O carcinoma epidermóide por se tratar de uma doença genética, apresenta dificuldades em relação ao seu tratamento. As vias de sinalização celular por controlarem os mecanismos responsáveis pela proliferação e sobrevivência da célula, são de extrema importância nos estudos da biologia do câncer e oncogênese. Aberrações cromossômicas que afetam a estrutura e a expressão de genes e proteínas que regulam componentes das vias de sinalização são diretamente correlacionadas com o desenvolvimento e progressão tumoral. Vários genes e proteínas vêm sendo avaliados na busca de um alvo terapêutico quimioterápico, algo pouco estudado em carcinomas epidermóides bucais. Este trabalho teve como objetivo analisar a influência do quimioterápico 17-AAG e do fator de crescimento epitelial (EGF) nos níveis das proteínas NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6 e HN31) e no queratinócito imortalizado (HaCat). Este trabalho destinou-se também a estudar uma possível inter-relação entre as proteínas Metalotioneína e NFkB e suas interações com as proteínas Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens celulares HN6 , HN31 e (HaCat, para uma maior compreensão de seus efeitos nas vias de sinalização celular e conseqüente progressão do câncer). Para análise a respeito da localização e os níveis das proteínas MT, NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 foram utilizados ensaios de imunofluorescência e western blot, respectivamente.Os resultados apontaram um melhor perfil apoptótico da linhagem HN31 frente ao tratamento com 17-AAG, apresentando diminuição significante dos níveis de NFkB e Ciclina D1, além de exibir importante decréscimo nos níveis de Cdk4. A proteína MT parece não sofrer ação do NFkB. A indução de proliferação celular realizada por EGF exerceu um aumento dos níveis das proteínas NFkB e Ciclina D1, sugerindo um papel importante das vias de sinalização estimuladas por EGF (Akt, NFkB e Ciclina D1) na progressão tumoral dessas linhagens.Por fim, a ocorrência de estímulo nos níveis da proteína MT por parte do EGF, sugeriram um importante papel do EGF e da MT na resistência a apoptose nas linhagens estudadas. / Squamous cell carcinomas as a genetic diseases, presents certain difficulties in relation to their treatment. The process of cell signaling for overseeing the mechanisms responsible for cellular proliferation and survival are very important in studies of the biology of cancer and development. Chromosomal alterations affecting the structure and expression of genes and proteins that regulate the process of signaling components are directly correlated with the development and tumor progression. Several genes and proteins are being evaluated in the search for a biological marker that could help in the understanding of cancer as well as in its prognosis, and mainly in search of therapeutic target chemotherapy, something little studied in oral squamous cell carcinoma. This study aimed to examine the influence of chemotherapy 17-AAG and the epithelial growth factor (EGF) in the levels of proteins NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 in strains of squamous cell carcinoma of the head and neck (HN6 and HN31) and immortalized in keratinocytes(HaCat). This work is also intended to explore a possible inter-relationship between the Metallothionein and NFkB proteins and their interactions with the proteins Cyclin D1 and Cdk4 in cell lines HN6, HN31 and (HaCat, to a greater understanding of its effects on pathways of cellular signaling and consequent progression of cancer. For analysis regarding the location and levels of the protein MT, NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 were used tests of immunofluorescence and western blot. Results showed a better apoptotic profile of HN31 treated with 17-AAG, showing decrease levels of NFkB and Cyclin D1, with a important decrease in the levels of Cdk4. The metallothionin protein does not appear to suffer action of NFkB. The induction of cell proliferation conducted by EGF had increased levels of NFkB and Cyclin D1 proteins, suggesting an important role in the process of signaling stimulated by EGF (Akt, NFkB and Ciclina D1) in tumor progression of oral squamous cell carcinoma. The occurrence to stimulate the levels of metallothionein protein by the EGF, suggest an important role of EGF and MT in resistance to apoptosis in the studied cell lines.

