Krebserkrankungen stellen in Deutschland die zweithäufigste Todesursache dar und die Anzahl der Neuerkrankungen nimmt stetig zu. Frühzeitige Diagnosen und Therapiemöglichkeiten sind daher dringend erforderlich. Cyklinabhängige Proteinkinasen (Cdk) spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus. Viele Tumore zeigen eine deregulierte Cdk4‑Aktivität und/oder ‑Expression. Insgesamt zeigen ca. 80% aller Tumore eine Fehlregulation der für den Zellzyklus zentralen Cdk4/CykD1/INK4/pRb/E2F Signalkaskade. Somit besitzen Cdks ein enormes therapeutisches Potential im Kampf gegen Krebs. Die spezifische Inhibierung der Cdks verhindert die Zellproliferation und damit das Tumorwachstum. In den letzten Jahren wurden verschiedenste Strukturklassen vorgestellt, die als Cdk4-Inhibitor wirken. Im Rahmen der Promotion sollen die Möglichkeiten einer funktionellen Tumordiagnose mittels cyklinabhängiger Kinasen untersucht werden. Die Entwicklung von radioaktiv markierten Inhibitoren der Cdk4/6 als Radiotracer und ihre radiopharmakologische Charakterisierung stellt dabei einen neuen Ansatz dar. Um die Rolle der Cdk4/6 im Zellzyklus von gesunden und deregulierten (z.B. Tumor-) Zellen aufzuklären, sollten mit Iod-124 und Fluor-18 markierte Inhibitoren eingesetzt werden, die hochselektiv diese Cdks blockieren. Zunächst wurden verschiedene Inhibitoren der Cdk4/6 und deren Vorstufen für die Radiomarkierung dargestellt. Die bereits aus den Vorarbeiten von VanderWel et al., 2005 und Toogood et al., 2001 bekannten Syntheserouten mussten dazu optimiert werden und für neue Verbindungen, wie die fluorethylierten Substanzen, wurden neue Reaktionswege gefunden. Die dargestellten Referenzverbindungen CKIA-E wurden anschließend mittels Durchflusszytometrie an den Zelllinien HT-29 und FaDu auf ihre inhibitorischen Wirkung untersucht. Die Untersuchungen der Verbindungen CKIA/B/E zeigte, dass ein Zellzyklusarrest unter Einwirkung der Inhibitoren erreichbar ist. Die weiteren Untersuchungen zur Radiomarkierbarkeit sowie die radiopharmakologische Evaluation sollten daher an den Verbindungen CKIA, CKIB und CKIE stattfinden. Die Darstellung der Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB erfolgte in zwei Schritten über die elektrophile Substitution durch regioselektive Destannylierung mit anschließender Entschützung der Seitenkette. Die Darstellung der fluorethylierten Verbindung erfolgte ebenfalls über eine Zweischrittsynthese beginnend mit der Synthese der prosthetischen Gruppe [18F]BFE aus der Tosylmarkierungsvorstufe. Die zur Markierung des sekundären Amins zur Auswahl stehenden prosthetischen Gruppen [18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [18F]Bromfluorethan ([18F]BFE) wurden auf ihre Eignung untersucht, ebenso wie die Auswahl einer geeigneten Markierungsvorstufe für die Darstellung der prosthetischen Gruppe. Die optimierten Syntheserouten ermöglichten die Isolierung von ausreichenden Mengen an Produktaktivität für die radiopharmakologischen Untersuchungen. Es fanden, neben der Bestimmung der spezifischen Aktivität und der Lipophilie der Verbindungen, Zellaufnahmeuntersuchungen und Bestimmungen zur Stabilität der Verbindungen in vitro, ex vivo und in vivo statt. Die radioiodierten Verbindungen konnten des Weiteren zur Untersuchungen der Bioverteilung in normalen männlichen Wistar-Ratten eingesetzt werden. Für alle drei Verbindungen konnte eine sehr hohe in vitro-Stabilität festgestellt werden. Die Zellaufnahmeuntersuchungen zeigten vor allem für die Verbindungen [124I]CKIA und [124I]CKIB eine beträchtliche Zellaufnahme von über 1000% ID/mg Protein nach 2 h. Die Zellaufnahme der Verbindung CKIE ist geringer, sollte allerdings für eine in vivo-Anwendung ausreichend sein. Die Untersuchung der in vivo‑Stabilität der Verbindungen [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE im Blut von Wistar Ratten ergab allerdings, dass alle Verbindungen schnell metabolisiert werden. Die Untersuchung der Bioverteilung der radioiodierten Verbindungen belegen eine in vivo Radiodeiodierung sowie eine hohe hepatobliliäre Auscheidungsrate. Im Hinblick auf eine Anwendung als Radiotracer konnten im Rahmen dieser Arbeit neue Erkenntnisse gewonnen werden. Die dargestellten Inhibitoren sind in der Lage am Zellmodell den Zellzyklusarrest in der G1-Phase zu induzieren. Eine Radiomarkierung der ausgewählten Strukturen liefert das Produkt mit reproduzierbarer Ausbeute in hoher radiochemischer Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität, allerdings ist eine Herstellung der fluorethylierten Verbindung unter GMP-Bedingungen nur schwer realisierbar. Die radiomarkierten Verbindungen zeigen eine hohe in vitro-Stabilität und werden energieabhängig in die Zelle aufgenommen. Anhand der Stabilitätsuntersuchungen in vivo wurde gezeigt, dass alle drei Verbindungen in vivo instabil sind und sehr schnell hepatobiliär eliminiert.

Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) wurden als essentielle Enzyme für die Regulation des Zellzyklus mit kritischem Beitrag zur gestörten Zellproliferation während der Kanzerogenese identifiziert. Als Konsequenz davon erwiesen sich die Cdk4/6 als attraktive Zielproteine für die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte zur pharmakologischen Tumorbehandlung. Verbindungen aus der Substanzklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine zeigten vielversprechende inhibitorische Wirkungen auf die Aktivität der Cdk4/6 bei gleichzeitiger herausragender Selektivität gegenüber anderen Cdk. Anschließende Untersuchungen in vitro und in vivo verdeutlichten das Potential einiger Pyrido[2,3 d]pyrimidine zur Inhibierung des Tumorzellwachstums. Die Weiterentwicklung und Nutzung selektiver Cdk4/6-Inhibitoren zur funktionellen Charakterisierung der Cdk4/6 in Tumoren in vivo mit Hilfe der nicht-invasiven Bildgebungstechnik Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist ein neuer vielversprechender Forschungsansatz und von großem Interesse für die Evaluierung neuer Strategien zur Diagnose und Therapie maligner Erkrankungen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung neuer potentieller Cdk4/6-Inhibitoren aus der Verbindungsklasse der Pyrido[2,3-d]pyrimidine und deren Bewertung hinsichtlich ihrer therapeutischen Wirksamkeit zur gezielten Cdk4/6-Inhibierung in ausgewählten Tumorzelllinien sowie ihres Potentials zur funktionellen Bildgebung der Cdk4/6 in Tumoren mittels PET am Tiermodell. Die biochemische Charakterisierung der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB, CKIC, CKID und CKIE hinsichtlich ihrer zellulären und molekularen Wirkung erfolgte in den kontinuierlich proliferierenden humanen Tumorzelllinien HT-29, FaDu und THP 1 und in differenzierten THP-1-Makrophagen. Die Zweckmäßigkeit der untersuchten Zelllinien zur Charakterisierung potentieller Cdk4/6-Inhibitoren wurde anhand von Studien zur mRNA-Expression und Proteinbiosynthese der Kinasen Cdk4/6 nachgewiesen. Des Weiteren wurde das Vorkommen der Cdk4/6 in den humanen Xenograft-Tumoren HT-29 und FaDu, sowie in ausgewählten Organen und Geweben von nu/nu-NMRI-Mäusen charakterisiert. In vitro wurden für alle untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine signifikante, konzentrations- und zeitabhängige inhibitorische Effekte auf die Tumorzellproliferation beobachtet. Durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen 24 Stunden nach Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen zeigten eine konzentrationsabhängige Zunahme des Anteils der HT-29-, FaDu- und THP-1-Zellen in der G1-Phase bis auf 90%. Für die nicht-proliferierenden THP 1-Makrophagen wurden bei Inkubation mit den Pyrido[2,3 d]pyrimidinen geringe Veränderungen ihrer Zellzahl und Zellzyklusphasen-verteilung detektiert. Die zellulären Studien identifizierten deutliche qualitative und quantitative Unterschiede der untersuchten Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Nanomolare Konzentrationen von CKIA, CKIB bzw. CKIE erzielten bereits 24 Stunden nach Inkubation deutliche Effekte, während für CKIC und CKID die 10- bis 100-fache Konzentration eingesetzt werden musste, um eine ähnliche Wirkung zu erhalten. Die molekularen Ursachen der Wachstumshemmung und des Zellzyklusarrests wurden durch Untersuchungen zur Pyrido[2,3 d]pyrimidin-abhängigen Beeinflussung des Cdk4/6-Cyclin D-Retinoblastom-E2F-Signalwegs geklärt. In allen Zelllinien wurde eine deutliche Inhibierung der Cdk4/6-spezifischen Phosphorylierung der Aminosäure Serin-780 des Retinoblastom-Proteins (pRb) beobachtet. Als Konsequenz dieser Inhibierung wurde für CKIA, CKIB und CKIE die signifikante konzentrationsabhängige Unterbrechung der Genexpression von E2F-1 und PCNA nachgewiesen. Die Radiomarkierung der Cdk4/6-Inhibitoren CKIA und CKIB mit 124I bzw. von CKIE mit 18F ermöglichte erstmals die Charakterisierung von in vivo-Interaktionen und des Metabolismus im Blut zirkulierender Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate. Die radiopharmako-logischen Eigenschaften von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE wurden in Untersuchungen zur zellulären Radiotracer-Aufnahme, der metabolischen Stabilität und der Bioverteilung bei Ratten sowie abschließend in Kleintier-PET-Untersuchungen bei FaDu-Tumor-tragenden nu/nu-NMRI-Mäusen analysiert. In vitro-Experimente mit [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE verdeutlichten eine hohe Stabilität und schnelle Aufnahme der Radiotracer in humane Tumorzellen bei 37°C. Allerdings deutet die Zelltyp-unabhängige Anreicherung auf eine geringe Abhängigkeit der Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Akkumulation vom Cdk4/6-Status der Zellen hin. Die signifikant geringeren Aufnahmewerte aller untersuchten Pyrido[2,3-d]pyrimidine bei 4°C und die Blockierung der Aufnahme von [18F]CKIE mit nichtradioaktivem CKIE unterstützen die Vermutung spezifischer Transportmechanismen für die Aufnahme der Pyrido[2,3 d]pyrimidine. Untersuchungen von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE in vivo identifizierten eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende Eliminierung aus dem Blut und die primäre Aufnahme in die Leber als grundlegende Stoffwechseleigenschaft aller drei Radiotracer. Aus den PET-Untersuchungen mit [124I]CKIA und [124I]CKIB bei FaDu-Tumor-tragenden Mäusen wurden nur marginale Anreicherungen der radioaktiven Substanzen im Bereich des Tumors festgestellt. Für [18F]CKIE wurde eine Akkumulation im proliferierenden Randbereich des Tumors beobachtet. Die schnelle Metabolisierung von [18F]CKIE im Blut sowie das konstante, geringe Verhältnis der Aktivität im Tumor zur Aktivität im Skelettmuskel wiesen allerdings auf eine unspezifische Anreicherung hin. Schlussfolgernd aus den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit wurde die Effektivität der Pyrido[2,3 d]pyrimidine CKIA, CKIB und CKIE hinsichtlich der Inhibierung der Cdk4/6-vermittelten Zellzyklusprogression