Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-03-13T14:27:14Z No. of bitstreams: 2 TESE TAMARA DE CARLI - versao final biblioteca.pdf: 15216831 bytes, checksum: 267a961053b23cb6f6a0158a30d06f96 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T14:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE TAMARA DE CARLI - versao final biblioteca.pdf: 15216831 bytes, checksum: 267a961053b23cb6f6a0158a30d06f96 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / FACEPE, CNPq e CPqAM/FIOCRUZ / Em eucariotos, a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP) se liga especificamente a seqüência de poli-adenosinas na extremidade 3’ dos mRNAs, atuando em múltiplas funções associadas ao metabolismo destes, incluindo biogênese, processamento, transporte núcleo-citoplasmático e degradação. A PABP também participa na síntese proteíca, via interações diretas com fatores de tradução, como o fator de iniciação eIF4G, parceiro da proteína de ligação ao cap eIF4E. O objetivo desta Tese foi dar continuidade a caracterização de três homólogos da PABP identificados em Leishmania sp. (PABPs1, 2 e 3), protozoários patogênicos de características biológicas diferenciadas. Em estudos prévios estas proteínas se mostraram abundantes e de expressão simultânea e a PABP1 se mostrou representada por isoformas associadas a sua fosforilação. Neste trabalho, foi observado que as três proteínas possuem localização citoplasmática, porém sob condições de inibição da transcrição, mas não de tradução ou processamento de mRNAs, as PABPs 2 e 3 migram para o núcleo. Esse comportamento está de acordo com ensaios de interação proteína-proteina, onde foi observada uma associação direta entre as PABPs 2 e 3, independente de RNA. A expressão de isoformas fosforiladas da PABP1 foi então analisada e observou-se que esta era afetada pela inibição dos processos de síntese de mRNAs. Investigando sua participação no processo de tradução, foram confirmadas interações específicas entre a PABP1 e um homólogo de eIF4G in vivo e interações inéditas entre esta e homólogos de eIF4E. As três proteínas se mostraram capazes de se associar com os polissomas de células em fase de crescimento exponencial, mas não de fase estacionária. Ao longo do trabalho foram mapeados motivos envolvidos com as interações observadas identificando características novas não descritas. Por fim, ensaios de co-imunoprecipitação seguido de análise protéica por espectrometria de massa e de RNAs por RT-PCR confirmaram a presença de parceiros protéicos diferenciados para cada homólogo e mRNAs alvo para as PABPs 2 e 3 cuja tradução está associada a fase S do ciclo celular. Nossos resultados mostram que estas proteínas apresentam funções divergentes e reforça um papel mais geral da PABP1 na tradução.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:54:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-TamaraLima.pdf: 15100477 bytes, checksum: 79a87ae32652a2bd9c0dae960dc0a539 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:54:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-TamaraLima.pdf: 15100477 bytes, checksum: 79a87ae32652a2bd9c0dae960dc0a539 (MD5) Previous issue date: 2012-09-21 / Em eucariotos,a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP) se liga especificamente a seqüência de poli-adenosinas na extremidade 3’ dos mRNAs, atuando em múltiplas funções associadas ao metabolismo destes, incluindo biogênese, processamento, transporte núcleo-citoplasmático e degradação. A PABP também participa na síntese proteíca, via interações diretas com fatores de tradução, como o fator de iniciação eIF4G, parceiro da proteína de ligação ao capeIF4E. O objetivo desta Tese foi dar continuidade a caracterização de três homólogos da PABP identificados em Leishmania sp.(PABPs1,2 e 3), protozoários patogênicos de características biológicas diferenciadas. Em estudos prévios estas proteínas se mostraram abundantes e de expressão simultânea e a PABP1 se mostrou representada por isoformas associadas a sua fosforilação. Neste trabalho, foi observado que as três proteínas possuem localização citoplasmática, porém sob condições de inibição da transcrição, mas não de tradução ou processamento de mRNAs, as PABPs 2 e 3 migram para o núcleo. Esse comportamento está de acordo com ensaios de interação proteína-proteina, onde foi observada uma associação direta entre as PABPs 2 e 3, independente de RNA. A expressão de isoformas fosforiladas da PABP1 foi então analisada e observou-se que esta era afetada pela inibição dos processos de síntese de mRNAs. Investigando sua participação no processo de tradução, foram confirmadas interações específicas entre a PABP1 e um homólogo de eIF4G in vivo e interações inéditas entre esta e homólogos de eIF4E. As três proteínas se mostraram capazes de se associar com os polissomas de células em fase de crescimento exponencial, mas não de fase estacionária. Ao longo do trabalho foram mapeadosmotivos envolvidos com as interações observadas identificando características novas não descritas. Por fim, ensaios de co-imuno precipitação seguido de análise protéica por espectrometria de massa e de RNAs por RT-PCR confirmaram a presença de parceiros protéicos diferenciados para cada homólogo e mRNAs alvo para as PABPs 2 e 3 cuja tradução está associada a fase S do ciclo celular. Nossos resultados mostram que estas proteínas apresentam funções divergentes e reforça um papel mais geral da PABP1 na tradução. / In eukaryotes, the poly-A binding protein (PABP) binds specifically to a poly-adenosines sequence present in the 3' end of the mRNAs where performes multiple functions associated with their metabolism, including biogenesis, processing, nucleocytoplasmic transport, and degradation. The PABP also participates in protein synthesis, via direct interactions with translation factors such as the initiation factor eIF4G, partner of the cap binding protein eIF4E. The aim of this Thesis was to continue the characterization of the three PABP homologues identified in Leishmaniasp. (PABPs 1, 2 and 3), a pathogenic protozoan with differentiated biological characteristics. Previous studies have shown that these proteins are abundant and simultaneously expressed and that PABP1 is characterized by multiples isoformes associated to phosphorylation. In this study, it was observed that all three proteins have cytoplasmic localization, but under transcription inhibition conditions but not translation or mRNAs processing, the PABPs 2 and 3 migrate to the nucleus. This behavior is in agreement with a protein-protein interaction observed between PABPs 2 and 3, and this interaction isindependent of RNA. The expression of the phosphorylated isoforms of PABP1 was also analyzed and it was found that some of those isoforms were affected by the inhibition of the processessing of mRNAs sinthesis. When investigated their participation in thetranslation process were observed specific interactions between PABP1 and a homolog of eIF4G in vivoand a novel interaction between PABP 1 and the homologues of eIF4E. Throughout this study the motifs involved in the interactios mentioned above were mapped and new motifs not yet described were observed. All three proteins have been shown to be associated with polysomes in cells in in exponential phase, but not in stationary phase. Finally, co-immunoprecipitation assays followed by protein analysis by mass spectrometry and of RNAs by RT-PCR confirmed the presence of different protein partners and mRNAs targets to the PABPs 2 and 3 whose translation is associated with the S phase of cell cycle. Our results show that these proteins have different functions and reinforces a more general role of PABP1 in translation.

