Enterobacteriaceae family, carbapenem antibiotics (imipenem, meropenem, ertapenem) have been the therapy of choice, since they are stable to ESBL hydrolysis. Unfortunately, in 2005, the first fatal case of infection by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae was related in our country. From this episode, new infection cases, including by other genders of Enterobacteriaceae such as Enterobacter, Providencia and Escherichia, began to appear. Regarding carbapenem resistance mechanisms, expression of carbapenem hydrolyzing enzymes has been worldwide reported, whereas interplay between impermeability and AmpC or ESBL production has been sporadic. Furthermore, integrons and plasmids have been associated with mobilization of genetic determinants. The aim of this study was to characterize the mechanisms of resistance to carbapenems, their genetic mobilization and clonal dissemination in enterobacterial isolates recovered from clinical samples in Brazilian hospitals. Material and methods: 28 imipenem-resistant isolates recovered from 8 hospital centres were studied. Phenotypic profiles were characterized by: i) MIC of carbapenems in the presence/absence of β-lactamase inhibitors; ii) bioassay for β-lactamase production; iii) SDS-PAGE to investigate absence of outer membrane porins (OMPs). Molecular characterization of β-lactamase-mediated resistance was made by PCR and DNA sequencing and their plasmid localization was evaluated by transformation. Finally, epidemiological typing was performed by ERIC-PCR, being confirmed by PFGE. Results: 25 isolates were confirmed as being resistant to imipenem (MIC 8-128 µg/mL), exhibiting a multidrug-resistant profile, including to cefoxitin (MIC90 ≥32 µg/mL). Two main mechanism of resistance were identified: i) hydrolysis of carbapenem by class B (IMP-1-like MBL) and class A (KPC-2) enzymes, (the latter being recently reported in our country), and ii) outer membrane impermeability associated to AmpC enzyme production (plasmid-mediated CMY-2 for E. coli and chromosomal AmpC for E. aerogenes), which was the most prevalent mechanism found. Eighteen of 28 isolates lacked 36kDa OMP, which is responsible for uptake of carbapenem antibiotics. The blaKPC-2 and blaCMY-2 genes were successful transferred to E. coli DH10B, confirming the plasmid location of both genes. Co-production of carbapenemases or AmpC and CTXM enzymes was confirmed in 68% of isolates, and molecular typing showed clonal dissemination of IMP-1-, plasmid AmpC- and chromosomal AmpC-producing isolates. Otherwise, KPC-2-producing isolates were not clonally related. Conclusion: The characterization of resistance mechanisms to carbapenems, in this study, reveals a change in the resistance patterns among Enterobacteriaceae family members in Brazilian hospitals, due to versatility of isolates to acquire new resistance determinants, which it has favoured the adaptation to hostile environments. Lack of 36 kDa OMP was the most frequent resistance mechanism, being associated to co-production of β-lactamases. Finally, molecular typing denote a clonal dissemination of imipenem-resistant isolates in Sao Paulo city, with exception of KPC-2-producing isolates, which have been described in other Brazilian cities, suggesting a horizontal gene transfer.