gezeigt. Die antiproliferative Aktivität der Substanzen unterstützt eine weiterführende Evaluierung dieser Cdk4/6-Inhibitoren zur pharmakologischen Tumortherapie. Auf der Basis der erhaltenen radiopharmakologischen Ergebnisse werden die kurze biologische Halbwertszeit und unspezifische Tumoranreicherung von [124I]CKIA, [124I]CKIB und [18F]CKIE als limitierende Faktoren für die Eignung dieser Verbindungen als Radiotracer zur nicht-invasiven Bildgebung der Cdk4/6 im Zielgewebe mittels PET angesehen. Es bleibt zu klären, ob eine längere Verweildauer und höhere Stabilität radiomarkierter Pyrido[2,3-d]pyrimidine im Blut die Chance der Cdk4/6-spezifischen Gewebeanreicherung erhöhen oder Transport-mechanistische Effekte allein ausschlaggebend für die Anreicherung in Zellen und Geweben sind. Die Untersuchung optimierter Cdk4/6-selektiver Inhibitoren für die Charakterisierung und Therapie von Tumoren bleibt weiterhin ein interessanter Aspekt in der Tumorforschung.:1 EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT 1 1.1 Der Zellzyklus 1 1.2 Die Cyclin-abhängigen Kinasen 4 und 6 (Cdk4/6) 4 1.2.1 Entdeckung und Struktur der Cdk4/6 4 1.2.2 Funktion und Regulation der Cdk4/6 im Zellzyklus 5 1.2.3 Cdk4/6 und Embryogenese 8 1.2.4 Cdk4/6 und Homöostase 9 1.2.5 Cdk4/6 und Kanzerogenese 10 1.3 Die Cdk4/6 als Zielproteine für die Tumortherapie 11 1.4 Die Tumordiagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie 16 1.5 Zielstellung 19 2 MATERIAL UND METHODEN 20 2.1 Materialien 20 2.1.1 Geräte 20 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 21 2.1.3 Chemikalien, Medien und Enzyme 21 2.1.4 Antikörper und Immunchemikalien 25 2.1.5 Primer 25 2.1.6 Puffer und Lösungen 26 2.1.7 Biologisches Material 28 2.2 Zellbiologische Methoden 29 2.2.1 Rekultivierung und Kryokonservierung von Zellen 29 2.2.2 Kultivierung der Zelllinien 29 2.2.3 Arretierung von Zellen in der Zellzyklusphase G1 30 2.2.4 Bestimmung der Zellzahl 30 2.2.5 Untersuchung der Zellvitalität 30 2.2.6 Untersuchung des Wachstumsverhaltens 31 2.2.7 Durchflusszytometrische Zellzyklusanalyse 31 2.2.8 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen 32 2.3 Proteinbiochemische Methoden 32 2.3.1 Proteinextraktion 32 2.3.2 Trennung von Proteinen durch SDS-PAGE 33 2.3.3 Elektrotransfer der Proteine auf eine Membran 33 2.3.4 Immunchemischer Antigennachweis 34 2.4 Molekularbiologische Methoden 35 2.4.1 RNA Präparation 35 2.4.2 DNase-Behandlung der isolierten RNA 35 2.4.3 Reverse Transkription und Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) 35 2.4.4 Quantitative Echtzeit-RT-PCR 36 2.5 Histologische Methoden 38 2.5.1 Fixierung und Paraffineinbettung von Geweben 38 2.5.2 Immunfärbung der Paraffinschnitte 38 2.5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung der Paraffinschnitte 39 2.6 Radiopharmakologische Methoden 39 2.6.1 Radiomarkierung der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 39 2.6.2 Stabilitätsuntersuchungen 42 2.6.3 Zelluläre Radiotracer-Aufnahme 43 2.6.4 Bioverteilung 44 2.6.5 Positronen-Emissions-Tomographie 44 2.6.6 Autoradiographie 45 2.7 Statistische Methoden 45 3 ERGEBNISSE 47 3.1 Untersuchungen zum Vorkommen der Cdk4/6 in Zellen und Geweben 47 3.1.1 Vorkommen der Cdk4/6 in Zellen 47 3.1.2 Vorkommen der Cdk4/6 in Tumoren 52 3.1.3 Vorkommen der Cdk4/6 in Organen der Maus 54 3.2 Zelluläre und molekulare Effekte der Pyrido[2,3-d]pyrimidin-Derivate 57 3.2.1 Vitalität und Zellproliferation 57 3.2.2 Zellzyklusphasenverteilung 62 3.2.3 pRb-Phosphorylierung 67 3.2.4 mRNA-Expression 70 3.3 Radiopharmakologische Charakterisierung ausgewählter 124I- bzw. 18F- markierter Pyrido[2,3 d]pyrimidin-Derivate 72 3.3.1 Radiomarkierung der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 72 3.3.2 Stabilitätsuntersuchungen in vitro 72 3.3.3 Zelluläre Radiotracer-Aufnahme 72 3.3.4 Bioverteilung und in vivo-Stabilität in Ratten 78 3.3.5 PET-Untersuchungen und Autoradiographie 81 4 DISKUSSION 87 4.1 Nachweis und Lokalisierung der Cdk4/6 in Zellen und Geweben 87 4.2 Zelluläre und molekulare Wirksamkeit der Pyrido[2,3-d]pyrimidine 89 4.2.1 Hemmung der Zellproliferation 90 4.2.2 Hemmung der G1-Phasen-Progression 91 4.2.3 Hemmung des Cdk4/6-Cyclin D-pRb-E2F-Signalwegs 93 4.3 124I- und 18F-markierte Pyrido[2,3-d]pyrimidine als Radiotracer für die funktionelle Bildgebung der Cdk4/6 96 4.3.1 In vitro-Untersuchungen mit den radiomarkierten Pyrido[2,3-d]pyrimidinen 97 4.3.2 In vivo-Untersuchungen mit den radiomarkierten Pyrido[2,3-d]pyrimidinen 100 4.4 Schlussfolgerung und Ausblick 104 5 ZUSAMMENFASSUNG 106 6 LITERATURVERZEICHNIS 109 7 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE 118 8 DANKSAGUNG 120 9 VERSICHERUNG UND ERKLÄRUNG 121

La sénescence est un processus caractérisé par un arrêt stable du cycle cellulaire. Ce mécanisme peut être induit en réponse à de nombreux stress, comme l’activation d’un oncogène, le raccourcissement des télomères ou bien le traitement avec des composés génotoxiques. Cette réponse cellulaire est considérée comme une barrière antitumorale limitant la prolifération des cellules exposées au risque de transformation. La mise en place de la sénescence dépend de profonds changements au niveau moléculaire, dont l’activation d’un programme de dégradation sélective des protéines. Cette dégradation de protéines associée à la sénescence (SAPD) peut expliquer plusieurs caractéristiques des cellules sénescentes, notamment la présence de défauts dans la voie de synthèse des ribosomes (SARD). Ces derniers sont liés à un stress nucléolaire qui mène à l’accumulation de certaines protéines ribosomiques dans le noyau, où elles peuvent effectuer des fonctions indépendantes de leur rôle structurale dans les ribosomes. Parmi ces protéines ribosomiques, RPS14/uS11 peut s’accumuler dans le nucléoplasme et réguler le cycle cellulaire en inhibant CDK4. Ces mécanismes de régulation post-traductionnelle -le SAPD ainsi que les conséquences des SARD- contribuent de manière importante au phénotype sénescent. Nous avons émis l’hypothèse que la caractérisation