CDK4 est une sérine/thréonine kinase qui est largement décrite pour son implication dans le contrôle du cycle cellulaire. Notre laboratoire et d'autres ont montré qu'elle jouait également un rôle majeur dans le contrôle de l'homéostasie du glucose (croissance des cellules β du pancréas et sécrétion d'insuline) et des lipides (adipogenèse). Nous avons montré au cours de cette thèse, par le biais de deux modèles de souris, invalidés pour CDK4 (Cdk4-/- ;cre/cre) ou exprimant un mutant hyperactif de la kinase (Cdk4R24C/R24C), qu'elle est un médiateur important de la voie de l'insuline et régule la lipogenèse et la lipolyse. Les souris Cdk4-/- ;cre/cre ont une diminution significative de la taille des adipocytes et du poids du WAT ou l'inverse est observé sur les souris Cdk4R24C/R24C. CDK4 est activée par l'insuline et va ainsi promouvoir le transport de glucose, la synthèse des lipides de novo et réprimer la lipolyse dans les adipocytes. De plus, nous avons démontré que dans l'adipocyte, cellule non proliférative, CDK4 et son partenaire la cycline D3 sont préférentiellement localisés dans le cytoplasme suggérant un rôle indépendant de leurs fonctions nucléaires. Nous avons identifié deux nouveaux substrats de CDK4 : IRS1 et IRS2. CDK4 phosphoryle IRS1 et IRS2 activant un rétrocontrôle positif permettant le maintien de l'action de l'insuline sur les adipocytes. Nos résultats prouvent un nouveau rôle de CDK4 sur la signalisation de l'insuline et sa fonction dans l'adipocyte. Par conséquent, la modulation de son activité pourrait avoir des conséquences majeures sur le mécanisme de résistance à l'insuline, une complication fréquente dans le développement de pathologies comme le diabète et l'obésité. / CDK4 is a serine/threonine kinase mainly known by its involvement in the control of cell cycle progression. Our laboratory and other laboratories have previously shown a major role for CDK4 in the control of glucose homeostasis (pancreatic β-cell growth) and lipid homeostasis (adipogenesis). In this thesis, we showed that CDK4 is an insulin effector that controls lipogenesis and lipolysis in mature adipocytes. We used Cdk4-/- ;cre/cre mice and Cdk4R24C/R24C mice, carrying a hyperactive mutant Cdk4 allele, for this study. Cdk4-/ - ;cre/cre mice have a manifest adipose tissue phenotype with a significant decrease in body weight and WAT mass. On the other hand, Cdk4R24C/R24C mice show increased body weight and increased adiposity. Furthermore, we demonstrate that CDK4 is activated by insulin to promote glucose transport, lipogenesis and repress lipolysis in adipocytes. Interestingly, we showed that in mature quiescent adipocytes CDK4 and its partner, Cyclin D3, are preferentially localized in the cytoplasm, suggesting a role independent from their nuclear functions. We identified two novel substrates of CDK4: IRS1 and IRS2. CDK4 phosphorylates both IRS1 and IRS2 in order to sustain insulin signaling in adipocytes via a positive feed-back loop. To sum up, our results identify a new function of CDK4 on insulin signaling in adipocyte metabolism. Thus, the modulation of its activity could have consequences on insulin resistance, a common complication of obesity and diabetes.