O carcinoma epidermóide por se tratar de uma doença genética, apresenta dificuldades em relação ao seu tratamento. As vias de sinalização celular por controlarem os mecanismos responsáveis pela proliferação e sobrevivência da célula, são de extrema importância nos estudos da biologia do câncer e oncogênese. Aberrações cromossômicas que afetam a estrutura e a expressão de genes e proteínas que regulam componentes das vias de sinalização são diretamente correlacionadas com o desenvolvimento e progressão tumoral. Vários genes e proteínas vêm sendo avaliados na busca de um alvo terapêutico quimioterápico, algo pouco estudado em carcinomas epidermóides bucais. Este trabalho teve como objetivo analisar a influência do quimioterápico 17-AAG e do fator de crescimento epitelial (EGF) nos níveis das proteínas NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (HN6 e HN31) e no queratinócito imortalizado (HaCat). Este trabalho destinou-se também a estudar uma possível inter-relação entre as proteínas Metalotioneína e NFkB e suas interações com as proteínas Ciclina D1 e Cdk4 nas linhagens celulares HN6 , HN31 e (HaCat, para uma maior compreensão de seus efeitos nas vias de sinalização celular e conseqüente progressão do câncer). Para análise a respeito da localização e os níveis das proteínas MT, NFkB, Ciclina D1 e Cdk4 foram utilizados ensaios de imunofluorescência e western blot, respectivamente.Os resultados apontaram um melhor perfil apoptótico da linhagem HN31 frente ao tratamento com 17-AAG, apresentando diminuição significante dos níveis de NFkB e Ciclina D1, além de exibir importante decréscimo nos níveis de Cdk4. A proteína MT parece não sofrer ação do NFkB. A indução de proliferação celular realizada por EGF exerceu um aumento dos níveis das proteínas NFkB e Ciclina D1, sugerindo um papel importante das vias de sinalização estimuladas por EGF (Akt, NFkB e Ciclina D1) na progressão tumoral dessas linhagens.Por fim, a ocorrência de estímulo nos níveis da proteína MT por parte do EGF, sugeriram um importante papel do EGF e da MT na resistência a apoptose nas linhagens estudadas. / Squamous cell carcinomas as a genetic diseases, presents certain difficulties in relation to their treatment. The process of cell signaling for overseeing the mechanisms responsible for cellular proliferation and survival are very important in studies of the biology of cancer and development. Chromosomal alterations affecting the structure and expression of genes and proteins that regulate the process of signaling components are directly correlated with the development and tumor progression. Several genes and proteins are being evaluated in the search for a biological marker that could help in the understanding of cancer as well as in its prognosis, and mainly in search of therapeutic target chemotherapy, something little studied in oral squamous cell carcinoma. This study aimed to examine the influence of chemotherapy 17-AAG and the epithelial growth factor (EGF) in the levels of proteins NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 in strains of squamous cell carcinoma of the head and neck (HN6 and HN31) and immortalized in keratinocytes(HaCat). This work is also intended to explore a possible inter-relationship between the Metallothionein and NFkB proteins and their interactions with the proteins Cyclin D1 and Cdk4 in cell lines HN6, HN31 and (HaCat, to a greater understanding of its effects on pathways of cellular signaling and consequent progression of cancer. For analysis regarding the location and levels of the protein MT, NFkB, Cyclin D1 and Cdk4 were used tests of immunofluorescence and western blot. Results showed a better apoptotic profile of HN31 treated with 17-AAG, showing decrease levels of NFkB and Cyclin D1, with a important decrease in the levels of Cdk4. The metallothionin protein does not appear to suffer action of NFkB. The induction of cell proliferation conducted by EGF had increased levels of NFkB and Cyclin D1 proteins, suggesting an important role in the process of signaling stimulated by EGF (Akt, NFkB and Ciclina D1) in tumor progression of oral squamous cell carcinoma. The occurrence to stimulate the levels of metallothionein protein by the EGF, suggest an important role of EGF and MT in resistance to apoptosis in the studied cell lines.

Les CDK/cyclines jouent un rôle majeur dans la progression du cycle cellulaire et dans le maintien de la prolifération des cellules cancéreuses, constituant ainsi des biomarqueurs clés et des cibles pharmacologiques attractives. Plus particulièrement, l’activité de CDK4/cycline D, kinase responsable de la progression de la phase G1 et de la transition G1/S, est dérégulée dans de nombreux cancers dont le mélanome. Cette hyperactivation est associée à des mutations, à l’amplification ou à la surexpression de CDK4, cycline D, p16INK4a ou encore pRb.Comme aucune approche sensible et directe n’existe pour évaluer l’activité de CDK4/cycline D dans des conditions physiologiques et pathologiques, le premier objectif de ma thèse a consisté à développer un biosenseur fluorescent permettant d’étudier cette kinase in vitro et in cellulo. Une fois caractérisé et validé in vitro, le biosenseur a été appliqué à la détection d’altérations de CDK4/cycline D dans des biopsies de peau humaine et de xénogreffes de mélanome dans des essais fluorescents d’activité kinase, ainsi que dans des cellules cancéreuses vivantes par microscopie de fluorescence et vidéo microscopie.Par ailleurs, peu d’inhibiteurs sont actuellement disponibles pour inhiber CDK4/cycline D et la plupart d’entre eux ciblent la poche de fixation de l’ATP. C’est pourquoi le second objectif de ma thèse a consisté à identifier des inhibiteurs non compétitifs de l’ATP, soit par élaboration rationnelle de peptides, soit par criblage de petites molécules. A cette fin, deux biosenseurs fluorescents ont été développés qui permettent d’identifier respectivement des composés ciblant l’interface entre CDK4 et cycline D ou des inhibiteurs allostériques capables de perturber la dynamique conformationnelle de CDK4. Des essais de criblage par fluorescence réalisés avec ces biosenseurs ont conduit à l’identification de touches qui ont été validées et caractérisées in vitro et dans des essais de prolifération cellulaire, et qui constituent des candidats prometteurs pour une chimiothérapie sélective du mélanome. / CDK/cyclins play a central role in coordinating cell cycle progression, and in sustaining proliferation of cancer cells, thereby constituting established cancer biomarkers and attractive pharmacological targets. In particular, CDK4/cyclin D, which is responsible for coordinating cell cycle progression through G1 into S phase, is a relevant target in several cancers including melanoma, associated with mutation of CDK4, cyclin D, p16INK4a and pRb.As there are no sensitive and direct approaches to probe CDK4/cyclin D activity in physiological and pathological conditions, the first goal of my thesis has consisted in engineering a fluorescent biosensor to probe this kinase in vitro and in cellulo. Once characterized and validated in vitro, the biosensor was applied to detect CDK4/cyclin D alterations in biopsies from human skin and melanoma xenografts in fluorescence-based activity assays, and in living cancer cells by fluorescence microscopy and timelapse imaging.Moreover, only few inhibitors are currently available to target CDK4/cyclin D and most of them bind the ATP pocket. As such, the second major goal of my thesis project has consisted in identifying non-ATP competitive inhibitors, either through rational design of peptides or by screening small molecule libraries. To this aim, two fluorescent biosensors were engineered which discriminate compounds that target the interface between CDK4 and cyclin D, or that perturb the conformational dynamics of CDK4, respectively, from ATP-pocket binding compounds. Fluorescence-based screening assays performed with these biosensors lead to identification of hits, which were validated and characterized in vitro and in cell proliferation assays, and which constitute promising candidates for selective chemotherapy in melanoma.