des effecteurs dans ces voies pourrait mener à l’identification de nouvelles protéines importantes pour la sénescence et la suppression tumorale. Dans un premier temps, nous avons évalué le rôle de la protéine ribosomique RPL22/eL22 dans le cycle cellulaire et la sénescence. Tout comme RPS14, RPL22 a été identifié dans l’analyse de l’interactome de CDK4 lors de la sénescence induite par la perte du facteur de la ribogenèse RSL1D1. Nous avons pensé que RPL22 pourrait agir de manière similaire à RPS14 et ainsi effectuer des fonctions extra-ribosomiques impliquées dans la régulation du cycle cellulaire. Dans le premier article présenté dans cette thèse, nous montrons que la surexpression de RPL22 dans des fibroblastes humains induit un phénotype sénescent et que RPL22 peut lier et inhiber CDK4 afin d’activer la voie de RB. Ensemble, ces données indiquent un rôle suppressif de RPL22 dans le cycle cellulaire. En second lieu, nous nous sommes penchés sur la caractérisation des effecteurs du programme de dégradation sélective de protéines associé à la sénescence. Ce programme est mené à terme par le système ubiquitine-protéasome, un mécanisme finement régulé par différents types de protéines. Parmi celles-ci, les E3 ubiquitine ligases définissent la spécificité de ce système en interagissant avec les substrats à dégrader. Nous avons donc pensé que certaines E3 ubiquitine ligases spécifiques pourraient être importantes pour le mécanisme de dégradation protéique associé à la sénescence. Afin d’identifier celles-ci, nous avons effectué un criblage de shARN ciblant des gènes d’E3 ubiquitine ligases dans le contexte de la sénescence induite par les oncogènes. Ceci a mené à l’identification d’ASB14 comme un acteur important de la sénescence. Dans le deuxième article de cette thèse, nous montrons que la perte d’ASB14 produit un contournement de la sénescence induite par l’oncogène RAS dans plusieurs modèles cellulaires. ASB14 est une protéine peu caractérisée et nous avons généré des anticorps afin d’analyser son expression. Nous montrons ensuite qu’ASB14 s’exprime fortement dans le pancréas sain, tandis que ses niveaux diminuent dans les tumeurs pancréatiques. Enfin, nous avons identifié les partenaires d’interaction d’ASB14 dans le contexte de la sénescence induite par l’oncogène RAS. Globalement, les travaux présentés dans cette thèse nous ont permis d’identifier deux nouvelles protéines impliquées dans la sénescence cellulaire : la protéine ribosomique RPL22 et l’E3 ubiquitine ligase ASB14. Ces deux protéines contribuent à la régulation post-traductionnelle du phénotype sénescent. D’un côté, RPL22 peut inhiber l’activité de CDK4 afin d’activer la voie de RB et ainsi réguler le cycle cellulaire. D’une autre part, ASB14 est importante pour le maintien du phénotype sénescent et semble avoir un rôle dans la suppression tumorale du pancréas. Nos résultats suggèrent que RPL22 et ASB14 sont importants pour la sénescence et la suppression tumorale. / Cellular senescence is characterized by a stable cell cycle arrest. This process can be induced by a variety of cellular stresses, including oncogene activation, telomere shortening and genotoxic treatments. In fact, senescence is considered an antitumor barrier that prevents cellular transformation. Senescence is associated with widespread molecular changes, including the activation of a selective protein degradation program. This senescence-associated protein degradation (SAPD) could regulate some senescence-associated phenotypes, including the senescence-associated ribosome biogenesis defects (SARD). Senescence-associated ribosome biogenesis defects are linked to a nuclear accumulation of some ribosomal proteins such as RPS14/uS11 capable of carrying out extra-ribosomal functions. In particular, RPS14 can inhibit CDK4 and mediate senescence. Thus, we hypothesize that the proteins implicated in these pathways -SAPD and SARD- could be important for senescence and tumor suppression. First, we evaluated the ability of the ribosomal protein L22 (RPL22/eL22) to regulate cellular senescence and cell cycle progression. RPL22, as RPS14, was identified as a binding partner for CDK4 in senescent cells induced by depleting the ribosome biogenesis factor RSL1D1. Hence, we though that RPL22 could act in a manner similar to RPS14. In chapter two, we show that RPL22 overexpression induces a senescent phenotype in human fibroblasts. In addition, we show that RPL22 can interact with CDK4 inhibiting its activity and stimulating the RB tumor suppressor pathway. Taken together, these results indicate a suppressive role of RPL22 in cell cycle progression. Next, we focused on the characterization of SAPD effectors. This mechanism is mediated by the ubiquitin-proteasome system which is tightly regulated by E3 ubiquitin ligases. Thus, we thought that specific E3 ubiquitin ligases could be important for SAPD and for senescence. In order to discover E3 ubiquitin ligases that contribute to senescence, we performed an unbiased screening using shRNA libraries in Ras-induced senescent cells. This led to the identification of ASB14 as an important mediator of senescence. In chapter three, we show that ASB14 depletion leads to a bypass of Ras-induced senescence. ASB14 is a poorly characterized E3 ligase, and we generated antibodies in order to analyze its expression levels. We show that ASB14 is highly expressed in the normal pancreas whereas its expression is reduced in pancreatic cancer tissues. Finally, we uncovered the interactome of ASB14 in Ras-induced senescent cells. Overall, we have discovered two new senescence mediators: ribosomal protein L22 and E3 ubiquitin ligase ASB14. These proteins are implicated in the post-translational regulation of the senescent phenotype. RPL22 acts as a CDK4 inhibitor to activate RB pathway and regulate cell cycle arrest and ASB14 is an important mediator of senescence maintenance. Taken together, our results suggest that RPL22 and ASB14 are important for cellular senescence and tumor suppression.

