Le vieillissement est associé un mécanisme d'arrêt du cycle cellulaire nommé senescence. Au niveau de l'adipocyte, cet état cellulaire semble contribuer à la survenue d'altérations métaboliques et à un état pro-inflammatoire. Dans ce contexte, le tissu adipeux blanc viscéral pourrait jouer un rôle déterminant sur la perte du contrôle métabolique et ainsi participer à l'installation de pathologies associées au vieillissement. Au cours du vieillissement, le tissu adipeux blanc subit des modifications morphologiques et physiologiques conduisant à une altération progressive des fonctions de stockage et endocrines de l'adipocyte. Ainsi, un nouveau profil sécrétoire pro-inflammatoire appelé SASP (Senescence Associated Secretory Phenotype) a pu être mis en évidence et pourrait être impliqué dans la survenue de différentes pathologies liées à l'âge (diabète, insuffisance cardiaque ou rénales, ...). Dans ce sens, l'analyse précise du SASP d'adipocytes issus de souris de différents âges nous a permis d'identifier une cytokine pro-inflammatoire, l'haptoglobine, comme un nouveau candidat potentiellement impliqué dans les désordres métaboliques et inflammatoires associés au vieillissement. Nos premiers résultats montrent que, via une boucle de régulation, la senescence augmente la production d'haptoglobine adipocytaire et que réciproquement., cette production entretien la senescence de l'adipocyte Au niveau fonctionnel, l'haptoglobine altère les principales fonctions adipocytaires métaboliques telles que la lipolyse et la sensibilité à l'insuline. Des expériences sont en cours afin de confirmer in vivo l'importance de cette adipocytokine sur les altérations métaboliques entrainant une accélération du vieillissement de l'organisme. Cette étude permettra de mieux comprendre la participation de l'haptoglobine dans la perte des fonctions du tissu adipeux afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ralentir les processus de vieillissement. / Aging is associated with a cell cycle arrest mechanism named senescence. In adipocyte, this cell state could contribute to metabolic alterations as well as a low-grade inflammatory state. In this context, visceral white adipose tissue could play a major role in age-associated setup pathologies through the loss of metabolic control. Indeed, during aging, white adipose tissue undergoes functional and morphological modifications progressively leading to altered storage and endocrine capacities. Consequently, it has been hypothesized that a new emerging adipocyte secretory profile associated with aging (SASP for senescence associated secretory phenotype) could actively participate to the progressive onset of metabolic diseases related to aging. By proteomic analysis, we identified haptoglobin as a new proinflammatory cytokine overproduced by murine adipose tissue during aging. Our results showed a regulatory feedback loop between adipocyte haptoglobin and senescence state arguing for a role of the cytokine in aging process. Moreover, haptoglobin induced adipocyte metabolic alterations in vitro targeting lipolysis and insulin sensitivity. In vivo validation of haptoglobin's role on metabolic-induced aging are currently ongoing. Our study will allow a better understanding of haptoglobin's role in age-related adipose tissue loss of function and will pave the road for a new therapeutic strategy in the field of metabolism and age-associated pathologies.