Recently developed potent and selective CDK4/6 inhibitors fall into two classes based on structure and toxicity profiles in clinical studies. One class, exemplified by palbociclib and ribociclib, exhibits neutropenia as a dose-limiting toxicity and requires discontinuous dosing. In contrast, the structurally distinct CDK4/6 inhibitor abemaciclib is dosed continuously, and has diarrhea and fatigue as dose-limiting toxicities. In preclinical models, palbociclib has been extensively studied and induces cell cycle inhibition in an RB-dependent manner. Thus far, abemaciclib has been less extensively evaluated. We found that abemaciclib cell cycle inhibitory activity is RB-dependent at clinically achievable concentrations. Abemaciclib elicited potent suppression of RB/E2F regulated genes associated with prognosis in ER-positive breast cancer. However, unlike palbociclib, at 250nM-1 mu M doses abemaciclib induced cell death in RB-deficient cell lines. This response was associated with a rapidlyinduced multi-vacuolar phenotype indicative of lysosomal membrane permeabilization that could be ameliorated with chloroquine. This event was not a reflection of inhibition of other CDK family members, but could be recapitulated with CBX4945 that inhibits casein and DYRK/HIPK kinases. To determine if these "off-target" features of abemaciclib were observed in vivo, mice harboring matched RB-positive and negative xenografts were treated with palbociclib and abemaciclib. In vivo, all of the apparent activity of abemaciclib was RB-dependent and strongly elicited suppression of cell cycle regulatory genes in a fashion markedly similar to palbociclib. Using gene expression data from cell lines and tumors treated with abemaciclib and palbociclib a composite signature of response to CDK4/6 inhibition was developed that included many genes that are individually required for tumor cell proliferation or viability. These data indicate that while abemaciclib and palbociclib can exert distinct biological and molecular effects, there are common gene expression features that could be broadly utilized in measuring the response to CDK4/6 inhibition.

L’avènement du séquençage haut débit a mis en lumière l’hétérogénéité des cancers du sein qui peuvent être groupés en fonction d’altérations moléculaires spécifiques qui sont pour certaines à la base de thérapies ciblées dans le cadre de la médecine personnalisée. Néanmoins de nombreuses complications viennent compromettre le succès thérapeutique de ces approches. En effet, l’une des thérapies ciblées les plus efficaces développées récemment, les inhibiteurs de CDK4/6, sont prescrits chez tous les patients HR+/HER aux stades avancés de la maladie alors même qu’aucun biomarqueur n’a pour l’heure été identifié. Ainsi les données pharmacodynamiques et les marqueurs pronostics font cruellement défaut pour ces patients. Afin d’identifier de tels marqueurs, nous avons conduit une étude clinique « fenêtre d’opportunité » incluant 100 patients à un stade précoce de la maladie. L’analyse en IHC et les études de profilage expression génomique des tumeurs a permis de montrer qu’une courte exposition au palbociclib, un inhibiteur de CDK4/6 induisait un arrêt du cycle cellulaire révélé par une diminution de phospho-Rb et Ki67. Cette corrélation entre diminution du phospho-Rb et la diminution de la prolifération suggère d’ailleurs son utilisation comme biomarqueur de la réponse au palbociclib. Une analyse sur puce à cDNA a permis d’identifier un panel de gènes régulateurs de la prolifération (MKI67, TOP2A, BIRC5) et de la machinerie du cycle cellulaire (PLK1, FOXM1) modulé par le palbociclib. Bien que nous n’ayons pu identifier de marqueurs de résistance au palbociclib en condition basale, nous avons observé des niveaux élevés de CCNE chez les patients traités résistants au palbociclib. Cette donnée a été confirmée chez les patients aux stades avancés de la maladie dans le cadre d’une étude menée en collaboration avec un groupe britannique. D’autres données obtenues en collaboration avec une équipe de l’université Vanderbilt, ont par ailleurs permis de suggérer une contribution des inhibiteurs de CDK4/6 à la réversion de la résistances aux hormonothérapie en inhibant l’expression les gènes cibles du facteur de transcription E2F4. Pour finir, les activités biologiques et cliniques des différents inhibiteurs de CDK4/6 disponibles n’étant pas exactement identiques, un second essai clinique « fenêtre d’opportunité » nous a permis de mettre en évidence un profil de toxicité distinct de l’abemaciclib