NRH quinone oxidoreductase 2 (NQO2) is regarded as a mammalian Phase I detoxifying enzyme responsible for reducing quinones to hydroquinones. NQO2 is highly expressed in different types of cancer such as breast and prostate cancer suggesting its participatory role in the progression of these diseases. A potential reason for this is that NQO2 has the ability to modulate the stability of cyclin D1 and activity of NF-ÃŽÂoB and it has been shown that inhibition of NQO2, either genetically or pharmacologically, can alter the pattern of proliferation of cancer cells. However, the biological roles of NQO2 in cancer progression are still ambiguous and need further investigation. A panel of seven ovarian cancer cell lines (OVCs) were screened for the presence and functionality of NQO2. SKOV-3 and TOV-112D cells expressing comparatively the highest and lowest levels of NQO2 were stably transduced to silence and overexpress NQO2 respectively. Pharmacological inhibition was achieved using resveratrol or a series of novel 4-aminoquinolines synthesised in-house. Cell proliferation was monitored by cell counting and clonogenic assays. Flow cytometric analysis was used to determine cell cycle distribution and levels of ROS following modulation of NQO2 function. The expression of cell cycle regulatory markers was determined by Western blot. The contributory roles of NQO2 in determining the cytotoxicity of Adriamycin (ADR) towards OVCs was investigated using MTT assay together with evaluation of P-gp expression and basal ROS levels. In the OVCs panel, NQO2 protein levels and enzymatic activity showed an excellent correlation; with activity varying 36-fold between the cell lines. The sensitivity of OVCs to CB1954 was significantly increased when combined with the NRH-like co-factor, EP0152R. This supports the notion that NQO2 mediates the toxicity of CB1954, which is further confirmed by the strong correlation between cellular NQO2 activity and the responsiveness of the OVC cell lines to CB1954. Hydrazone quinolines showed the highest inhibitiory potency against NQO2 in SKOV-3 when compared to the typical and in-house synthesised quinolines inhibitors. NQO2-overexpressing TOV-112D cells showed more aggressive growth pattern and higher capacity to form colonies than wild-type cells. This was consistently associated with an enhancement in the progression of cells through cell cycle phases and significant reduction in Rb expression. A reduction in ROS levels in NQO2-OE cells may also explain this enhancement in cell growth. Overexpressing NQO2 also resulted in destabilisation of CDK4 and cyclin D1 with significant reduction in their expression levels, and concomitant increase in p-cyclin D1 (Thr286). The involvement of NQO2 in controlling cyclin D1 turnover is also confirmed in SKOV-3 cells when genetic silencing of NQO2 was accompanied by significant reduction in p-cyclin D1 and subsequent stabilisation of cyclin D1 levels. In spite of this, no alterations in the growth pattern of SKOV-3 cells were observed highlighting the impact of cell type on the variations in cellular responses. The role of NQO2 in determining the toxicity of ADR treatment was not proved in OVC cells. This was despite that modulation of NQO2 levels caused significant changes in P-gp expression. The intracellular basal levels of ROS was found to affect the responsiveness of OVCs to ADR as demonstrated when treating SKOV-3 with resveratrol was accompanied by significant increase in ROS levels and concomitant enhancement in the cells’ response to ADR. In conclusion, NQO2 can profoundly alter the proliferation characteristics of OVCs and is a potential therapeutic target for the treatment of this disease. However, the biological functions of NQO2 and its contributory roles in particular pathways are varied among different types of cancer -in other words- are highly dependent on cancer type.

Les tumeurs sont, au moins en partie, des maladies de la régulation du cycle cellulaire. Le point de restriction (R) est un point fondamental du cycle cellulaire où les cascades de signalisation mitogéniques (y compris leurs perversions oncogènes) et l'état métabolique des cellules sont intégrés pour engager le cycle de division cellulaire. Les CDK4 et CDK6 sont les premières CDKs à être activées en réponse aux signaux de prolifération cellulaire.En initiant la phosphorylation inactivatrice de l'oncosuppresseur central pRb, les CDK4 / 6 liées aux cyclines D jouent un rôle essentiel dans le passage du point R et donc dans la décision de multiplication cellulaire, en particulier dans la plupart des cellules cancéreuses dans lesquelles l'activité de CDK4 est fortement dérégulée. Les médicaments inhibiteurs de CDK4 / 6 sont maintenant évalués dans la plupart des cancers dans de nombreux essais cliniques. Le plus avancé (Palbociclib-PD0332991) a été approuvé en 2015 par la FDA pour le traitement des cancers métastatiques du sein. Notre groupe a identifié la phosphorylation activatrice sur la Thr172 comme l'étape hautement régulée qui détermine l'activation de CDK4. La question de savoir si les phosphorylations de CDK4 et de CDK6 sont catalysées par la seule « CDK-activating kinase » (CAK, cycline H-CDK4-Mat1) reste incertaine. En utilisant des cellules de cancer colorectal (HCT116) exprimant une version de CDK7 spécifiquement inhibable (dite « analog sensitive »), nous avons participé à une étude qui démontre, d’une part, une implication cruciale de la CDK7 dans la phosphorylation / activation de CDK4 et CDK6 et, d’autre part, l'existence de kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 différente(s) de la CDK7. De plus, cette étude a démontré que l'activité de la CDK7 était conditionnée, au moins en partie, par la liaison de p21 à la CDK4, laquelle augmentait en réponse à l'inhibition de CDK7. L’augmentation de cette liaison coïncidait avec la disparition de la phosphorylation la plus abondante de p21, que nous avons localisée (par des analyses d'électrophorèse