La sénescence est un mécanisme de défense antiprolifératif dont la cellule est munie afin de prévenir l’accumulation de mutations pouvant mener à sa transformation et l’éventuel développement d’une tumeur. Ce programme consiste en un arrêt permanent du cycle cellulaire. Il peut être activé par de nombreux stimuli tels que le raccourcissement des télomères, le stress oxydatif, ou l’expression d’un oncogène constitutivement actif. Sa régulation requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur dont les plus importants sont p53 et RB. De manière plus spécifique, les sénescences induites par l’expression des oncogène RASV12 ou STAT5A(1*6) sont respectivement caractérisées par l’augmentation de l’expression des protéines PML et CHES1/FOXN3. Le but de cette thèse est, dans un premier temps, de mettre en évidence le mécanisme de régulation de la sénescence par PML. PML est un suppresseur de tumeur dont l’expression dans des cellules diploïdes normales est suffisante pour induire la sénescence. Cette protéine forme des corps nucléaires sphériques au sein desquels est recruté, parmi d’autres molécules, la protéine du rétinoblastome RB. RB est un régulateur négatif du cycle cellulaire capable de lier et inhiber les facteurs de transcription E2F dont les gènes cibles sont nécessaires à la prolifération. Nos travaux démontrent que le mécanisme d’induction de la sénescence par PML implique le recrutement du complexe RB/E2F aux corps de PML afin de renforcer l’inhibition de l’activité des E2F par RB. Également, les E2F sont recrutés aux corps de PML en compagnie de leurs promoteurs ce qui favorise la formation d’hétérochromatine au niveau de ces gènes, aidant à leur répression et donc à l’établissement de la sénescence. D’autre part, cette thèse a pour but de caractériser le rôle de CHES1/FOXN3 dans la régulation du cycle cellulaire. CHES1 est un facteur de transcription de la famille des Forkheads. Son expression dans des cellules cancéreuses provoque un ralentissement de leur prolifération. Afin de comprendre son mécanisme de fonctionnement, une analyse sur micropuce d’ADN de l’expression des gènes de cellules cancéreuses exprimant CHES1 a été réalisée. Cette analyse a montré que, dans la cellule, CHES1 joue un rôle de répresseur transcriptionnel. Plus précisément, CHES1 réprime, entre autres, l’expression de gènes nécessaires à la synthèse des protéines tels que PIM2 et DYRK3. De manière intéressante, la réexpression de PIM2 dans des cellules cancéreuses exprimant CHES1 permet de rétablir partiellement la prolifération cellulaire. Également, l’analyse sur micropuce a révélé que CHES1 régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans la formation des cilia dont l’une des fonctions semble être de moduler la synthèse protéique. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le mécanisme antitumoral de CHES1 consiste en une inhibition de la synthèse de protéines. / Senescence is an antiproliferative defense mechanism that protects the cell against the accumulation of mutations and, eventually, her transformation and the development of a tumor. This program consists of a permanent cell cycle arrest. It can be activated by many stimuli, such as telomere shortening, oxidative stress, or the expression of a constitutively active oncogene. Senescence regulation requires activation of proteins called tumor suppressors which the most important are p53 and RB. More specifically, senescences induced by the expression of oncogenic RASV12 or STAT5A (1 * 6) are respectively characterized by increased expression of the proteins PML and CHES1/FOXN3. The purpose of this thesis is, firstly, to identify the mechanism of regulation of senescence by PML. PML is a tumor suppressor whose expression in normal diploid cells is sufficient to induce senescence. This protein forms spherical nuclear bodies in which is recruited, among other molecules, the retinoblastoma protein RB. RB is a negative regulator of the cell cycle due to its capacity to bind and inhibit the E2F transcription factors whose target genes are necessary for proliferation. Our work demonstrates that the mechanism of induction of senescence by PML involves the recruitment of the complex RB/E2F to the PML body to enhance the inhibition of E2F activity by RB. Also, the E2Fs are recruited to PML bodies together with their promoters which promotes the formation of heterochromatin in these genes, helping their repression and thus the establishment of senescence. On the other hand, this thesis aims to characterize the role of CHES1/FOXN3 in regulating the cell cycle. CHES1 is a transcription factor of the Forkheads family which expression in cancer cells causes a growth reduction. To understand the antitumoral mechanism of CHES1, a microarray analysis of cancer cells expressing CHES1 was performed. This analysis shows that CHES1 is a transcriptional repressor. Specifically, CHES1 represses, among others, the expression of genes required for the synthesis of proteins such as PIM 2 and DYRK3. Interestingly, re-expression of PIM 2 in cancer cells expressing CHES1 partially restores cell proliferation. Also, microarray analysis revealed that CHES1 regulates the expression of many genes involved in the formation of cilia which one of the functions seems to be to modulate protein synthesis. Taken together, these results suggest that the antitumor mechanism of CHES1 involves inhibition of protein synthesis.

