There is scarce information on the fate of cardiac progenitor cells (CPC) in the embryonic heart after chamber specification. Furthermore, the role of acetylcholinesterase (AChE) during heart development is unknown, despite record of its presence in the myocardium. Although three molecular variants of AChE (R, H and T) exist due to alternate splicing, temporal and spatial distribution of these splice variants during cardiac ontogeny is not well characterized. We hypothesized that the AChE “R” splice variant (AChE-R) is involved in directing lineage commitment of mouse ventricular CPCs to the conduction cell phenotype. It is possible that AChE may promote the breakdown of ACh and block the effects of ligand-binding via M2 receptors present on the surface of CPCs. Our study has also provided a platform to suggest that AChE may play a role in the molecular mechanisms underlying functional diversification of myocardial cells into conduction system cells during ontogenesis.

Le cil primaire est un organite présent à la surface de la plupart des cellules de Vertébrés. Il participe à l’organogénèse en régulant l’activité de voies de signalisation comme la voie Hedgehog. Une dysfonction du cil primaire mène à des maladies rares, sévères et pléiotropiques, les ciliopathies, qui peuvent inclure des défauts cardiaques. Cependant, le rôle que le cil primaire joue dans la morphogénèse cardiaque est encore mal compris. Le projet principal de la thèse porte sur l’étude du rôle du cil primaire des cellules cardiaques dans le développement du cœur. Dans ce but, nous avons utilisé un modèle murin de délétion conditionnelle de Ift20, un gène essentiel pour la ciliogénèse. La délétion est contrôlée par l’allèle Mesp1Cre exprimé dans la plupart des précurseurs précoces cardiaques. A la naissance, les mutants conditionnels présentent des défauts importants de septation des voies efférentes et des chambres cardiaques, les oreillettes et les ventricules. Ces défauts sont similaires à ceux caractérisés dans les mutants de la voie Hedgehog. Nous avons également identifié de nouveaux phénotypes associés à la suppression du cil. Les mutants présentent une augmentation significative de la taille du ventricule droit et des malformations du réseau de vascularisation coronaire. Pour mieux comprendre la cause des défauts de croissance observés à la naissance, nous avons analysé les comportements cellulaires sous-jacents. Aucune différence significative des taux de prolifération, de la taille et de la proportion des types cellulaires n’a été détectée au stade prénatal, suggérant que ces défauts ont une origine développementale plus précoce. Des expériences sont en cours pour déterminer les mécanismes moléculaires des défauts observés. Dans le cadre d’une collaboration avec le laboratoire de Julien Vermot, à Strasbourg, nous avons étudié le rôle du cil primaire dans le développement du proépicarde, un organe précurseur de l’épicarde du cœur mature. Nous avons montré que les embryons mutants Ift20 constitutifs présentent une augmentation significative du volume du proépicarde. Des analyses sont en cours pour identifier les voies de signalisation impliquées dans ce phénotype. Les travaux effectués durant ce projet de thèse ont permis de caractériser de nouveaux rôles du cil primaire dans le développement cardiaque. Nos résultats participent à une meilleure compréhension des ciliopathies et des défauts cardiaques qui leur sont associés. / The primary cilium is an organelle present at the surface of most of Vertebrate cells. It is involved in organogenesis by regulating signalling pathways such as Hedgehog signalling. Primary cilium dysfunction leads to severe, rare and pleiotropic diseases, ciliopathies, which can include cardiac defects. Howevr, the role that the primary cilia plays in cardiac morphogenesis is still poorly understood. The main project of the PhD focuses on the study of the role of primary cilia in cardiac cells during heart development. We have used a mouse mode of conditional deletion of Ift20, a gene essential for ciliogenesis. The deletion is controlled by the Mesp1Cre allele, expressed in the majority of cardiac precursors. At birth, conditional mutants display severe defects in septation of the outflow tract, the atria and the ventricles. These defects are similar to the ones characterized in Hedgehog signalling mutants. We also have identified novel phenotypes linked to cilium suppression. The mutants display a significant increase in the size of the right ventricle and defective coronary vasculature development. To better understand the growh defects observed at birth, we analysed the underlying cell behaviour. No significant differences in the proliferation rates, nor in the size and proportions of different cell types were detected at prenatal stages, suggesting that these defects have an earlier developmental origin. Experiments are underway to determine the molecular mechanisms of the observed defects. In collaboration with the laboratory of Julien Vermot, in Strasbourg, we studied the role of the primary cilium in the development of the proepicardium, a precursor organ of the mature epicardium. We have shown that Ift20 constitutive mutants show a significant increase in proepicardial volume. Analyses are ongoing to identify the signalling pathways involved in this phenotype. The works performed during this PhD project allowed the characterization of new roles for the primary cilium in cardiac development. Our results participate in a better understanding of ciliopathies and their associated cardiac defects.