bidimensionnelle) sur la Ser130 et que nous avons montré être catalysée par la CDK4 et la CDK2. De manière surprenante, la phosphorylation sur Ser130 de p21 était inhibée non seulement par l'inhibition de CDK7, mais également par la Roscovitine et le CR8 (inhibiteurs de CDK2) et le Palbociclib. Ensemble, ces observations suggèraient que l'inactivation de pRb et le passage de R sont contrôlés par des mécanismes de rétroaction positive dépendants de la CDK7 médiés par la phosphorylation de la p21 par la CDK4 et la CDK2 pour faciliter et maintenir l'activation de la CDK4. De plus, nos résultats confirmaient l’hypothèse de l'existence kinase(s) activatrice(s) de la CDK4 autre(s) que la CDK7. Notre groupe avait démontré précédemment que la régulation de la phosphorylation de la CDK4 ne s'applique pas à son homologue CDK6, ce qui s'expliquait par l'absence d'une proline critique dans le domaine phosphoaccepteur (QMALTPVVVT dans CDK4 vs QMALTSVVVT dans CDK6). Ces données iniquaient que la ou les kinase (s) responsable(s) de la phosphorylation sur Thr172 de CDK4 devrai(en)t être dirigée(s) par la proline 173 uniquement présente dans la CDK4 (« proline-directed kinase(s) »).L'objectif principal de cette thèse est l'identification de kinase(s) impliquée(s) dans cette phosphorylation. Nous avons donc sélectionné une liste restreinte de « proline-directed kinases » (PDK) requises pour la prolifération cellulaire. Parmi celles-ci, les JNK, qui sont des PDKs, sont des interacteurs de p21 et CDK4 et peuvent avoir un rôle oncogène. De manière importante, nous avons observé que les JNKs, mais pas la CAK / CDK7, phosphorylaient in vitro la p21 et la CDK4 liée aux cyclines D. Les JNKs phosphorylaient également p21 sur ses trois sites P-T/S (Thr57, Ser130, Ser98). En mutant ces sites (T57A, S130A, S98A, T57A / S130A), nous avons montré que la phosphorylation de p21 par les JNKs n'est pas nécessaire pour la phosphorylation et l'activation de la CDK4 liée à p21. Par conséquent, in vitro les JNKs peuvent activer les complexes CDK4 liés à la p21, en agissant d’une part comme des kinases phosphorylant directement la CDK4 dans les complexes de cycline D-CDK4 stabilisés par la liaison de p21 et d’autre part en phosphorylant indépendamment des résidus de p21 impliqués dans l'activation de CDK4 dépendante de la CAK. Pour démontrer la relevance in vivo du rôle des JNKs comme kinases activatrices de la CDK4, nous avons analysé l'effet de leur inhibition dans les lignées de cellules tumorales T98G et MCF-7, les cellules MEF et des cellules CHO transfectées: dans tous ces cas, l'inhibition des JNKs, y compris l'inhibition spécifique de l'activité de JNK2 par une approche de génétique chimique en collaboration avec le groupe de Roger Davis, a réduit l'entrée du cycle cellulaire, et la phosphorylation et l'activation des complexes de cycline D1-CDK4. De manière intéressante, l’activation des complexes de cycline D3-CDK4 n’était pas affectée par l’inhibition des JNKs, apparemment parce que ces complexes étaient principalement associés à la p27 plutôt qu’à la p21. Mis ensemble, ces différents résultats nous amènent à proposer un nouveau modèle dans lequel différentes kinases activatrices de la CDK4, y compris les JNKs (indépendamment des phosphorylations de p21) et la CAK/CDK7 (de manière dépendante des phosphorylations de p21), coopèrent pour initier et maintenir l'activation de la CDK4 et générer la décision du cycle cellulaire. Cette nouvelle compréhension pourrait révéler de nouveaux mécanismes ciblables dans une perspective thérapeutique anti-cancéreuse. / Tumors are, at least in part, diseases of cell cycle regulation. The restriction (R) point is a fundamental point of the cell cycle in which mitogenic signaling cascades (including their oncogenic perversions) and cell metabolic status are integrated to commit the cell division cycle. CDK4 and CDK6 are the first CDKs to be activated in response to cell proliferation signals. By initiating the inactivating phosphorylation of the central oncosuppressor pRb, cyclin D-bound CDK4/6 play an essential role at the passage through R and thus in the cell multiplication decision, especially in most cancer cells in which CDK4 activity is highly deregulated. CDK4/6 inhibitory drugs are now evaluated in many clinical trials against most cancers, and the most advanced (Palbociclib-PD0332991) was approved in 2015 by FDA for treatment of metastatic breast cancers. Our group has identified the activating Thr172 phosphorylation as the highly regulated step that determines CDK4 activation. Whether CDK4 and CDK6 phosphorylations are catalyzed by the sole CAK (cyclin H-CDK7-Mat1) remains unclear. In analogue-sensitive CDK7 (as/as) mutant HCT116 cells in which CDK7 can be specifically inhibited, we participated to a study demonstrating a crucial CDK7 involvement in phosphorylation/activation of CDK4 and CDK6 and existence of non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Moreover, this study demonstrated that CDK7 activity was conditioned, at least in part, by p21 binding to CDK4, which increased in response to CDK7 inhibition. This coincided with disappearance of the most abundant phosphorylation of p21, which was localized (by 2D-gel electrophoresis analyses) at Ser130 and found to be catalyzed by both CDK4 and CDK2. Surprisingly, Ser130 p21 phosphorylation was not inhibited only by CDK7 inhibition, but also by Roscovitine and CR8 (CDK2 inhibitors) and Palbociclib. All together, these observations suggested that pRb inactivation and R passage are controlled by CDK7-dependent positive feedbacks mediated by p21 phosphorylation by CDK4 and CDK2 to sustain CDK4 activation. Importantly, these results confirm the hypothesis of a non-CDK7 CDK4 activating kinase(s). Our group has previously demonstrated that the regulation of CDK4 phosphorylation does not apply to its homologue CDK6, which was explained by the lack of a critical proline in the phospho-acceptor domain (QMALTPVVVT in CDK4 