et de montrer que, contrairement au palbociclib, l’abemaciclib montre une efficacité lorsqu’il est utilisé seul. Une des explications possible de ces différentes activités serait un spectre d’action de l’abemaciclib ciblant plus efficacement la CDK9, même si l’impact clinique associé n’a pas été examiné en détail et qu’une comparaison rigoureuse de l’activité de ces deux inhibiteurs de CDK n’a pas encore été réalisée. / New sequencing methods have revealed that breast cancer is heterogeneous and characterized by different subgroups harboring specific molecular alterations for which targeted therapies have been developed with the hope of implementing personalized medicine. However, this approach has been proven far too simplistic. Indeed, one of the latest and more efficient targeted therapies to be developed in breast cancer are the CDK4/6 inhibitors, approved for all HR+/HER2- advanced breast cancers. So far, and despite the significant number of patients treated with these drugs, no biomarkers of efficacy have been identified and no clear information about pharmacodynamics have been presented. In order to determine biomarkers of efficacy and pharmacodynamics of palbociclib, the first approved CDK4/6 inhibitor, we conducted a window of opportunity clinical trial in 100 early breast cancer patients. IHC and GE analyses identified that a short period of palbociclib treatment was able to induce cell cycle arrest as determined by decreased phospho-Rb expression and this was accompanied by a profound decrease in proliferation as determined by lnKi67<1 after treatment, with a correlation between changes in proliferation and changes in phospho-Rb, suggesting that early decrease in phospho-Rb could be linked to sensitivity to this drug. Microarray analyses identified that palbociclib modulates genes involved in proliferation (such as MKI67, TOP2A, BIRC5) and cell cycle (such as PLK1, FOXM1). Despite we were not able to identify baseline biomarkers of resistance to this treatment, we observed that levels of CCNE remained high in palbociclib-resistant patients. This finding was further validated in collaboration with an-UK research group who had conducted biomarker research in the advanced setting. Moreover, our data helped also to determine in a different collaboration with Vanderbilt University, that CDK/6 inhibitors might contribute to reverse endocrine resistance generated by activation of genes linked to the E2F4 transcription factor. Finally, as preclinical and clinical data suggest some diversity between different CDK4/6 inhibitors, we decided to conduct a second window of opportunity trial with a second CDK4/6 inhibitor, abemaciclib, who has shown different toxicity profile and, unlike palbociclib, significant efficacy as single-agent. One suggested explanation could be due to a higher impact on CDK9, although its clinical impact has not been determined and no comparison between these two drugs has been performed.

La sénescence cellulaire est une réponse aux stresses selon laquelle des cellules pouvant proliférer optent pour entrer dans un arrêt du cycle cellulaire en réponse à une variété de stimulations intrinsèques et extrinsèques telle que, par exemple, le raccourcissement des télomères, un stress oxydatif, des dommages à l’ADN ou l’activation constitutive d’oncogènes. Toutes ces stimulations ont en commun le potentiel d’initier ou de promouvoir une transformation néoplasique qui peut dégénérer en cancer. En fait, la sénescence est maintenant acceptée comme un mécanisme cellulaire autonome pour empêcher le développement du cancer et elle est reconnue, particulièrement dans les cellules humaines, pour s’établir et se maintenir à l’aide d’au moins deux voies de suppression tumorale majeures : les voies de p53/p21CIP et de p16INK4A/pRB. Ces deux voies sont capables d’activer et d’augmenter l’expression d’un autre suppresseur tumoral : la protéine PML. En tant que suppresseur de tumeur, PML est suffisant pour induire la sénescence dans des cellules normales, mais il n’arrive généralement pas à activer une réponse complète de sénescence dans les cellules cancéreuses. Considérant ces faits, le premier objectif de cette thèse était d’étudier le mécanisme de résistance des cellules cancéreuses contre la sénescence induite par PML. Nous avons trouvé que, dans des cellules normales, la surexpression de CDK4 ou de CDK6 (CDK4/6) est suffisante pour contourner la sénescence induite par PML. De même dans les cellules cancéreuses, l’expression de ces kinases, souvent retrouvées augmentées dans de nombreux