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第22687号 / 医博第4631号 / 新制||医||1045(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 山下 潤, 教授 木村 剛, 教授 浅野 雅秀 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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Congenital heart disease is the most common congenital anomaly, affecting approximately 1% of all live births each year. Although clinical interventions are improving, many affected infants do not survive to adulthood. Congenital cardiac defects originate from disturbances during development, making the study of mammalian cardiogenesis critical to improving outcomes for infants with congenital heart disease. Development of the mammalian heart involves epigenetically-driven specification and commitment of a diverse landscape of cardiac progenitors. Recent studies determined that chromatin modifying enzymes play a previously underappreciated role in the pathogenesis of congenital heart defects. This thesis investigates the functions of Hdac1 and Hdac2, highly homologous Class I histone deacetylases, during early murine cardiac development. We establish that Hdac1 and Hdac2 cooperatively regulate cardiogenesis in distinct cardiac progenitor populations during development. Together, our findings demonstrate that Hdac1 and Hdac2 are critical mediators of the earliest stages of mammalian cardiogenesis through a variety of spatiotemporally specific, redundant, and dose-sensitive roles and indicate they may play important roles in the pathogenesis of human congenital cardiac defects.

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L’architecture des cellules myocardiques en trois dimensions du cœur normal et malformé est un sujet de recherche initié depuis plusieurs siècles, mais il existe encore des questions non résolues. Cette thèse apporte de nouveaux éléments de réponse grâce à l'utilisation d'une technique originale d'Imagerie en Lumière Polarisée et l'étude d'une période précise du développement des tissus cardiaques, celle de l'adaptation postnatale. Dans cette thèse, nous introduisons deux nouvelles représentations de l'information : un paramètre d'Isotropie régional et la dissection virtuelle à la base de représentation en LIC-3D qui permet l'exploration à volonté des masse ventriculaires selon des angles de coupes arbitraires.Le remodelage ventriculaire physiologique postnatal (étudié sur 16 cœurs) s'accompagne globalement d'une diminution de l'isotropie régionale et localement par l'apparition de zones fortement isotropes dont la topologie est identique aux plans de clivage décrits dans le modèle de Torrent - Guasp. Cette étude apporte pour la première fois des éléments complémentaires pour la description des composantes profondes de la voie de sortie du ventricule droit. L'architecture 3D du septum de sortie, du repli ventriculo-infundibulaire et des « fibres » latitudinales de la paroi de deux ventricules est documentée et précisée dans dix cœurs normaux. Dans une étude de 11 cœurs malformés représentant 7 pathologies différentes, 3 patrons topologiques ont été décrits : 1) le patron normal : Alignement du repli ventriculo-infundibulaire et du septum de sortie, dans les malformations de type de communication interventriculaire ou canal atrio-ventriculaire ; 2) le patron parallèle : le repli ventriculo-infundibulaire et septum de sortie sont parallèles dans la Tétralogie de Fallot ; 3) le patron en V : le repli ventriculo-infundibulaire dans les cœurs avec discontinuité musculaire mitro-artérielle.En conclusion, nous apportons des nouveaux éléments de compréhension de la mise en place de l'architecture du myocarde en situation normale et pathologique. Cependant, ces données nouvelles devront être consolidées statistiquement sur un plus grand nombre de cas. Elle devront être confrontées aux données physiologiques observables grâce au méthodes d'imagerie fonctionnelle. / The 3D architecture of the ventricular mass is poorly known, although in vivo imaging techniques show the physiological inhomogeneity of transmural myocardial mechanics. Polarized light imaging makes it possible to quantitatively analyse the myocardial cell orientation to study the regional isotropy