vs QMALTSVVVT in CDK6). These data have indicated that the activity of kinase(s) responsible for Thr172 phosphorylation of CDK4 should be directed by the unique proline 173 of CDK4 (proline-directed kinase(s)). The primary objective of this thesis is the identification of kinase(s) involved in this phosphorylation. We thus selected a shortlist of proline-directed kinases (PDKs) required for cell proliferation. Among them JNKs, which are PDKs, are interactors of p21 and CDK4 and can have an oncogenic role. Importantly, we observed that JNKs, but not CAK/CDK7, did phosphorylate CDK4 in vitro in their complexes with cyclins D stabilized by p21 binding. JNKs also phosphorylated p21 in the three P-T/S phosphorylation sites (Thr57, Ser130, Ser98). Mutating p21 phosphorylation sites (T57A,S130A,S98A,T57A/S130A) we also demonstrated that in vitro, the phosphorylation of p21 by JNKs is not required for the phosphorylation and activation of p21-bound CDK4. Therefore, in vitro JNKs might activate p21-bound CDK4 complexes by acting as a direct CDK4-activating kinases for cyclin D-CDK4 complexes stabilized by p21 binding and also by independently phosphorylating p21 residues involved in CAK-dependent activation of CDK4. To demonstrate the relevance of the role of JNKs as possible CDK4-activating kinases in vivo we analyzed the effect of their inhibition in T98G and MCF-7 tumor cell lines, MEFs and transfected CHO cells: in all these cases, inhibition of JNKs, including specific inhibition of JNK2 activity by a chemical genetic approach in collaboration with Roger Davis group, reduced the cell cycle entry and phosphorylation and activation of cyclin D1-CDK4 complexes. Interestingly, the activation of cyclin D3-CDK4 complexes was not affected by the JNK inhibition, apparently because these complexes were mainly associated with p27 instead of p21. Putting together all these results, we propose a new model in which different CDK4-activating kinases, including JNKs (independently of p21 phosphorylation) and CAK/CDK7 (dependently on p21 phosphorylation), cooperate to initiate and maintain the activation of CDK4 and generate the cell cycle decision. This new understanding may reveal new druggable mechanisms and anti-cancer therapeutic targets. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Abstract Breast cancer is the most common cancer affecting the female population of the Western world. It is a heterogeneous disease entity that encompasses tumors with remarkably different forms of behaviour, and it is therefore vital to distinguish patients with good and poor prognoses. The classical prognostic and predictive factors for breast cancer serve as tools for clinical oncologists when planning treatment, but the growing awareness of breast cancer biology is bringing about a need for novel prognostic and predictive biomarkers. This thesis examines the prognostic significance of hypoxia response and cell cycle regulators in ductal breast cancer and in triple-negative breast cancer (negative for hormone receptors and human epidermal growth factor receptor 2), concluding that PHD2 and PHD3 are associated with a good prognosis, while the role of PHD1 is controversial, as it is associated with proliferation in ductal breast cancer but with node-negative status in triple-negative breast cancer. In our experiments HIF-1α redeemed its role as a marker of an adverse prognosis, whereas the role of HIF-2α appeared to be the opposite. Our data suggest that PHDs can have other targets than the HIF-αs, and that triple-negative breast tumors express more HIF-1α and less HIF-2α and PHD3 than those with a good prognosis. Furthermore, we identified cyclin D1 as a biomarker with independent prognostic significance in ductal breast cancer, being associated with good prognostic factors and a better outcome, whereas the opposite was seen in triple-negative breast cancer. CDK4 was associated with high proliferation in triple-negative breast cancer. In addition, high levels of p16 correlated with increased survival in breast cancer patients independently of receptor status. / Tiivistelmä Rintasyöpä on naisten yleisin syöpä läntisessä maailmassa. Rintasyöpä on heterogeeninen tautiryhmä, jossa kasvaimet vaihtelevat biologiselta käyttäytymiseltään huomattavasti. Tästä syystä on tärkeää erottaa hyvä- ja huonoennusteiset potilaat. Syöpälääkärit käyttävät klassisia ennustetekijöitä hoitopäätöksiä tehdessään, mutta lisääntynyt tieto rintasyövän biologiasta on saanut aikaan tarpeen löytää uusia ennustetekijöitä. Tässä väitöskirjatyössä tutkimme hypoksiavasteen ja solusyklin säätelijöiden ennusteellisuutta duktaalisessa rintasyövässä sekä kolmoisnegatiivisessa (ei ilmennä hormonireseptoreita eikä epidermaalikasvutekijäreseptoria) rintasyövässä. PHD2 ja PHD3:n vahva ilmentyminen liittyi parempaan ennusteeseen, mutta PHD1:n esiintymisen vaikutus oli ristiriitainen. PHD1:n ilmentyminen liittyi lisääntyneeseen solujakautumiseen duktaalisessa rintasyövässä, mutta kolmoisnegatiivisessa rintasyövässä sen esiintyminen liittyi vähentyneeseen imusolmukemetastasointiin. Tutkimuksessamme HIF-1α osoittautui huonon ennusteen merkiksi. Sitä vastoin HIF-2α:n ilmentymisen vaikutus näytti liittyvän parempaan ennusteeseen. Tuloksemme osoittavat, että PHD-entsyymeillä on mahdollisesti muitakin kohteita kuin HIF-α:t. Osoitimme myös, että HIF-1α:n ilmentyminen on yleisempää ja HIF-2α:n sekä PHD3:n ilmentyminen vähäisempää kolmoisnegatiivisessa kuin duktaalisessa rintasyövässä. Lisäksi totesimme, että sykliini D1 on itsenäinen ennustetekijä liittyen parempaan ennusteeseen duktaalisessa rintasyövässä. Huomioitavaa on kuitenkin, että kolmoisnegatiivisessa rintasyövän alaryhmässä sykliini D1:n esiintyminen oli huonon ennusteen merkki. CDK4 osoittautui voimakkaan proliferaation merkiksi kolmoisnegatiivisessa rintasyövässä. Lisäksi osoitimme, että p16:n ilmentyminen liittyy parempaan ennusteeseen sekä duktaalisessa rintasyövässä että kolmoisnegatiivisessa rintasyövässä.