La sénescence cellulaire est une réponse à un stress des cellules de mammifère caractérisée par un arrêt durable du cycle cellulaire. Celle-ci peut être déclenchée par un dysfonctionnement des télomères, des stress génotoxiques et l’activation d’oncogènes. La sénescence constitue une puissante ligne de défense contre le développement de cancers et intervient aussi dans le vieillissement. Les cellules en sénescence réorganisent leur génome par l’assemblage en hétérochromatine sous forme de SAHFs (senescence-associated heterochromatin foci). Nous avons mis en évidence que la désacétylation globale de H4-K16Ac par la désacétylase SIRT2 est impliquée dans l’assemblage de l’hétérochromatine en sénescence. De plus, nous avons identifié une accumulation de variants d’histones H2A et H2B spécifiquement dans des cellules en sénescence présentant des dommages persistants à l’ADN. Ces variants d’histone pourraient avoir des fonctions spécifiques dans ces cellules et pourraient représenter un biomarqueur du vieillissement in vivo.Mes travaux apportent des éléments pour la compréhension des rôles de l’information épigénétique dans la sénescence cellulaire. / Cellular senescence is a stress response of mammalian cells characterized by a stable cell proliferation arrest. It can be triggered by telomere dysfunction, genotoxic stress and oncogene activation. Cellular senescence acts as a natural barrier against cancer development and is involved in ageing. Senescent cells reorganize their genome by the assembly of chromatin into senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). We showed that SIRT2-mediated global deacetylation of H4-K16Ac is involved in heterochromatin assembly in senescence. Moreover, we identified the accumulation with time of specific H2A and H2B variants in senescence triggered by persistent DNA damage signaling. These histone variants could have specific functions in senescent cells and could be a useful ageing biomarker in vivo.This work provides novel insights into chromatin modification and epigenetic regulation in cellular senescence.

La sénescence cellulaire et l'apoptose ont évolué comme des puissantes barrières protectrices contre la transformation néoplasique. La sénescence est un état d'arrêt permanent de la prolifération dans lequel les cellules restent métaboliquement actives. La sénescence cellulaire est déclenchée par différentes sources de stress, notamment les oncogènes activés, le dysfonctionnement des télomères, les dommages à l'ADN et des défauts dans la réplication provoqués par des agents génotoxiques, des espèces réactives de l'oxygène, etc. Ce processus complexe engage deux voies différentes de suppresseurs de tumeurs, les voies p53/p21 et p16INK4a/pRb, et les deux voies doivent être compromises dans les cellules humaines afin de contourner la sénescence. Par conséquent, décrire la relation entre l'activation des oncogènes, l'arrêt de la prolifération induite par la sénescence et l'échappement à l'état de sénescence est essentiel pour comprendre le processus de tumorigenèse. KDM4A est un membre de la sous-famille KDM4 des Jumonji lysine déméthylases ciblant les variantes di- et triméthylées de l'histone H3 lysine 9 (H3K9) et l'histone H3 lysine 36 (H3K36). Les trois premiers membres de la sous-famille KDM4A, KDM4B et KDM4C sont également capables de lier l'histone 4 lysine 20 di-méthyl/tri-méthyl (H4K20me2/3) et l'histone 3 lysine 4 tri-méthyl (H3K4me3), via leurs domaines Tudor consécutifs. KDM4A module négativement l'activité de la voie p53, en ciblant directement le suppresseur de tumeur CHD5, et est également un régulateur négatif de la réponse aux dommages de l'ADN. Les niveaux d'expression de KDM4A sont souvent élevés dans les cellules cancéreuses et diminués pendant la sénescence cellulaire. La motivation principale de cette thèse est d'élargir nos connaissances actuelles sur la façon dont la réorganisation de la chromatine influence la stabilité du phénotype de sénescence. Dans la première partie de ce travail, nous abordons la fonction de méthylation de H4K20 et H3K9, dans le contexte des foyers d'hétérochromatine associés à la sénescence (SAHF: senescence-associated heterochromatin foci). Nous démontrons que l'intégration de H4K20me3 dans les SAHF dépend de l'incorporation précédente de H3K9me3 et révélons les méthyltransférases H4K20 impliquées dans ce processus. Nous proposons un mécanisme moléculaire par lequel H4K20me3 et H3K9me3 coopèrent avec p53 dans la répression stable des gènes cibles de E2F au cours de la sénescence induite par l'oncogène Ras. Dans la deuxième partie de la thèse, nous présentons une voie de dégradation lysosomale (c'est-à-dire l'autophagie médiée par des chaperons) en tant que nouveau mécanisme potentiel par lequel les cellules modulent les niveaux de KDM4A pendant la sénescence. Nos résultats suggèrent que la méthylation dans les lysines des histones régule la stabilité de sénescence en réponse à l'oncogène Ras et révèlent le potentiel d'induction de la sénescence par inhibition ciblée de KDM4A dans le traitement du cancer. / Cellular senescence and apoptosis have evolved as