Adulte Neurogenese in Säugetieren ist eingeschränkt auf zwei Gehirnbereiche, der subgranulären Zone (SGZ) des Hippocampus und der subventrikulären Zone (SVZ) um die Ventrikelwände herum. Vorhergehende Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass Überexpression der Zellzyklusregulatoren Cdk4/Ccnd1 (4D) in neuralen Stammzellen (NSZ) der SGZ oder SVZ ihre G1 Phase verkürzt und dadurch zu einer erhöhten Proliferationsrate führt. Dies hatte eine höhere Anzahl an neugeborenen Neuronen zur Folge, welche die Performance von Mäusen in Hippocampus-abhängigen Gedächtnis- bzw. in Geruchunterscheidungstests verbessert hat. Allerdings wurde die 4D Überexpression bislang durch das Benutzen von entweder integrierenden Lentiviren (SGZ) oder transgenen Mäusen (SVZ) durchgeführt, was diese Vorgehensweise einschränkt hinsichtlich potenzieller klinischer Anwendungen wie Schlaganfall oder neurodegenerativen Erkrankungen. In meiner Thesis habe ich ein 4D Überexpressionssystem entwickelt, was klinisch anwendbar ist und dies in einem Mausmodell von Schlaganfall getestet. Zu diesem Zweck wurde zum ersten Mal ein rekombinanter Adeno-assoziierter Virus (rAAV) Serotyp identifiziert, der die Transduktion von sowohl SGZ als auch SVZ NSZs ermöglichte. In der SVZ resultierte die 4D Überexpression in einer erhöhten NSZ Proliferation und Neurogenese, was einen grundlegenden Beweis für das rAAV-4D System lieferte. Zusätzlich wurden ein photothrombotisches und ein Endothelin-1 (ET-1) Striatum Schlaganfallmodell sowohl für histologische als auch Verhaltensuntersuchungen etabliert. Im ET-1 Modell wurde Migration von Neuroblasten zum Bereich der Schädigung hin beobachtet, die von der SVZ stammten. Histologische Analysen der rAAV-4D Überexpression nach ET-1 Schlaganfall wiesen eine erhöhte Anzahl an migrierenden Neuroblasten und Überleben der Neuronen auf. Zusammen mit zukünftigen zellulären Charakterisierungen und Verhaltenstests liefert diese Arbeit die Basis für potenzielle 4D Anwendungen nicht nur für Schlaganfall, sondern auch für andere neurodegenerative Erkrankungen. Perspektivisch könnte die Identifizierung von rAAV Serotypen, die andere Stamm- oder Vorläuferzellen transduzieren, weiter die Toolbox von rAAV-4D Behandlungsmöglichkeiten für klinische Anwendungen anderer Bereiche der regenerativen Medizin erweitern. / Adult neurogenesis in mammals is restricted to two areas of the brain, the hippocampal subgranular zone (SGZ) and the subventricular zone (SVZ) lining the ventricle walls. Previous work in our lab has shown that overexpression of the cell cycle regulators Cdk4/Ccnd1 (4D) in SGZ or SVZ neural stem cells (NSCs) shortens their G1 thereby resulting in an increased rate of proliferation. This led to a higher number of newborn neurons improving the performances of mice in hippocampus dependent memory or odour discrimination tasks, respectively. However, the 4D overexpression was so far achieved using integrating lentiviruses (SGZ) or transgenic mice (SVZ) limiting this approach from potential clinical applications such as stroke and other neurodegenerative diseases. In my thesis, I set out to develop a 4D overexpression system that is clinically applicable and to test this in a mouse model of stroke. To this end, a recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype was for the first time identified that enabled the transduction of both SGZ and SVZ NSCs. In the SVZ, 4D overexpression resulted in increased NSC proliferation and neurogenesis providing a proof of principle for the rAAV- 4D system. Additionally, a photothrombotic and an endothelin-1 (ET-1) striatum stroke model were established for both histological and behavioural analysis. In the ET-1 model, SVZderived neuroblast migration towards the site of injury was observed. Histological analysis of rAAV-mediated 4D overexpression after ET-1 stroke demonstrated an increased number of migrating neuroblasts and neuronal survival in the striatum. Together with future cellular characterizations and behavioural tests, this work provides the basis for potential 4D applications not only for stroke but also for other neurodegenerative diseases. In a bigger picture, identification of rAAV serotypes that transduce other stem and progenitor cells could even further expand the toolbox of rAAV-4D treatments for clinical applications of different areas of regenerative medicine.