<p>Pancreatic endocrine tumors (PETs) may cause typical syndromes of hormone excess, or appear clinically non-functioning without hormonal symptoms. PETs occur sporadically, in association with the multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) syndrome, or rarely the von Hippel-Lindau syndrome. Molecular genetic investigations may reveal pathways important for tumor development, and be of clinical use.</p><p>The aim of this thesis was to investigate regulation of different genes involved in cell proliferation, and relate findings to signs of malignancy in PETs.</p><p>The MEN1 gene on chromosome 11q13 was mutated in three out of eleven sporadic malignant PETs. Two nonsense mutations, causing truncation of the protein, and one missense mutation were found.</p><p>Relation of allelic loss at 11q13 and 3p25 to malignant behavior was observed in sporadic PETs. Allelic loss at 18q21 was found in a subset of sporadic and MEN1-associated PETs, and mutation analysis of Smad4 excluded a tumor suppressor gene function.</p><p>In PETs with allelic loss on chromosome 3p25, mutation analysis of WNT7A and HDAC11 excluded function as tumor suppressor genes.</p><p>Menin, encoded by the MEN1 gene, was reported to regulate expression of the cyclin-dependent kinase inhibitors CDKN2C/p18, CDKN1B/p27, and CDKN2B/p15 in mouse pancreatic islet tumor models. Here, the mRNA expression of these genes was not related to MEN1 gene mutations in human PETs.</p><p>Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) and the protooncogene c-Myc were found to be overexpressed regardless of MEN1 gene mutational status of the PETs. The CDK4 gene was neither amplified nor mutated. Targeting of CDK4 may present an alternative to traditional chemotherapy of PETs in the future.</p>

Pancreatic endocrine tumors (PETs) may cause typical syndromes of hormone excess, or appear clinically non-functioning without hormonal symptoms. PETs occur sporadically, in association with the multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) syndrome, or rarely the von Hippel-Lindau syndrome. Molecular genetic investigations may reveal pathways important for tumor development, and be of clinical use. The aim of this thesis was to investigate regulation of different genes involved in cell proliferation, and relate findings to signs of malignancy in PETs. The MEN1 gene on chromosome 11q13 was mutated in three out of eleven sporadic malignant PETs. Two nonsense mutations, causing truncation of the protein, and one missense mutation were found. Relation of allelic loss at 11q13 and 3p25 to malignant behavior was observed in sporadic PETs. Allelic loss at 18q21 was found in a subset of sporadic and MEN1-associated PETs, and mutation analysis of Smad4 excluded a tumor suppressor gene function. In PETs with allelic loss on chromosome 3p25, mutation analysis of WNT7A and HDAC11 excluded function as tumor suppressor genes. Menin, encoded by the MEN1 gene, was reported to regulate expression of the cyclin-dependent kinase inhibitors CDKN2C/p18, CDKN1B/p27, and CDKN2B/p15 in mouse pancreatic islet tumor models. Here, the mRNA expression of these genes was not related to MEN1 gene mutations in human PETs. Cyclin-dependent kinase 4 (CDK4) and the protooncogene c-Myc were found to be overexpressed regardless of MEN1 gene mutational status of the PETs. The CDK4 gene was neither amplified nor mutated. Targeting of CDK4 may present an alternative to traditional chemotherapy of PETs in the future.

Ischemic stroke occurs as a result of a lack or severe reduction of blood supply to the brain. Presently therapeutic interventions are limited and there is a need to develop new and efficacious stroke treatments. To this end, a great deal of research effort has been devoted to studying the potential molecular mechanisms involved in ischemic neuronal death. Correlative evidence demonstrated a paradoxical activation of the cell cycle machinery in ischemic neurons. The levels and activity of key cell cycle regulators including cyclin D1, Cdk2 and Cdk4 are upregulated following ischemic insults. However, the functional relevance of these various signals following ischemic injury was unclear. Accordingly, the research described in this thesis address the functional relevance of the activation of the cell cycle machinery in ischemic neuronal death. The data indicate that the inhibition of Cdk4 protects neurons from ischemia-induced delayed death, whereas abrogation of Cdk5 activity prevents excitotoxicity-induced damage in vitro and in vivo. Examination of upstream activators of mitotic-Cdks showed that Cdc25A is a critical mediator of delayed ischemic neuronal death. Investigation of the potential molecular mechanism by which cell cycle regulators induced neuronal death revealed perturbations in the levels and activity of key downstream targets of Cdk4. The retinoblastoma protein family members, pRb and p130 are increasingly phosphorylated following ischemic stresses. Importantly, p130 and E2F4 proteins are drastically reduced following ischemic insults. Additionally, E2F1 association with promoters of pro-apoptotic genes are induced while that of E2F4 is reduced. These changes appear to be important determinants in ischemic neuronal death. Cumulatively, the data supports the activation of the cell cycle machinery as a pathogenic signal contributing to ischemic neuronal death. The development of neuroprotectant strategies for stroke has been hampered in part by its complex pathophysiology. Previous research indicated that flavopiridol, a general CDK-inhibitor, is unable to provide sustained neuroprotection beyond one week following cerebral ischemia. The potential benefit of combining flavopiridol with another neuroprotectant, minocycline, was explored. The data indicate that while this approach provided histological protection 10 weeks after insult, the protected neurons are not functional due to progressive dendritic degeneration. This evidence indicates that targeting cell cycle pathways in stroke while important must be combined with other therapeutic modalities to fully treat stroke-induced damage.

Ischemic stroke occurs as a result of a lack or severe reduction of blood supply to the brain. Presently therapeutic interventions are limited and there is a need to develop new and efficacious stroke treatments. To this end, a great deal of research effort has been devoted to studying the potential molecular mechanisms involved in ischemic neuronal death. Correlative evidence demonstrated a paradoxical activation of the cell cycle machinery in ischemic neurons. The levels and activity of key cell cycle regulators including cyclin D1, Cdk2 and Cdk4 are upregulated following ischemic insults. However, the functional relevance of these various signals following ischemic injury was unclear. Accordingly, the research described in this thesis address the functional relevance of the activation of the cell cycle machinery in ischemic neuronal death. The data indicate that the inhibition of Cdk4 protects neurons from ischemia-induced delayed death, whereas abrogation of Cdk5 activity prevents excitotoxicity-induced damage in vitro and in vivo. Examination of upstream activators of mitotic-Cdks showed that Cdc25A is a critical mediator of delayed ischemic neuronal death. Investigation of the potential molecular mechanism by which cell cycle regulators induced neuronal death revealed perturbations in the levels and activity of key downstream targets of Cdk4. The retinoblastoma protein family members, pRb and p130 are increasingly phosphorylated following ischemic stresses. Importantly, p130 and E2F4 proteins are drastically reduced following ischemic insults. Additionally, E2F1 association with promoters of pro-apoptotic genes are induced while that of E2F4 is reduced. These changes appear to be important determinants in ischemic neuronal death. Cumulatively, the data supports the activation of the cell cycle machinery as a pathogenic signal contributing to ischemic neuronal death. The development of neuroprotectant strategies for stroke has been hampered in part by its complex pathophysiology. Previous research indicated that flavopiridol, a general CDK-inhibitor, is unable to provide sustained neuroprotection beyond one week following cerebral ischemia. The potential benefit of combining flavopiridol with another neuroprotectant, minocycline, was explored. The data indicate that while this approach provided histological protection 10 weeks after insult, the protected neurons are not functional due to progressive dendritic degeneration. This evidence indicates that targeting cell cycle pathways in stroke while important must be combined with other therapeutic modalities to fully treat stroke-induced damage.