potent protective barriers against neoplastic transformation. Senescence is a state of stable arrest of proliferation in which cells remain metabolically active. Cellular senescence is triggered by different sources of stress, including activated oncogenes, telomere dysfunction, DNA damage and replication defects elicited by genotoxic agents, reactive oxygen species, etc. This complex process engages two different tumor suppressor pathways, the p53/p21 and p16INK4a/pRb pathways that need to be compromised in human cells in order to circumvent the senescence-associated growth halt. Hence, describing the relationship between oncogene activation, senescence-induced proliferation arrest and escape from the senescence state remains essential to understand tumorigenesis. KDM4A is a member of the KDM4 sub-family of Jumonji lysine demethylases targeting di- and tri-methylated histone H3 lysine 9 (H3K9) and histone H3 lysine 36 (H3K36). The first three sub-family members KDM4A, KDM4B and KDM4C are also able to bind histone 4 lysine 20 di-methyl/tri-methyl (H4K20me2/3) and histone 3 lysine 4 tri-methyl (H3K4me3), via their tandem Tudor domain. KDM4A negatively modulates the activity of the p53 pathway, by directly targeting the tumor suppressor CHD5, and is also a negative regulator of the DNA damage response. KDM4A expression levels are often elevated in cancer cells and decreased during cellular senescence. The principal motivation for this thesis is to expand our current knowledge on how chromatin reorganization influences the stability of the senescence phenotype. In the first part of this work we address the function of H4K20 and H3K9 methylation, in the context of the senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). We demonstrate that integration of H4K20me3 into the SAHF depends on the previous incorporation of H3K9me3 and reveal the H4K20 methyltransferases involved in this process. We propose a molecular mechanism by which H4K20me3 and H3K9me3 cooperate with p53 in the stable repression of E2F target genes during oncogenic Ras-induced senescence. In the second part of the thesis we present a lysosomal-degradation pathway (i.e. chaperone-mediated autophagy) as a novel potential mechanism by which cells modulate KDM4A protein levels during senescence. Our results strongly suggest that histone lysine methylation contributes to the stability of the senescence response to the Ras oncogene and reveal the potential of senescence induction by targeted inhibition of KDM4A in the treatment of cancer.

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine. / The Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK1/2) regulate multiple cellular processes such as proliferation, survival and differentiation. These kinases are the last component of the ERK/MAPK pathway, which is activated in about 30% of all human cancers. Therefore, current thinking proposes that the ERK/MAPK pathway is a critical mediator of tumor progression. However, a steadily growing number of observations suggest that ERK kinases could trigger tumor suppression as well. The first aim of this thesis is to determine how ERK signaling triggers tumor suppression and to try to reconcile these mechanisms with its putative contribution to tumor progression. Since our work has a profound impact on the value of some therapies currently in development, the second aim of the thesis is to propose new strategies to fight cancer. We found that hyperactivation of the ERK kinases induces cellular senescence. Mechanistically, this involves selective proteasome-dependent protein degradation. This “Senescence-Associated Protein Degradation” (SAPD) targets proteins required for several cellular functions, including cell cycle progression, mitochondrial functions and ribosome biogenesis. Furthermore, our results showed that downregulation of ERK signaling not only inhibits the establishment of senescence but promotes cellular reprogramming, thereby allowing precancerous cells to gain tumorigenicity and cancer cells to acquire stem cell-like properties. These results suggest that mechanisms downregulating the ERK/MAPK pathway could promote cancer initiation, metastasis and resistance to multiple therapies. Finally, we demonstrated that the antidiabetic drug metformin targets the transcription factor NF-kB. The latter plays a central role in reprogramming, but also in the generation of deleterious pro-inflammatory cytokines by senescent cells. Hence, we suggest that metformin could be used in combination with other therapies to avoid the side effects of either downregulating or overactivating ERK signaling. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate that the outcome of the ERK/MAPK pathway activity depends on signaling strength. While a moderate activation of the pathway may contribute to cell proliferation, a strong activation induces senescence and, conversely, a low activation promotes cancer cell reprogramming. This versatility of the pathway suggests caution with the use of ERK/MAPK pathway inhibitors, but motivates us to develop new therapeutic strategies, which could include metformin.