Breast cancer is the most common cancer among women in Sweden and globally. Socio-demographic, genetic and productive factors together with some endogenous and exogenous hormones and lifestyle are some of the risk factors that can cause this type of cancer. There is no cure for metastatic breast cancer but the treatment goal is to control the disease and prolong the survival. Treatment options in metastatic breast cancer are exactly like the ones in primary breast cancer. Targeted cancer therapy is a treatment that targets either one or some specific characters of the cancer. Serine-threonine kinases called CDK4/6 inhibitors like Ibrance with chemical name palbociclib, Kisqali with chemical name ribociclib and Verzenios with chemical name abemaciclib are used for target therapy against metastatic breast cancer. CDK4/6 inhibitors in combination with aromatase inhibitors, estrogen receptor down regulators or selective receptor modulators are also used to address the treatment resistant metastatic breast cancers. The aim of this thesis is to investigate the role and the effect of CDK4/6 inhibitors in the treatment of metastatic breast cancer. Six randomized controlled trial studies were selected from the PubMed data base. Results from the trial analysis showed equal effects and relative same adverse event profiles between those three mentioned CDK4/6 inhibitors. The primary endpoint, progression free survival and secondary endpoints including overall survival, clinical benefit rate, overall response rate and safety were investigated in these studies. The duration of progression free survival (PFS) and overall response rate (ORR) was longer and improved in most studies however improvement in overall survival (OS) was not achieved. More research studies are needed to determine optimal treatment for patients with metastatic breast cancer who are medicated by CDK4/6 inhibitors. / Bröstcancer är den vanligaste cancerformen bland kvinnor i Sverige och globalt. Sociodemografiska, genetiska och reproduktiva faktorer samt vissa endogena och exogena hormoner och livsstil är några riskfaktorer som kan orsaka denna typ av cancer. Metastatisk bröstcancer innebär att cancer har spridit sig bland andra organ i kroppen bland annat ben, hjärna, lever och lungor. Det finns inget botemedel mot metastatisk bröstcancer men målet är att kontrollera sjukdomen och förlänga överlevnaden och behandlingsalternativ för detta är exakt som den i den primära bröstcancern. Målspecifik cancerterapi är en behandling som riktar sig mot någon specifik karaktär hos cancercellerna. En klass av läkemedel består av en stor familj av serintreoninkinaser som kallas CDK4/6-hämmare: Ibrance (palbocilcib), Kisqali (ribocilcib) och Verzenios (abemaciclib) används mot metastaserad bröstcancer. Syftet med det här examensarbetet var att undersöka rollen samt effekten av CDK4/6 hämmare vid behandling av metastatisk bröstcancer. Sex randomiserade kliniska studier erhölls från artikelsökningar i databasen PubMed. Resultat från artikelanalyser visade likvärdiga effekter samt relativt samma biverkningsprofil mellan de tre ovannämnda CDK4/6 inhibitorerna. Den primära utfallsvariabeln var progressionsfri överlevnad och de sekundära utfallsvariablerna inkluderade total överlevnad, klinisk nytta, den totala svarsfrekvensen och säkerhet undersöktes i dessa studier. Varaktigheten av progressionsfri överlevnad (PFS) samt den totala svarsfrekvensen (ORR) var längre och förbättrades i nästan alla studier medan den totala överlevnaden (OS) kunde inte fastställas då inte tillräckligt med data kunde samlas in. Ytterligare undersökningar behövs för att förstå den fulla mekanismen bakom resistensutveckling samt utöka strategier för att minska negativa biverkningar av CDK4/6 hämmare vid behandling av patienter vid metastatisk bröstcancer.

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Estrogen receptor (ER)-positive breast cancer is responsive to a number of targeted therapies used clinically. Unfortunately, the continuous application of any targeted therapy often results in resistance to the therapy. Our ultimate goal is to use mathematical modelling to optimize alternating therapies that not only decrease proliferation but also stave off resistance. Toward this end, we measured levels of key proteins and proliferation over a 7-day time course in ER-positive MCF7 breast cancer cells. Treatments included endocrine therapy, either estrogen deprivation, which mimics the effects of an aromatase inhibitor, or fulvestrant, an ER degrader. These data were used to calibrate a mathematical model based on key interactions between ER signaling and the cell cycle. We show that the calibrated model is capable of predicting the combination treatment of fulvestrant and estrogen deprivation. Further, we show that we can add a new drug, palbociclib, to the model by measuring only two key proteins, c-Myc and hyperphosphorylated RB1, and adjusting only parameters associated with the drug. The model is then able to predict the combination treatment of estrogen deprivation and palbociclib. Then we added the dynamics of estrogen concentration in the medium into the model and extended the short-term model to a long-term model. The long-term model can simulate various mono- or combination treatments at different doses over 28 days. In addition to palbociclib, we add another Cdk4/6 inhibitor to the model, abemaciclib, which can induce apoptosis at high concentrations. Then the model can match the effects of abemaciclib treatment at two different doses and also capture the apoptosis effects induced by abemaciclib. After calibrating the model to these different treatment conditions, we used the model to explore the synergism among these different treatments. The