O iodo em excesso promove o efeito Wolff-Chaikoff. Oligominerais já foram descritos como potenciais reguladores da expressão de proteínas. Tornou-se interessante avaliar se o iodo interferiria com a expressão do mRNA da NIS, em curtos períodos de tempo. Foram realizados, em ratos e células (de 30 min24h), estudos de expressão, comprimento de cauda poli-A e recrutamento para polissomos, do mRNA de NIS. Observou-se, in vivo e in vitro, que o excesso de iodo promoveu diminuição da expressão e do comprimento da cauda poli-A do mRNA de NIS, em todos os períodos estudados, além de promover menor recrutamento deste mRNA para os polissomos. A diminuição da cauda poli-A do mRNA de NIS pode ter aumentado sua instabilidade/degradação e também ter sido responsável por uma menor eficiência de tradução deste transcrito. Conclui-se que: (a) o iodo regula pós-transcricionalmente a expressão gênica da NIS, sendo fundamental nos processos que norteiam o efeito Wolff-Chaikoff e (b) oligoelementos têm relevância na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao seu transporte. / Iodide in excess exerts the Wolff-Chaikoff effect. It is described that some minerals can regulate the expression of proteins. This study aimed to investigate if the iodide could modify the expression of NIS mRNA, in short periods of time. Rats and cells, divided in time-groups of 30 min up to 24h, were used in studies of expression, poly-A tale length and polysomal profile of NIS mRNA. Both in vivo and in vitro studies showed that the iodide treatment promoted a reduction in the expression and the poly-A length of NIS mRNA, in all time-groups, and decreased its recruitment to the polysomes. It is possible that the reduction of NIS mRNA poly-A tale length has increased the instability/degradation of this transcript, and impaired the translation efficiency of it. Concluding: a) the iodine exerts a post-transcriptional regulation of NIS mRNA expression, being essencial in the processes that guide the Wollf-Chaikoff effect; b) the oligoelements have an extremely important role in the expression regulation of proteins related to their transport.

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 173.pdf: 1047808 bytes, checksum: 48de5cc0086090a92e066047b4e59660 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Os tripanossomatídeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nível pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteínas, eventos em que atua a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteínas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteínas está presente nos tripanosomatídeos, se caracterizando por possuírem domínios típicos de ligação a RNA, como o domínio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteínas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteínas hipotéticas contendo domínios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteínas UBPs e das proteínas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epítopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteínas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteínas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteínas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus níveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possíveis modificações pós-traducionais

O iodo em excesso promove o efeito Wolff-Chaikoff. Oligominerais já foram descritos como potenciais reguladores da expressão de proteínas. Tornou-se interessante avaliar se o iodo interferiria com a expressão do mRNA da NIS, em curtos períodos de tempo. Foram realizados, em ratos e células (de 30 min24h), estudos de expressão, comprimento de cauda poli-A e recrutamento para polissomos, do mRNA de NIS. Observou-se, in vivo e in vitro, que o excesso de iodo promoveu diminuição da expressão e do comprimento da cauda poli-A do mRNA de NIS, em todos os períodos estudados, além de promover menor recrutamento deste mRNA para os polissomos. A diminuição da cauda poli-A do mRNA de NIS pode ter aumentado sua instabilidade/degradação e também ter sido responsável por uma menor eficiência de tradução deste transcrito. Conclui-se que: (a) o iodo regula pós-transcricionalmente a expressão gênica da NIS, sendo fundamental nos processos que norteiam o efeito Wolff-Chaikoff e (b) oligoelementos têm relevância na regulação da expressão de proteínas relacionadas ao seu transporte. / Iodide in excess exerts the Wolff-Chaikoff effect. It is described that some minerals can regulate the expression of proteins. This study aimed to investigate if the iodide could modify the expression of NIS mRNA, in short periods of time. Rats and cells, divided in time-groups of 30 min up to 24h, were used in studies of expression, poly-A tale length and polysomal profile of NIS mRNA. Both in vivo and in vitro studies showed that the iodide treatment promoted a reduction in the expression and the poly-A length of NIS mRNA, in all time-groups, and decreased its recruitment to the polysomes. It is possible that the reduction of NIS mRNA poly-A tale length has increased the instability/degradation of this transcript, and impaired the translation efficiency of it. Concluding: a) the iodine exerts a post-transcriptional regulation of NIS mRNA expression, being essencial in the processes that guide the Wollf-Chaikoff effect; b) the oligoelements have an extremely important role in the expression regulation of proteins related to their transport.