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide. / In response to different stress, three anti-proliferative mechanisms, namely apoptosis, also called programmed cell death, transient growth arrest and senescence, prevent the cells from cumulating mutations that can lead to uncontrolled proliferation and, eventually, to tumor development. Regulation of these mechanisms requires the activation of proteins called tumor suppressors. One of them, p53, is a transcription factor whose stabilization and activation lead to an increase in expression of genes directly implicated in cell cycle arrest. In the past years, studies about p53 showed how much its function is complex and with how many signaling pathways and proteins it cooperates to maintain genome integrity. Thus, studying the activation mechanisms of p53 is essential to understand its regulation and, thereby, to prevent tumor development and to elaborate new strategies for cancer treatment. The first aim of this thesis is to show a new activation mechanism of p53 and of senescence by the protein SOCS1, a suppressor of cytokine signaling. This mechanism implies a direct interaction between the two proteins, specifically between the SH2 domain of SOCS1 and the N-terminal transactivation domain of p53. SOCS1 also interacts with the DNA damage-regulated kinases ATM and ATR via its C-terminal domain, which contains a SOCS Box, to facilitate the phosphorylation of p53 on its serine 15. Thus, by interacting at the same time with p53 and ATM, SOCS1 contributes to stabilization and activation of p53. In accordance with this model, SOCS1 inhibition in human normal fibroblasts decreases the number of senescent cells in which the activated oncogene STAT5A is expressed and reduces p53 nuclear accumulation in these cells. In the same way, T cells from Socs1-/-Ifnγ-/- mice are less likely to undergo apoptosis than T cells from Socs1+/+Ifnγ+/+ mice, after exposure to γ radiation. In both contexts, the expression of p53 target genes is decreased, which indicates that SOCS1 is implicated in p53 activation in vivo. This thesis also aims to show the role of SOCS1 in the activation of other transcription factors and, thereby, to show that it can act as a more general regulator of transcription. A detailed study of the interaction between SOCS1 and p53 showed that the transactivation domain II of p53 (amino acids 36-67) is sufficient for the interaction. Specifically, it seems that tryptophan 53 (W53) and phenylalanine 54 (F54) are essential for the interaction. A structural analysis of this p53 region highlights an acid transactivation domain actually conserved in many others transcription factors, such as p63, p73 and E2F1. In accordance with this observation, SOCS1 is able to interact with both proteins. Thus, the capacity of SOCS1 to interact with p53 and to regulate its activity may extend to other transcription factors. The mechanism showed in this thesis contributes to the understanding of p53 regulation and highlights a new function for the SOCS1 protein. Indeed, until now, SOCS1 was mostly known to be a negative regulator of the JAK/STAT pathway. Moreover, this new role for SOCS1 explains how an aberrant cytokine signaling can trigger senescence or apoptosis. Finally, the fact that SOCS1 can regulate different transcription factors allows us to consider it as a general regulator of transcription factors containing an acid transactivation domain.

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide. / In response to different stress, three anti-proliferative mechanisms, namely apoptosis, also called programmed cell death, transient growth arrest and senescence, prevent the cells from cumulating mutations that can lead to uncontrolled proliferation and, eventually, to tumor development. Regulation of these mechanisms requires the activation of proteins called tumor suppressors. One of them, p53, is a transcription factor whose stabilization and activation lead to an increase in expression of genes directly implicated in cell cycle arrest. In the past years, studies about p53 showed how much its function is complex and with how many signaling pathways and proteins it cooperates to maintain genome integrity. Thus, studying the activation mechanisms of p53 is essential to understand its regulation and, thereby, to prevent tumor development and to elaborate new strategies for cancer treatment. The first aim of this thesis is to show a new activation mechanism of p53 and of senescence by the protein SOCS1, a suppressor of cytokine signaling. This mechanism implies a direct interaction between the two proteins, specifically between the SH2 domain of SOCS1 and the N-terminal transactivation domain of p53. SOCS1 also interacts with the DNA damage-regulated kinases ATM and ATR via its C-terminal