cancers, prévient probablement l’induction d’une sénescence par PML. Effectivement, grâce à l’inhibition de l’expression et/ou de la fonction kinase des CDK4/6, nous avons réussi à restaurer un programme de sénescence dans des cellules cancéreuses. En fait, l’utilisation de palbociclib, un inhibiteur spécifique de CDK4/6 maintenant en essais cliniques, permet d’augmenter l’habileté de PML à induire un arrêt de croissance plus fort et plus durable dans des cellules en cultures ainsi qu’une meilleure réduction de la progression de tumeurs dans des souris. Cette sénescence plus complète corrèle avec une augmentation de la présence de marqueurs d’autophagie, une meilleure répression des gènes cibles des E2F et une signature d’expression de gènes correspondant à l’inhibition de la méthylation de l’ADN. Ce dernier point découle du fait que l’inhibition de CDK4/6 par le palbociclib promeut une dégradation par autophagie de la DNA méthyltransférase DNMT1. Nous avons aussi démontré que CDK4 est capable d’interagir avec DNMT1 et de le phosphoryler in vitro. Ces résultats soulignent la valeur potentielle des inhibiteurs de CDK4/6 en tant que modulateurs épigénétiques pour faciliter l’activation de la sénescence dans des cellules cancéreuses. La sénescence induite par PML est fortement liée aux modifications post-traductionnelles. Parmi ces dernières, la SUMOylation joue un rôle important dans la fonction d’échafaudeur de PML et dans la formation des corps de PML. Les corps de PML sont des structures nucléaires dynamiques stimulées par des stresses, comme l’activation d’oncogènes menant à la sénescence, et dont la formation permet la séquestration de protéines spécifiques pour leur régulation et/ou pour leur modification post-traductionnelle. À travers le recrutement de protéines, les corps de PML régulent de nombreuses fonctions cellulaires telles que la sénescence, l’apoptose, la réponse antivirale, la réponse aux dommages à l’ADN et la régulation de l’expression de gènes. Compte tenu de cela, le deuxième objectif de cette thèse était de caractériser le rôle de la SUMOylation dans la sénescence induite par un oncogène, soit par l’expression de l’oncogène RAS. À l’aide d’une analyse du protéome de SUMO3 dans les cellules sénescentes versus des cellules en croissances, nous avons pu identifier 25 sites de SUMOylation dans 23 protéines dont l’incidence était significativement régulée par la sénescence. Il est à noter que la plupart de ces protéines (un tiers) sont connues pour être associées au corps de PML. Curieusement, UBC9 (la seule enzyme E2 pour la SUMOylation) a été retrouvée plus SUMOylée dans la sénescence sur sa Lys-49. Des études fonctionnelles d’un mutant d’UBC9 pour la Lys-49 ont démontré une diminution de son association aux corps de PML et la perte de la capacité d’UBC9 surexprimé à retarder la sénescence. De plus, la localisation forcée d’UBC9 dans les corps de PML gêne la sénescence induite par PML ou RAS. Ces résultats nous permettent de proposer des fonctions pro- et anti-sénescence de la SUMOylation des protéines, particulièrement pour UBC9. Mots-clés : Sénescence, PML, CDK4 et CDK6 (CDK4/6), méthylation de l’ADN, palbociclib, corps de PML, SUMOylation, UBC9 / Cellular senescence is a stress response wherein proliferating competent cells undergo a stable cell cycle arrest in response to a variety of intrinsic and extrinsic stimuli, including telomere shortening, oxidative stress, DNA damage or the constitutive activation of oncogenes among others. All these stimuli have in common the potential to initiate or promote neoplastic transformation that can degenerate in cancer. Senescence, particularly in human cells, is established and maintained by at least two major tumor suppressor pathways: the p53/p21CIP and p16INK4A/pRB pathways and is now accepted as a potent cell-autonomous mechanism for suppressing the development of cancer. Both pathways are able to activate and increase the expression of the tumor suppressor protein PML. As a tumor suppressor, PML is sufficient to induce senescence in normal cells; however, upon the same stimuli, cancer cells fail to engage a complete senescence response. Given this, the first aim of this thesis is to investigate the resistance mechanisms of cancer cells to PML-induced senescence. We found that overexpression of the CDK4 and CDK6 (which are often up-regulated in cancer) are sufficient to bypass PML-induced senescence in normal cells. In cancer cells the expression of these kinases impairs the PML-induced senescence. By inhibiting the expression