mathematical model predicts a significant synergism between palbociclib or abemaciclib in combination with fulvestrant. And the predicted synergisms are verified by experiments. This critical synergism between these Cdk4/6 inhibitors and endocrine therapy could reflect the reason that Cdk4/6 inhibitors achieve pronounced success in clinic trails. Lastly, we used protein biomarkers (cyclinD1, cyclinE1, Cdk4, Cdk6 and Cdk2) and palbociclib dose-response proliferation assays to assess the difference between mono- and alternating therapy after 10 weeks of treatments. But neither the protein levels nor palbociclib dose-response show significant differences after 10 weeks of treatment. Therefore, we cannot conclude that alternating therapy delays palbociclib resistance compared with palbociclib mono-treatment after 10 weeks. Longer term experiments or other methods will be needed to uncover any difference. However, in this research we showed that a mechanism-based mathematical model is able to simulate and predict various effects of clinically-used treatments on ER-positive breast cancer cells at different time scales. And this mathematical model has the potential to explore ideas for potential drug treatments, optimize protocols that limit proliferation, and determine the drugs, doses, and alternating schedule for long term experiments. / Doctor of Philosophy / Estrogen receptors are proteins found inside breast cancer cells that are activated by the hormone estrogen. Estrogen-receptor positive breast cancer is the most common type of breast cancer and accounts for about 70% of breast cancer tumors. Endocrine therapy, which inhibits estrogen receptor signaling, and Cyclin-dependent kinase 4 and 6 (Cdk4/6) inhibitors are the preferred first-line therapy for patients with estrogen receptor-positive cancers. We built a mathematical model of MCF7 cells (an estrogen receptor-positive breast cancer cell line) in response to these standard first-line therapies. This mathematical model can capture the experimentally observed protein and cell proliferation changes in response to various treatment conditions, including different drug combinations, different doses, and different treatment durations up to 28 days. The model can then be used to look for more effective treatment possibilities. In particular, our mathematical model predicted a strong synergism between Cdk4/6 inhibitors and endocrine therapy, which could allow significant reductions in drug dosage while producing the same effect. This synergism was verified by experiments. In addition to treatment methods where one drug or combination of several drugs is used continuously, we consider alternating among various therapies in a fixed cycle. The mathematical model can help us determine which drugs and which doses might be most appropriate. Since an alternating therapy doesn't inhibit one particular target non-stop, the hope is that alternating therapies can delay the onset of drug resistance, where the drug becomes less effective or stops working completely. Unfortunately, an initial 10- week experiment to test for differences in resistance to a mono-therapy versus an alternating therapy did not show a significant difference, pointing to the need for longer experiments to see if alternating therapies can actually make a difference in resistance. Mathematical models will be important for determining the drugs, doses, and time intervals to be used in these experiments, as figuring out the best options by trial and error in such long-term experiments is not practical.

Krebserkrankungen stellen in Deutschland die zweithäufigste Todesursache dar und die Anzahl der Neuerkrankungen nimmt stetig zu. Frühzeitige Diagnosen und Therapiemöglichkeiten sind daher dringend erforderlich. Cyklinabhängige Proteinkinasen (Cdk) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Viele Tumore zeigen eine deregulierte Cdk4‑Aktivität und/oder ‑Expression. Insgesamt zeigen ca. 80% aller Tumore eine Fehlregulation der für den Zellzyklus zentralen Cdk4/CykD1/INK4/pRb/E2F Signalkaskade. Somit besitzen Cdks ein enormes therapeutisches Potential im Kampf gegen Krebs. Die spezifische Inhibierung der Cdks verhindert die Zellproliferation und damit das Tumorwachstum. In den letzten Jahren wurden verschiedenste Strukturklassen vorgestellt, die als Cdk4-Inhibitor wirken. Im Rahmen der Promotion sollen die Möglichkeiten einer funktionellen Tumordiagnose mittels cyklinabhängiger Kinasen untersucht werden. Die Entwicklung von radioaktiv markierten Inhibitoren der Cdk4/6 als Radiotracer und ihre radiopharmakologische Charakterisierung stellt dabei einen neuen Ansatz dar. Um die Rolle der Cdk4/6 im Zellzyklus von gesunden und deregulierten (z.B. Tumor-) Zellen aufzuklären, sollten mit Iod-124 und Fluor-18 markierte Inhibitoren eingesetzt werden, die hochselektiv diese Cdks blockieren. Zunächst wurden verschiedene Inhibitoren der Cdk4/6 und deren Vorstufen für die Radiomarkierung dargestellt. Die bereits aus den Vorarbeiten von VanderWel et al., 2005 und Toogood et al., 2001 bekannten Syntheserouten mussten dazu optimiert werden und für neue Verbindungen, wie die fluorethylierten Substanzen, wurden neue Reaktionswege gefunden. Die dargestellten Referenzverbindungen CKIA-E wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie an den Zelllinien HT-29 und FaDu auf ihre inhibitorischen Wirkung untersucht. Die Untersuchungen der Verbindungen CKIA/B/E zeigte, dass ein Zellzyklusarrest unter Einwirkung der Inhibitoren erreichbar ist. Die weiteren Untersuchungen zur Radiomarkierbarkeit sowie die radiopharmakologische Evaluation sollten daher an den Verbindungen CKIA, CKIB und CKIE stattfinden. Die Darstellung der Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB erfolgte in zwei Schritten über die elektrophile Substitution durch regioselektive Destannylierung mit anschließender Entschützung der Seitenkette. Die Darstellung der fluorethylierten Verbindung erfolgte ebenfalls über eine Zweischrittsynthese beginnend mit der Synthese der prosthetischen Gruppe [18F]BFE aus der Tosylmarkierungsvorstufe. Die zur Markierung des sekundären Amins zur Auswahl stehenden prosthetischen Gruppen [18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [18F]Bromfluorethan ([18F]BFE) wurden auf ihre Eignung untersucht, ebenso wie die Auswahl einer geeigneten Markierungsvorstufe für die Darstellung der prosthetischen Gruppe. Die optimierten Syntheserouten ermöglichten die Isolierung von ausreichenden Mengen an Produktaktivität für die radiopharmakologischen Untersuchungen. Es fanden, neben der Bestimmung der spezifischen Aktivität und der Lipophilie der Verbindungen, Zellaufnahmeuntersuchungen und Bestimmungen zur Stabilität der Verbindungen in vitro, ex vivo und in vivo statt. Die radioiodierten Verbindungen konnten des Weiteren zur Untersuchungen der Bioverteilung in normalen männlichen Wistar-Ratten eingesetzt werden. Für alle drei Verbindungen konnte eine sehr hohe in vitro-Stabilität festgestellt werden. Die Zellaufnahmeuntersuchungen zeigten vor allem für die Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB eine beträchtliche Zellaufnahme von über 1000% ID/mg Protein nach 2 h. Die Zellaufnahme der Verbindung CKIE ist geringer, sollte allerdings für eine in vivo-Anwendung ausreichend sein. Die Untersuchung der in vivo‑Stabilität der Verbindungen [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE im Blut von Wistar Ratten ergab allerdings, dass alle Verbindungen schnell metabolisiert werden. Die Untersuchung der Bioverteilung der radioiodierten Verbindungen belegen eine in vivo Radiodeiodierung sowie eine hohe hepatobliliäre Auscheidungsrate. Im Hinblick auf eine Anwendung als Radiotracer konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Erkenntnisse gewonnen werden. Die dargestellten Inhibitoren sind in der Lage am Zellmodell den Zellzyklusarrest in der G1-Phase zu induzieren. Eine Radiomarkierung der ausgewählten Strukturen liefert das Produkt mit reproduzierbarer Ausbeute in hoher radiochemischer Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität, allerdings ist eine Herstellung der fluorethylierten Verbindung unter GMP-Bedingungen nur schwer realisierbar. Die radiomarkierten Verbindungen zeigen eine hohe in vitro-Stabilität und werden energieabhängig in die Zelle aufgenommen. Anhand der Stabilitätsuntersuchungen in vivo wurde gezeigt, dass alle drei Verbindungen in vivo instabil sind und sehr schnell hepatobiliär eliminiert.

Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) wurden als essentielle Enzyme für die Regulation des Zellzyklus mit kritischem Beitrag zur gestörten Zellproliferation während der Kanzerogenese identifiziert. Als Konsequenz davon erwiesen sich die Cdk4/6 als attraktive Zielproteine für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur pharmakologischen Tumorbehandlung. Verbindungen aus der Substanzklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine zeigten vielversprechende inhibitorische Wirkungen auf die Aktivität der Cdk4/6 bei gleichzeitiger herausragender Selektivität gegenüber anderen Cdk. Anschließende Untersuchungen in vitro und in vivo verdeutlichten das Potential einiger Pyrido[2,3 d]pyrimidine zur Inhibierung des Tumorzellwachstums. Die Weiterentwicklung und Nutzung selektiver Cdk4/6-Inhibitoren zur funktionellen Charakterisierung der Cdk4/6 in Tumoren in vivo mit Hilfe der nicht-invasiven Bildgebungstechnik Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein neuer vielversprechender Forschungsansatz und von großem Interesse für die Evaluierung neuer Strategien zur Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung neuer potentieller Cdk4/6-Inhibitoren aus der Verbindungsklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine und deren Bewertung hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit zur gezielten Cdk4/6-Inhibierung in ausgewählten Tumorzelllinien sowie ihres Potentials zur funktionellen Bildgebung der Cdk4/6 in Tumoren mittels PET am Tiermodell. Die biochemische Charakterisierung der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB, CKIC, CKID und CKIE hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen Wirkung erfolgte in den kontinuierlich proliferierenden humanen Tumorzelllinien HT-29, FaDu und THP 1 und in differenzierten THP-1-Makrophagen. Die Zweckmäßigkeit der untersuchten Zelllinien zur Charakterisierung potentieller Cdk4/6-Inhibitoren wurde anhand von Studien zur mRNA-Expression und Proteinbiosynthese der Kinasen Cdk4/6 nachgewiesen. Des Weiteren wurde das Vorkommen der Cdk4/6 in den humanen Xenograft-Tumoren HT-29 und FaDu, sowie in ausgewählten Organen und Geweben von nu/nu-NMRI-Mäusen charakterisiert. In vitro wurden für alle untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine signifikante, konzentrations- und zeitabhängige inhibitorische Effekte auf die Tumorzellproliferation beobachtet. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen 24 Stunden nach Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme des Anteils der HT-29-, FaDu- und THP-1-Zellen in der G1-Phase bis auf 90%. Für die nicht-proliferierenden THP 1-Makrophagen wurden bei Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen geringe Veränderungen ihrer Zellzahl und Zellzyklusphasen-verteilung detektiert. Die zellulären Studien identifizierten deutliche qualitative und quantitative Unterschiede der untersuchten Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Nanomolare Konzentrationen von CKIA, CKIB bzw. CKIE erzielten bereits 24 Stunden nach Inkubation deutliche Effekte, während für CKIC und CKID die 10- bis 100-fache Konzentration eingesetzt werden musste, um eine ähnliche Wirkung zu erhalten. Die molekularen Ursachen der Wachstumshemmung und des Zellzyklusarrests wurden durch Untersuchungen zur Pyrido[2,3 d]pyrimidin-abhängigen Beeinflussung des Cdk4/6-Cyclin D-Retinoblastom-E2F-Signalwegs geklärt. In allen Zelllinien wurde eine deutliche Inhibierung der Cdk4/6-spezifischen Phosphorylierung der Aminosäure Serin-780 des Retinoblastom-Proteins (pRb) beobachtet. Als Konsequenz dieser Inhibierung wurde für CKIA, CKIB und CKIE die signifikante konzentrationsabhängige Unterbrechung der Genexpression von E2F-1 und PCNA nachgewiesen. Die Radiomarkierung der Cdk4/6-Inhibitoren CKIA und CKIB mit 124I bzw. von CKIE mit 18F ermöglichte erstmals die Charakterisierung von in vivo-Interaktionen und des Metabolismus im Blut zirkulierender Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Die radiopharmako-logischen Eigenschaften von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE wurden in Untersuchungen zur zellulären Radiotracer-Aufnahme, der metabolischen Stabilität und der Bioverteilung bei Ratten sowie abschließend in Kleintier-PET-Untersuchungen bei FaDu-Tumor-tragenden nu/nu-NMRI-Mäusen analysiert. In vitro-Experimente mit [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE verdeutlichten eine hohe Stabilität und schnelle Aufnahme der Radiotracer in humane Tumorzellen bei 37°C. Allerdings deutet die Zelltyp-unabhängige Anreicherung auf eine geringe Abhängigkeit der Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Akkumulation vom Cdk4/6-Status der Zellen hin. Die signifikant geringeren Aufnahmewerte aller untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine bei 4°C und die Blockierung der Aufnahme von [18F]CKIE mit nichtradioaktivem CKIE unterstützen die Vermutung spezifischer Transportmechanismen für die Aufnahme der Pyrido[2,3 d]pyrimidine. Untersuchungen von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE in vivo identifizierten eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende Eliminierung aus dem Blut und die primäre Aufnahme in die Leber als grundlegende Stoffwechseleigenschaft aller drei Radiotracer. Aus den PET-Untersuchungen mit [124I]CKIA und [124I]CKIB bei FaDu-Tumor-tragenden Mäusen wurden nur marginale Anreicherungen der radioaktiven Substanzen im Bereich des Tumors festgestellt. Für [18F]CKIE wurde eine Akkumulation im proliferierenden Randbereich des Tumors beobachtet. Die schnelle Metabolisierung von [18F]CKIE im Blut sowie das konstante, geringe Verhältnis der Aktivität im Tumor zur Aktivität im Skelettmuskel wiesen allerdings auf eine unspezifische Anreicherung hin. Schlussfolgernd aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde die Effektivität der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB und CKIE hinsichtlich der Inhibierung der Cdk4/6-vermittelten Zellzyklusprogression gezeigt. Die antiproliferative Aktivität der Substanzen unterstützt eine weiterführende Evaluierung dieser Cdk4/6-Inhibitoren zur pharmakologischen Tumortherapie. Auf der Basis der erhaltenen radiopharmakologischen Ergebnisse werden die kurze biologische Halbwertszeit und unspezifische Tumoranreicherung von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE als limitierende Faktoren für die Eignung dieser Verbindungen als Radiotracer zur nicht-invasiven Bildgebung der Cdk4/6 im Zielgewebe mittels PET angesehen. Es bleibt zu klären, ob eine längere Verweildauer und höhere Stabilität radiomarkierter Pyrido[2,3-d]pyrimidine im Blut die Chance der Cdk4/6-spezifischen Gewebeanreicherung erhöhen oder Transport-mechanistische Effekte allein ausschlaggebend für die Anreicherung in Zellen und Geweben sind. Die Untersuchung optimierter Cdk4/6-selektiver Inhibitoren für die Charakterisierung und Therapie von Tumoren bleibt weiterhin ein interessanter Aspekt in der Tumorforschung.

La sénescence est considérée comme un mécanisme de suppression tumorale puisque les cellules potentiellement dangereuses, activent leurs protéines de sauvegarde pour arrêter leur prolifération. Les protéines de sauvegarde telles que RB et p53 sont activées suite à différents stress comme des dommages à l’ADN, le raccourcissement des télomères ou l’induction oncogénique. Les cellules sénescentes restent métaboliquement actives, subissent des modifications dans leur expression génique, et sécrètent des cytokines et des chimiokines qui ont des effets paracrines pro-oncogéniques, mais peuvent également contribuer à la stabilité de l’arrêt du cycle cellulaire dans la sénescence de façon autocrine. Une des particularités du phénotype sénescent est la dégradation sélective des protéines dépendante de l’ubiquitination et du protéasome. Parmi les cibles de dégradation se trouvent des protéines impliquées dans la biogenèse du ribosome, ainsi que celles d’autres voies cellulaires requises pour la croissance de cellules cancéreuses. Ceci est lié à un stress nucléolaire qui affecte la biogenèse du ribosome, menant à l’accumulation, dans le nucléoplasme ou le nucléole, de protéines ribosomiques. Ce comportement suggère que les ribosomes des cellules sénescentes seraient structurellement différents. Par conséquent, ceci pourrait entrainer des effets sur leurs capacités à réguler l’initiation, l’élongation et/ou la terminaison de la traduction des ARN messagers (ARNm). Par ailleurs, la déplétion de certaines protéines impliquées dans la ribogenèse, ainsi que la surexpression de protéines ribosomiques telles que RPS14/uS11 amènent à la sénescence. Malgré le stress nucléolaire et les défauts de ribogenèse associés à la sénescence, les cellules sénescentes présentent des niveaux de translecture du codon