domain, which contains a SOCS Box, to facilitate the phosphorylation of p53 on its serine 15. Thus, by interacting at the same time with p53 and ATM, SOCS1 contributes to stabilization and activation of p53. In accordance with this model, SOCS1 inhibition in human normal fibroblasts decreases the number of senescent cells in which the activated oncogene STAT5A is expressed and reduces p53 nuclear accumulation in these cells. In the same way, T cells from Socs1-/-Ifnγ-/- mice are less likely to undergo apoptosis than T cells from Socs1+/+Ifnγ+/+ mice, after exposure to γ radiation. In both contexts, the expression of p53 target genes is decreased, which indicates that SOCS1 is implicated in p53 activation in vivo. This thesis also aims to show the role of SOCS1 in the activation of other transcription factors and, thereby, to show that it can act as a more general regulator of transcription. A detailed study of the interaction between SOCS1 and p53 showed that the transactivation domain II of p53 (amino acids 36-67) is sufficient for the interaction. Specifically, it seems that tryptophan 53 (W53) and phenylalanine 54 (F54) are essential for the interaction. A structural analysis of this p53 region highlights an acid transactivation domain actually conserved in many others transcription factors, such as p63, p73 and E2F1. In accordance with this observation, SOCS1 is able to interact with both proteins. Thus, the capacity of SOCS1 to interact with p53 and to regulate its activity may extend to other transcription factors. The mechanism showed in this thesis contributes to the understanding of p53 regulation and highlights a new function for the SOCS1 protein. Indeed, until now, SOCS1 was mostly known to be a negative regulator of the JAK/STAT pathway. Moreover, this new role for SOCS1 explains how an aberrant cytokine signaling can trigger senescence or apoptosis. Finally, the fact that SOCS1 can regulate different transcription factors allows us to consider it as a general regulator of transcription factors containing an acid transactivation domain.

L'obésité est un facteur de risque majeur de cancer. Il est connu qu’une adiposité élevée prédispose à un stress inflammatoire accru et potentialise la croissance tumorale. Néanmoins, les mécanismes restent mal définis. De façon intéressante, la sénescence cellulaire, ou le programme moléculaire causant l’arrêt du cycle cellulaire suite à un stress insurmontable, favorise l'inflammation chronique et délétère pendant l'obésité. Nous avons donc émis l’hypothèse que l'obésité puisse être un inducteur de sénescence protumoral qu’il est possible d’exploiter, via une stratégie sénolytique, pour ralentir ou même bloquer le développement de tumeurs. Grâce à des marquages de coupes histologiques de tumeurs métastatiques, nous avons montré que les masses malignes de patients ayant un indice de masse corporelle (IMC)>35 sont associées à des marqueurs de sénescence. Cette découverte suggère une charge élevée de cellules sénescentes chez ses patients. Alors que la sénolyse, ou l’élimination thérapeutique des cellules sénescentes, s'est révélée très prometteuse dans le traitement de plusieurs maladies liées à l'âge, son efficacité en tant que traitement du cancer est souvent mitigé et dépend des antécédents du patient. Dans notre étude, nous avons utilisé un modèle murin d'obésité induit par la diète combinée avec un modèle d’injections syngéniques de différentes lignées cancéreuses occasionnant des réponses immunogéniques faibles, légères ou hautes. Chez les souris sur une diète riche en gras, nous avons identifié des cellules cancéreuses sénescentes spécifiquement dans les tumeurs faiblement immunogènes, soit faiblement reconnue par le système immunitaire et donc difficile à traiter. Un traitement sénolytique avec l'inhibiteur de la famille BCL-2 ABT-263 abolit la réponse protumorale observée via l'ablation des cellules cancéreuses sénescentes. Ainsi, nous proposons que les thérapies combinatoires avec des agents sénolytiques devraient être envisagées pour traiter les patients cancéreux présentant une adiposité accrue. De plus, dans la même cohorte de patients où nous avons rapporté des marqueurs de sénescence dans les tissus malins, les patients obèses ont aussi montré une expression importante de Toll-like receptor 4 (TLR4). Nous avons donc émis l’hypothèse que le récepteur TLR4 joue un rôle important dans l’établissement d’un microenvironnement tumoral qui favorise la sénescence cellulaire et la croissance tumorale de souris en surplus de poids. Dans notre étude, nous rapportons que l'expression systémique de TLR4 est importante pour la croissance tumorale induite par l'obésité. Nous montrons également que l’induction d’un stress du réticulum endoplasmique médié par Inositol requiring enzyme 1a (IRE1ɑ) dans les cellules myéloïdes associées à une tumeur, favorise la sénescence des cellules cancéreuses, dans un contexte de faible immunogénicité, via TLR4. Ce travail établit les fondements d’une compréhension moléculaire du lien entre les régimes à forte teneur calorique et l'immunité protumorale. / Obesity is a major risk factor for cancer. High adiposity predisposes to increased inflammatory stress, which potentiates tumor growth. However, the mechanisms remain poorly defined. Interestingly, cellular senescence, or the molecular program causing cell cycle arrest following insurmountable stress, is known to promote chronic and deleterious inflammation during obesity. We therefore hypothesized that obesity could be an inducer of a protumoral senescence that can be exploited, via a senolytic strategy, to slow down or even block tumor development. Through histological sections of metastatic tumor, we show that malignant masses from patients with a body mass index (BMI)>35 are associated with markers of senescence, suggesting a high burden of senescent cells in these patients. While senolysis, or the therapeutic elimination of senescent cells, has shown great promises in the treatment of several age-related diseases, its efficacy as a treatment for cancer is often elusive and depends on patients’ history. In our study, we used a mouse model of diet-induced obesity (DIO) combined with a model of syngeneic injections of different cancer cell lines causing low, mild, or high immunogenic responses. In mice under a DIO, we have identified senescent cancer cells specifically in weakly immunogenic tumors, or tumors poorly recognized by the immune system, and therefore difficult to treat. Moreover, a senolytic treatment with the BCL-2 family inhibitor ABT-263 abolishes the protumor response seen in these mice via the ablation of senescent cancer cells. Thus, combination therapies using senolytic agents should fall into consideration to treat cancer patients with increased adiposity. In addition, in the same cohort of patients where we reported markers of senescence in malignant tissues, obese patients also showed significant expression of TLR4. We therefore hypothesized that the TLR4 receptor plays an important role in establishing a tumor microenvironment that promotes cellular senescence and tumor growth in mice subjected to experimental obesity. In our second study, we report that systemic expression of TLR4 is important for obesity-induced tumor growth. Moreover, we show that the induction of an IRE1ɑ-mediated endoplasmic reticulum stress, in tumor-associated myeloid cells, promotes the senescence of cancer cells, in a context of low immunogenicity, via TLR4. This work lays the foundation for a molecular understanding of the link between high-calorie diets and protumoral immunity.

La sénescence est un processus caractérisé par un arrêt stable du cycle cellulaire. Ce mécanisme peut être induit en réponse à de nombreux stress, comme l’activation d’un oncogène, le raccourcissement des télomères ou bien le traitement avec des composés génotoxiques. Cette réponse cellulaire est considérée comme une barrière antitumorale limitant la prolifération des cellules exposées au risque de transformation. La mise en place de la sénescence dépend de profonds changements au niveau moléculaire, dont l’activation d’un programme de dégradation sélective des protéines. Cette dégradation de protéines associée à la sénescence (SAPD) peut expliquer plusieurs caractéristiques des cellules sénescentes, notamment la présence de défauts dans la voie de synthèse des ribosomes (SARD). Ces derniers sont liés à un stress nucléolaire qui mène à l’accumulation de certaines protéines ribosomiques dans le noyau, où elles peuvent effectuer des fonctions indépendantes de leur rôle structurale dans les ribosomes. Parmi ces protéines ribosomiques, RPS14/uS11 peut s’accumuler dans le nucléoplasme et réguler le cycle cellulaire en inhibant CDK4. Ces mécanismes de régulation post-traductionnelle -le SAPD ainsi que les conséquences des SARD- contribuent de manière importante au phénotype sénescent. Nous avons émis l’hypothèse que la caractérisation des effecteurs dans ces voies pourrait mener à l’identification de nouvelles protéines importantes pour la sénescence et la suppression tumorale. Dans un premier temps, nous avons évalué le rôle de la protéine ribosomique RPL22/eL22 dans le cycle cellulaire et la sénescence. Tout comme RPS14, RPL22 a été identifié dans l’analyse de l’interactome de CDK4 lors de la sénescence induite par la perte du facteur de la ribogenèse RSL1D1. Nous avons pensé que RPL22 pourrait agir de manière similaire à RPS14 et ainsi effectuer des fonctions extra-ribosomiques impliquées dans la régulation du cycle cellulaire. Dans le premier article présenté