of myosin filaments (a new parameter) and to provide virtual dissection (a new tool) of the myocardial ventricular mesh. This deep inside is complementary of superficial anatomical description.Sixteen normal hearts of human term stillbirths, newborns and infants were studied. During the first months of postnatal age, the median regional isotropy values decreased in the ventricular three-dimensional mesh. There was a progressive appearance of a particularly inhomogeneous secondary arrangement of myocardial cells with alternation of thick low-RI and thin high-RI areas. The topology of Torrent-Guasp' cleavage plans and intercalated high RI areas were identical. The outlet septum was constantly identified.Eleven malformed hearts were studied. The deep components of the ventriculo-infundibular fold, the outlet septum and the latitudinal fibres of the ventricular walls were described and 3 different patterns could be portrayed : 1) a normal aligned pattern ; 2) a parallel pattern of the ventriculo-infundibular fold and the outlet septum in Tetralogy of Fallot ; 3) a V pattern of the ventriculo-infundibular fold in heart with mitro-arterial muscular discontinuity.To conclude, we uncover new elements to understand the onset of the myocardial architecture in normal and pathological hearts. However, this new data need to be statistically consolidated by studying a greater numbers of cases. As a perspective, these observations will be confronted to physiological data provided by functional imaging technique.

Les gènes Hox sont essentiels à la mise en place de l’identité des cellules le long de l’axe antéropostérieur des embryons et pourraient agir en aval de l’acide rétinoïque pendant la formation du cœur. Nous montrons que les gènes Hoxb1, Hoxa1 et Hoxa3 définissent des sous-domaines du second champ cardiaque. L’analyse de lignage génétique révèle que les progéniteurs cardiaques Hoxb1+ contribuent aux oreillettes et à la partie inférieure de la voie efférente, futur myocarde sous-pulmonaire. Les progéniteurs Hoxa1+ contribuent à la partie distale de la voie efférente, suggérant un rôle de ces gènes Hox antérieurs dans sa régionalisation proximo-distale. Alors qu’aucune anomalie cardiaque n’avait été décrite chez les mutants Hoxb1, notre étude détaillée des fœtus Hoxb1-/- révèle des défauts d’alignement des gros vaisseaux ainsi que des communications interventriculaires. L’utilisation d’un marqueur du myocarde sous-pulmonaire, montre une contribution anormale des cellules du second champ cardiaque à cette région chez les mutants. Nous montrons que ces défauts sont la conséquence de la dérégulation des voies de signalisation présentes dans le second champ cardiaque. En accord avec ces observations, les embryons ont une voie efférente plus courte. L’étude des mutants Hoxa1 révèle des malformations des arcs pharyngés puis des anomalies de la crosse aortique chez les fœtus. L’analyse des doubles mutants, montre une augmentation de la pénétrance et de la sévérité de ces défauts, suggérant une interaction synergique entre Hoxa1 et Hoxb1 lors de la formation des gros vaisseaux. Ces résultats révèlent un rôle crucial des gènes Hox antérieurs dans le développement du cœur. / Hox genes are known to be involved in the establishment of cell position and identity along the anterior-posterior axis in embryos and could act as key downstream effectors of retinoic acid during heart development. In situ hybridization experiments show that Hoxb1, Hoxa1 and Hoxa3 define sub-domains within the second heart field (SHF). Our genetic lineage analysis reveals the contribution of Hoxb1+ cardiac progenitors to the atria and to the inferior wall of the outflow tract (OFT), which then gives rise to the myocardium at the base of the pulmonary trunk. Interestingly, Hoxa1+ progenitors contribute to the distal part of the OFT suggesting that these anterior Hox genes could play a role in its proximo-distal patterning. No cardiac anomalies had been reported so far in Hoxb1 mutant mice. However, our detailed study shows that mutant fetuses exhibit OFT misalignment and ventricular septal defects associated or not with ventricular wall and epicardium anomalies. Using a marker of the sub-pulmonary myocardium, we observe an abnormal contribution of SHF cells in Hoxb1-/- hearts. This defect is the consequence of the dysregulation of the signaling pathways controlling SHF regulation. Accordingly, those embryos exhibit a shorter OFT. The study of Hoxa1 mutant embryos reveals pharyngeal arch arteries patterning defects causing anomalies of the aortic arch and right subclavian artery at fetal stages. Using compound mutants, we show an increase in the penetrance and severity of these defects, suggesting a synergistic interaction between Hoxa1 and Hoxb1 during aortic arch patterning. Together, these data support a crucial role for anterior Hox genes in cardiac development.