and/or function of CDK4/6 we were able to restore the senescence program in cancer cells. Also, the specific CDK4/6 inhibitor palbociclib (currently used in clinical trials) increased the ability of PML to regulate a stronger and more permanent growth inhibition in cell culture and decreased tumor progression in mice. This complete senescence response correlated with an increase in autophagy markers, repression of E2F target genes and a gene expression signature of blocked DNA methylation. Furthermore, CDK4/6 inhibition by palbociclib promotes autophagy-dependant degradation of the DNA methyltransferase DNMT1. More important, we were able to demonstrate that CDK4 directly interacts and phosphorylates DNMT1 in vitro. These results highlight the potential value of CDK4/6 inhibitors as epigenetic modulators to facilitate activation of cellular senescence in cancer cells. PML-induced senescence is tightly regulated by post-translational modifications (PTMs). Among these PTMs, SUMOylation plays an important role in the scaffold function of PML and the formation of the PML-NBs (PML-Nuclear Bodies). PML-NBs are dynamic structures triggered by stress such as oncogene-induced senescence, and its formation allows the sequestration of target proteins for their regulation and/or its post-translational modification. By protein recruitment, PML-NBs regulate several cellular functions such as senescence, apoptosis, antiviral response, DNA repair and gene regulation. Given this; the second aim of this thesis is to characterize the role of SUMOylation in oncogene mediated cellular senescence, specifically by the expression of the oncogene RAS. By a SUMO3 proteome analysis of senescent cells we were able to identify 25 SUMO sites in 23 proteins that were significantly regulated during senescence. Importantly, most of these proteins were PML-NB associated. Interestingly, UBC9 (the only SUMO E2 enzyme), was found more SUMOylated in senescence on its Lys-49. Functional studies of a UBC9 mutant in Lys-49 showed a decreased association to PML-NBs and the loss of UBC9’s ability to delay senescence. Moreover, forced localization of UBC9 into PML-NBs counteracted RAS and PML-induced senescence. These results allowed us to propose a pro- and an anti-senescence function of protein SUMOylation, specifically for UBC9. Keywords: Senescence, PML, CDK4/6, DNA methylation, palbociclib, PML-NBs, SUMOylation, UBC9

ER positive (ER+) and HER2 negative (HER2-) breast cancers are routinely treated based on estrogen dependence. CDK4/6 inhibitors in combination with endocrine therapy have significantly improved the progression-free survival of patients with ER+/HER2- metastatic breast cancer. Gene expression profiling in ER+/HER2- models was used to define the basis for the efficacy of CDK4/6 inhibitors and develop a gene expression signature of CDK4/6 inhibition. CDK4/6 inhibition robustly suppressed cell cycle progression of ER+/HER2- models and complements the activity of limiting estrogen. Chronic treatment with CDK4/6 inhibitors results in the consistent suppression of genes involved in cell cycle, while eliciting the induction of a comparable number of genes involved in multiple processes. The CDK4/6 inhibitor treatment shifted ER+/HER2- models from a high risk (luminal B) to a low risk (luminal A) molecular-phenotype using established gene expression panels. Consonantly, genes repressed by CDK4/6 inhibition are strongly associated with clinical prognosis in ER+/HER2- cases. This gene repression program was conserved in an aggressive triple negative breast cancer xenograft, indicating that this is a common feature of CDK4/6 inhibition. Interestingly, the genes upregulated as a consequence of CDK4/6 inhibition were more variable, but associated with improved outcome in ER+/HER2- clinical cases, indicating dual and heretofore unknown consequence of CDK4/6 inhibition. Interestingly, CDK4/6 inhibition was also associated with the induction of a collection of genes associated with cell growth; but unlike suppression of cell cycle genes this signaling was antagonized by endocrine therapy. Consistent with the stimulation of a mitogenic pathway, cell size and metabolism were induced with CDK4/6 inhibition but ameliorated with endocrine therapy. Together, the data herein support the basis for profound interaction between CDK4/6 inhibitors and endocrine therapy by cooperating for the suppression of cell cycle progression and limiting compensatory pro-growth processes that could contribute to therapeutic failure.

No description available.