d’arrêt très diminué, suggérant l’existence de défauts de production de protéines allongées en C-terminal. Nous émettons l’hypothèse que les défauts de la ribogenèse affecteraient la fonction des protéines ribosomiques et des ribosomes. Cette perturbation aurait un impact sur le rôle de suppresseur tumoral de la sénescence. Le premier objectif de cette thèse consiste à démontrer le rôle de RPL22/eL22 en tant que régulateur du cycle cellulaire et inducteur de la sénescence. Le deuxième but est de démontrer que, malgré la perturbation nucléolaire, les ribosomes des fibroblastes sénescents reconnaissent les codons d’arrêt de façon plus efficace que les ribosomes des cellules transformées, ou des cellules normales en prolifération. Nous avons démontré que le phénotype de sénescence peut être induit quand l’expression de RPL22/eL22 est augmentée. RPL22/eL22 s’accumule principalement dans le nucléole, de manière différente de RPS14/uS11, dont l’accumulation est nucléoplasmique. En effectuant des essais kinases in vitro, nous avons montré que RPL22/eL22, tout comme RPS14/uS11, peuvent interagir et inhiber le complexe CDK4-Cycline D1 afin d’activer la voie de RB et établir l’arrêt du cycle cellulaire et la sénescence. Afin de démontrer la fidélité de la terminaison de la traduction dans les cellules sénescentes, nous avons utilisé un système de rapporteurs de luciférases, pour détecter les erreurs de translecture ainsi que pour avoir un contrôle interne du système. L’inactivation de la voie du suppresseur tumoral RB par surexpression de CDK4 ou de l’oncoprotéine virale E7, nous a permis d’observer l’augmentation de la translecture dans les cellules sénescentes. Tandis que l’activation de la voie de suppression tumorale RB, à l’aide du suppresseur de tumeur PML, de la surexpression de RPL22/eL22 et de RPS14/uS11, ainsi que de l’utilisation de Palbociclib (PD-0332991), un inhibiteur des kinases CDK4/6, a montré une réduction des erreurs de translecture. Ces résultats indiquent une nouvelle fonction des protéines du ribosome en tant que suppresseurs de tumeur, permettant d’inhiber les erreurs de translecture du codon d’arrêt de façon dépendante de la voie de RB. Ces travaux suggèrent que de petites molécules ou peptides pourraient simuler les fonctions inhibitrices de ces protéines ribosomiques afin de traiter certains cancers où la voie de RB est activable. / Senescence is considered a mechanism for tumor suppression since potentially dangerous cells activate their protective proteins to stop their proliferation. Safeguard proteins such as RB and p53 are activated as a result of stress such as DNA damage, telomere shortening or oncogenic induction. Senescent cells are metabolically active, they undergo changes in their gene expression and secrete cytokines and chemokines with pro-oncogenic paracrine effects, but which can also contribute to the stability of the senescent cell cycle arrest in an autocrine way. One of the peculiarities of the senescent phenotype is the selective ubiquitination and proteasome dependent-degradation of proteins involved in ribosome biogenesis and other cellular pathways required for cancer cell growth, leading to the accumulation, in the nucleoplasm or nucleolus, of ribosomal proteins. This behavior suggests that the ribosomes of senescent cells are structurally different. Therefore, this could have effects on their ability to regulate the initiation, elongation and/or translation termination of messenger RNAs (mRNAs). Moreover, the depletion of some proteins involved in ribogenesis, as well as the overexpression of ribosomal proteins such as RPS14/uS11 lead to senescence. Despite nucleolar stress and ribogenesis defects associated to senescence, global translation does not seem to be affected in senescence. Strikingly, senescent cells have reduced translational readthrough suggesting that they have defects in the production of C-terminal extended proteins. We hypothesize that defects in ribogenesis would affect the function of ribosomal proteins and ribosomes influencing the tumor suppressor role of senescence. The first aim of this thesis is to demonstrate the role of RPL22/eL22 as a regulator of the cell cycle and senescence inducer. The second aim of this thesis is to demonstrate that, despite the nucleolar disruption, the ribosomes of senescent fibroblasts recognize stop codons more efficiently than ribosomes from transformed cells, but also than ribosomes from proliferating normal cells. We found that the senescent phenotype can be induced by enhancing the expression of RPL22/eL22. RPL22/eL22 accumulates mainly in the nucleolus, unlike RPS14/uS11, whose accumulation is nucleoplasmic. By performing an in vitro kinase assay, we showed that RPL22/eL22, just like RPS14/uS11, can interact and inhibit the CDK4-Cyclin D1 complex in order to activate the RB pathway and establish cellular arrest and senescence. To assess translation termination accuracy in senescent cells, we used a system of luciferase reporters to measure the fidelity of translation termination. Inactivation of the RB tumor suppressor pathway using CDK4 or the viral oncoprotein E7 also increased readthrough in senescent cells while overexpression of PML, a tumor suppressor that activates the RB pathway, overexpression of RPL22/eL22 and RPS14/uS11, as well as the use of Palbociclib (PD-0332991), a CDK4/6 inhibitor, reduce readthrough errors. These results indicate a novel function of ribosomal proteins as tumor suppressors, making it possible to inhibit translational readthrough errors, in a RB-dependent pathway. This work suggests that small molecules or peptides could mimic the inhibitory functions of these ribosomal proteins in order to treat cancers where the RB pathway is activatable.