Der Coxsackievirus- und Adenovirusrezeptor (CAR) ist ein Typ I Transmembran-protein, das an der Adsorption von Viren und der Aufrechterhaltung von Zell-Zellkontakten beteiligt ist. Coxsackievirus B3 (CVB3) Infektionen sind eine häufige Ursache für akute Myokarditis, die bei Patienten häufig zu chronischer Kardiomyopathie bis zur Herzinsuffizienz führen können. CAR ist für die Aufnahme von Viren in unterschiedliche Zelltypen verantwortlich und damit ein potentielles Ziel bei der Therapie und Prävention von CVB3-Infektionen. Der komplette Knockout von CAR ist embryonal letal. Die betroffenen Embryonen zeigten Missbildungen des Herzens. Weiterhin konnte eine reduzierte Expression von Connexinen im Knockout beobachtet werden – ein mögliches Zeichen gestörter interzellulärer Kommunikation. In konditionellen CAR Knockout Tieren führte die Infektion mit CVB3 im Gegensatz zu CVB3-infizierten Wildtyp Kontrolltieren zu keinen pathologischen Veränderungen oder eine Erhöhung von Entzündungsmarkern. Die kontraktile Funktion des CVB3-infizierten Knockout Herzen war erhalten. Um mögliche unerwünschte Konsequenzen aus dem Verlust von CAR zu untersuchen, wurde eine umfassende kardiale Phänotypisierung durchgeführt, die AV-block im Knockout-Herzen zeigte. Der zugrunde liegende Mechanismus betrifft die Interaktion von Tight- und Gap-Junctions mit veränderter Expression und Lokalisierung von Connexinen, sowie die interzelluläre Kommunikation zwischen CAR-Knockout Kardiomyzeten. CAR ist essentiell für eine normale Embryonalentwicklung und kardiale Funktion. Das CAR-Knockout-Modell bietet einerseits den ersten genetischen Hinweis für eine Rolle von CAR als Virusrezeptor in vivo und belegt andererseits die Relevanz von direkter Virus-vermittelter Symptomatik gegenüber einer sekundären autoimmun- Komponente in CVB3-induzierten Herzerkrankungen. Damit ist CAR ein potentielles therapeutisches Target in der Prävention und Behandlung von viraler Myokarditis. / The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is a type I transmembrane protein involved in virus uptake and the maintenance of cell-cell contacts. Coxsackievirus B3 (CVB3) infections are frequent causes of human acute myocarditis, often resulting in chronic cardiomyopathy that may progress into terminal heart failure. The coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) is involved in virus uptake into various cell types and has therefore been suggested as a therapeutic target to prevent or treat CVB3 induced diseases. The complete CAR-knockout was embryonic lethal at midgestation with cardiac malformation. Connexin expression was decreased in the knockout, suggesting an abnormal cell-cell communication secondary to the loss of CAR. The role of CAR in murine viral myocarditis was investigated using the inducible CAR-knockout infected with CVB3. Unlike control animals exposed to CVB3, the cardiac inducible knockout mice did not exhibit structural changes such following CVB3 infection, or increased production of markers of inflammation, and severe contractile dysfunction. To evaluate possible adverse effects that might result from CAR deficiency, we implemented a detailed cardiac phenotyping protocol and found that CAR deficient animals developed AV nodal block. The underlying mechanism relates to the crosstalk of tight and gap junctions with altered expression and localization of connexins that affect the communication between CAR knockout cardiomyocytes. Thus, CAR is essential for embryonic development and normal cardiac function. The CAR-knockout does not only provide the first genetic evidence to establish CAR as the CVB3 receptor in vivo, but furthermore demonstrates the relevance of direct virus-mediated pathology versus a secondary autoimmune component in CVB3 induced heart disease. Our data suggest that CAR is a suitable target to help prevent and treat viral myocarditis.