Deregulated cell proliferation, resulting from disruption of cell cycle control, is characteristic of many cancers. In normal cells, cell cycle progression is mediated by a family of cyclin dependent kinases (Cdks) that are positively regulated by associated cyclins. The activities of these cyclin-Cdk complexes are regulated by two protein families: the inhibitors of Cdk4 (INK4) and the kinase inhibitor proteins (KIP). p27 is a KIP family member that can inhibit cyclin E-Cdk2 activity. It also plays a role in the assembly and nuclear import of cyclin D-Cdk4 in early G1. p27 has been shown to be deregulated in human cancers by accelerated proteolysis, sequestration in cyclin D-Cdk complexes, and mislocalization to the cytoplasm. The causes of these alterations are not fully understood, but result, at least in part, from changes in signal transduction pathways that alter p27 phosphorylation and function. Activation of both the Ras/Raf/ mitogen activated protein kinase (MAPK) and the phospho-inositol 3' kinase (PI3K) pathways have been shown to alter p27 function and to activate p27 degradation in different cell types. In this thesis, I have investigated the roles played by two kinases downstream of PI3K, protein kinase B (PKB) and p90 ribosomal S6 kinase (RSK1), in regulation of p27 function. I observed that PKB-mediated phosphorylation of p27 promotes p27-cyclin D1-Cdk4 assembly. p27 phosphorylation by RSK1 alters the interaction of p27 with cytoskeleton proteins to promote cell motility. I observed that PKB activation and the appearance of p27pT157 and p27pT198 in early G1 precede p27-cyclin D1-Cdk4 assembly. PI3K/PKB inhibition dissociates cellular p27-cyclin D1-Cdk4 and p27T157A, p27T198A and p27T157A/T198A bind cellular cyclin D1 and Cdk4 poorly. Cellular p27pT157 and p27pT198 co-precipitate with Cdk4 but not Cdk2. p27 phosphorylation by PKB increases the ability of p27 to assemble cyclin D1-Cdk4 in vitro, but yields inactive Cdk4. While Src does not affect p27's ability to assemble cyclin D1-Cdk4, Src treatment yields catalytically active p27-cyclin D1-Cdk4. Thus, while PKB dependent p27 phosphorylation promotes p27-cyclin D1-Cdk4 assembly, tyrosine phosphorylation of p27 is required for activation of p27-cyclin D1-Cdk4 complexes. Constitutive activation of PKB and Abl or Src family kinases in cancers would drive p27 phosphorylation, increase cyclin D1-Cdk4 assembly and activation, and reduce the cyclin E-Cdk2 inhibitory function of p27. Combined therapy with both Src and PI3K/PKB inhibitors may reverse this process. While RSK1 has been shown to phosphorylate p27, the key phosphorylation sites and the consequence of this phosphorylation event were not fully elucidated. I have shown that RSK1 activation in early G1 precedes p27 phosphorylation at T157 and T198 in synchronized cell populations. Overexpression of RSK1 causes resistance to G1 arrest by TGF-â. Moreover, cells overexpressing RSK1 show an increase in p27 phosphorylation at T198, increased p27 stability, and an increase in p27 binding to Cdk4. In addition, RSK1-transfectants have increased cytoplasmic p27, associated with increased cell motility and inhibition of RhoA. p27 phosphorylation by recombinant RSK1 increases p27 binding to RhoA, while p27T157A/T198A shows reduced association with RhoA in cells. Thus, phosphorylation of p27 at T198 by RSK1 promotes its binding to RhoA and loss of actin stress fiber stability. Oncogenic RSK1 activation may promote increased cancer cell migration and cancer metastasis. Taken together our results indicate that oncogenic activation of the PI3K pathway can contribute to loss of cyclin E-Cdk2 inhibitory action of p27 by at least two mechanisms. Activation of PKB and RSK1 signaling would promote cytoplasmic mislocalization of p27, p27-RhoA binding and inhibition of the RhoA pathway to augment cell motility. In addition, these phosphorylation events on p27 would increase the assembly of p27-cyclin D1-Cdk4 as a first step in a chain of events that would promote that nuclear import and activation of D-type cyclin Cdk complexes, shifting the equilibrium away from the Cdk2 inhibitory action of p27.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(人間健康科学) / 甲第23123号 / 人健博第85号 / 新制||人健||6(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科人間健康科学系専攻 / (主査)教授 藤井 康友, 教授 岡 昌吾, 教授 滝田 順子 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human Health Sciences / Kyoto University / DFAM

Adrenocortical carcinomas (ACC) are aggressive tumors associated with a heterogeneous but generally poor prognosis and limited treatment options for advanced stages. Despite promising molecular insights and improved understanding of ACC biology, efficient targeted therapies have not been identified yet. Thus, this study aims to identify potential new drug targets for a future personalized therapeutic approach. RNA was isolated from 104 formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples from ACC patients, 40 of those 104 cases proved to be suitable for further mRNA analyses according to the quality check of the extracted RNA. Gene expression of 84 known cancer drug targets was evaluated by quantitative real-time PCR using 5 normal adrenal glands as reference. Protein expression was investigated for selected candidate drug targets by immunohistochemistry in 104 ACC samples, 11 adenomas and 6 normal adrenal glands. Efficacy of an available inhibitor of the most promising candidate was tested by functional in vitro experiments in two ACC cell lines (NCI-H295R and MUC1) alone or in combination with other drugs. Most frequently overexpressed genes were TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 and PLK1. Nuclear immunostaining of CDK1, CDK4 and PLK1 significantly correlated with the respective mRNA expression. CDK4 was chosen as the most promising candidate for functional validation as it is actionable by FDA-approved CDK4/6 inhibitors. ACC samples with copy number gains at CDK4 locus presented significantly higher CDK4 expression levels. The CDK4/6 inhibitor palbociclib showed a concentration- and time- dependent reduction of cell viability in vitro, which was more pronounced in NCI-H295R than in MUC1 cells. This was in line with higher CDK4 expression at western blot analysis in NCI-H295R cells. Furthermore, palbociclib was applied in combination with dual IGFR/IR inhibitor linsitinib showing a synergistic effect on reducing cell viability. In conclusion, this proof-of-principle study confirmed RNA profiling to be useful to discover potential drug targets. Detected drug targets are suitable to be investigated by immunohistochemistry in the clinical setting. Moreover, CDK4/6 inhibitors are promising candidates for treatment of a subset of patients with tumors presenting CDK4 copy number gains and/or overexpression, while linsitinib might be an interesting combination partner in patients with both IGF2 and IGF1R overexpression. These results are intended as a basis for a validation study in a prospective cohort, further evaluation in vivo in suitable mouse models or testing in patients with ACC in clinical trials are needed and might improve the future management of patients with ACC in terms of precision medicine. / Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind aggressive Tumore, die mit einer heterogenen, aber insgesamt ungünstigen Prognose sowie limitierten therapeutischen Optionen für fortgeschrittene Stadien assoziiert sind. Trotz hoffnungsvoll stimmenden molekularen Einblicken und verbessertem Verständnis für die Biologie des ACC wurden bisher keine effektiven Targeted Therapies (zielgerichtete Therapien) identifiziert. Daher strebt diese Studie die Identifikation potentieller neuer Drug Targets (Arzneimittelzielpunkte) im Rahmen einer zukünftigen personalisierten Therapie an. RNA wurde von 104 formalinfixierten und paraffineingebetteten Tumorproben von ACC Patienten isoliert, 40 der 104 Fälle zeigten sich nach der Qualitätsprüfung der extrahierten RNA geeignet für weiterführende mRNA-Analysen. Genexpression von 84 bekannten Karzinom-Drug Targets wurden durch quantitative Real-Time PCR unter Nutzung von 5 normalen Nebennieren als Referenz evaluiert. Proteinexpression wurde in selektierten Kandidaten-Drug Targets durch Immunhistochemie in 104 ACC-Proben, 11 Adenomen und 6 normalen Nebennieren untersucht. Das Potential eines verfügbaren Inhibitors gegen das vielversprechendste Kandidatengen wurde in funktionalen in vitro Experimenten mit zwei ACC-Zelllinien (NCI-H295R und MUC1) allein und in Kombination mit einem anderen Medikament getestet. Die am häufigsten überexprimierten Gene stellten TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 und PLK1 dar. Die immunhistologische Kernfärbung für CDK1, CDK4 und PLK1 korrelierten signifikant mit der jeweiligen mRNA-Expression. CDK4 wurde als erfolgversprechendster Kandidat für weitere funktionale Validierung ausgewählt, da es durch FDA-genehmigte CDK4/6-Inhibitoren angreifbar ist. ACC-Proben mit Copy Number Gains des CDK4 Genlocus zeigten signifikant höhere CDK4 Expressionslevel. Der CDK4/6-Inhibitor Palbociclib wies eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der Zellviabilität in vitro auf, welche ausgeprägter in NCI-H295R- als in MUC1-Zellen war. Dies war in Einklang mit stärkerer CDK4 Expression in den NCI-H295R-Zellen in der Western Blot Analyse. Weiterhin wurde Palbociclib in Kombination mit dem dualen IGFR/IR-Inhibitor Linsitinib eingesetzt, dies zeigte einen synergistischen Effekt auf die Reduktion der Zellviabilität. Zusammenfassend bestätigte diese Proof-of-Principle den Nutzen von RNA Profiling zur Erfassung potentieller Drug Targets. Die ermittelten Drug Targets sind geeignet für immunhistochemische Untersuchungen im klinischen Setting. Darüber hinaus sind CDK4/6-Inhibitoren vielversprechende Kandidaten für die Behandlung einer Teilgruppe von Patienten mit Tumoren, die CDK4-Copy Number Gains und/oder -Überexpression aufweisen, während Linsitinib ein interessanter Kombinationspartner in Patienten mit sowohl IGF2- wie auch IGF1R-Überexpression darstellen könnte. Diese Resultate sollen als Basis für eine Validationsstudie in einer prospektiven Kohorte dienen, weitere Evaluation in vivo in geeigneten Mausmodellen oder Untersuchung in ACC-Patienten in klinischen Studien sind erforderlich und könnten das zukünftige Management von ACC-Patienten verbessern im Rahmen der Präzisionsmedizin.

La sénescence induite par chimiothérapie permet l’arrêt pérenne de la division des cellules tumorales. Néanmoins, ce mécanisme de suppression tumorale peut être neutralisé par certaines cellules traitées, ce qui se traduit généralement par une rechute des patients. Récemment, nous avons décrit dans des cellules colorectales un mécanisme d’échappement à la sénescence induite par le SN-38 dépendant de la protéine de survie MCL1. Cette étude montre que les cellules sénescentes (PLS) favorisent la prolifération des cellules non-sénescentes (PLD) par l’intermédiaire de signaux mitogéniques activant la kinase Cdk4 et par conséquent la reprise de la division. Nous démontrons que Cdk4 inhibe Rb par phosphorylation de la sérine 780, permettant l’activation des fonctions transcriptionnelles des facteurs E2F sur les gènes du cycle cellulaire. La perte d’activité de Cdk4 par ARN interférence ou par le Palbociclib réduit l’émergence de clones proliférants. La méthyltransférase EZH2 est une cible de E2F exclusivement exprimée par les PLD et son expression dépend de l’activité de Cdk4. Par ailleurs, l’utilisation d’ARN interférence dirigé contre EZH2 ou des inhibiteurs chimiques DNZepA et GSK343 réduit également l’émergence de clones proliférants. Enfin, son inhibition potentialise à la fois l’arrêt de la division et la sénescence en réponse au Palbociclib dans les cellules ayant échappé au SN-38. Ainsi, ces travaux ont permis de mettre en évidence un rôle important de EZH2 en tant qu’effecteur de Cdk4 dans le mécanisme d’échappement au SN-38, une voie susceptible d’apporter des nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement du cancer. / Chemotherapy-induced senescence enables to trigger a durable division arrest of tumor cells. However, this tumor suppressor mechanism is neutralized in some treated cells leading mostly to cancer relapse in patients. Recently, we have described a MCL1-dependent mechanism of escape in SN-38-induced senescence from colorectal cell lines. In this study, we showed that senescent cells (PLS cells) promoted the non senescent cells (PLD cells) proliferation through mitogenic signals stimulating Cdk4 kinase activity and subsequently the cell cycle. We demonstrated that Cdk4 phosphorylated Rb on the serine 780 to inhibit its activity, allowing E2F- family transcriptional functions activation on cell cycle targets. Loss of Cdk4 expression or activity induced by RNA interference or Palbociclib reduced the emergence of proliferating clones. TheEZH2-methyltransferase, a E2F transcriptional target, is only expressed by PLD cells and this expression depends on Cdk4 activity. Moreover, loss of EZH2 expression or activity, by RNA interference or by DZNepA and GSK343 inhibitors, reduced the emergence of proliferating cells. Finally, EZH2 inhibition promotes both cell division arrest and senescence in response to Palbociclibin the SN-38-escaped cells. To conclude, this study enabled to highlight a major role of EZH2 as effector of Cdk4 in the escape mechanism induced by SN-38 a signaling pathway offering newtargeted cancer therapies.