dans cette thèse, nous montrons que la surexpression de RPL22 dans des fibroblastes humains induit un phénotype sénescent et que RPL22 peut lier et inhiber CDK4 afin d’activer la voie de RB. Ensemble, ces données indiquent un rôle suppressif de RPL22 dans le cycle cellulaire. En second lieu, nous nous sommes penchés sur la caractérisation des effecteurs du programme de dégradation sélective de protéines associé à la sénescence. Ce programme est mené à terme par le système ubiquitine-protéasome, un mécanisme finement régulé par différents types de protéines. Parmi celles-ci, les E3 ubiquitine ligases définissent la spécificité de ce système en interagissant avec les substrats à dégrader. Nous avons donc pensé que certaines E3 ubiquitine ligases spécifiques pourraient être importantes pour le mécanisme de dégradation protéique associé à la sénescence. Afin d’identifier celles-ci, nous avons effectué un criblage de shARN ciblant des gènes d’E3 ubiquitine ligases dans le contexte de la sénescence induite par les oncogènes. Ceci a mené à l’identification d’ASB14 comme un acteur important de la sénescence. Dans le deuxième article de cette thèse, nous montrons que la perte d’ASB14 produit un contournement de la sénescence induite par l’oncogène RAS dans plusieurs modèles cellulaires. ASB14 est une protéine peu caractérisée et nous avons généré des anticorps afin d’analyser son expression. Nous montrons ensuite qu’ASB14 s’exprime fortement dans le pancréas sain, tandis que ses niveaux diminuent dans les tumeurs pancréatiques. Enfin, nous avons identifié les partenaires d’interaction d’ASB14 dans le contexte de la sénescence induite par l’oncogène RAS. Globalement, les travaux présentés dans cette thèse nous ont permis d’identifier deux nouvelles protéines impliquées dans la sénescence cellulaire : la protéine ribosomique RPL22 et l’E3 ubiquitine ligase ASB14. Ces deux protéines contribuent à la régulation post-traductionnelle du phénotype sénescent. D’un côté, RPL22 peut inhiber l’activité de CDK4 afin d’activer la voie de RB et ainsi réguler le cycle cellulaire. D’une autre part, ASB14 est importante pour le maintien du phénotype sénescent et semble avoir un rôle dans la suppression tumorale du pancréas. Nos résultats suggèrent que RPL22 et ASB14 sont importants pour la sénescence et la suppression tumorale. / Cellular senescence is characterized by a stable cell cycle arrest. This process can be induced by a variety of cellular stresses, including oncogene activation, telomere shortening and genotoxic treatments. In fact, senescence is considered an antitumor barrier that prevents cellular transformation. Senescence is associated with widespread molecular changes, including the activation of a selective protein degradation program. This senescence-associated protein degradation (SAPD) could regulate some senescence-associated phenotypes, including the senescence-associated ribosome biogenesis defects (SARD). Senescence-associated ribosome biogenesis defects are linked to a nuclear accumulation of some ribosomal proteins such as RPS14/uS11 capable of carrying out extra-ribosomal functions. In particular, RPS14 can inhibit CDK4 and mediate senescence. Thus, we hypothesize that the proteins implicated in these pathways -SAPD and SARD- could be important for senescence and tumor suppression. First, we evaluated the ability of the ribosomal protein L22 (RPL22/eL22) to regulate cellular senescence and cell cycle progression. RPL22, as RPS14, was identified as a binding partner for CDK4 in senescent cells induced by depleting the ribosome biogenesis factor RSL1D1. Hence, we though that RPL22 could act in a manner similar to RPS14. In chapter two, we show that RPL22 overexpression induces a senescent phenotype in human fibroblasts. In addition, we show that RPL22 can interact with CDK4 inhibiting its activity and stimulating the RB tumor suppressor pathway. Taken together, these results indicate a suppressive role of RPL22 in cell cycle progression. Next, we focused on the characterization of SAPD effectors. This mechanism is mediated by the ubiquitin-proteasome system which is tightly regulated by E3 ubiquitin ligases. Thus, we thought that specific E3 ubiquitin ligases could be important for SAPD and for senescence. In order to discover E3 ubiquitin ligases that contribute to senescence, we performed an unbiased screening using shRNA libraries in Ras-induced senescent cells. This led to the identification of ASB14 as an important mediator of senescence. In chapter three, we show that ASB14 depletion leads to a bypass of Ras-induced senescence. ASB14 is a poorly characterized E3 ligase, and we generated antibodies in order to analyze its expression levels. We show that ASB14 is highly expressed in the normal pancreas whereas its expression is reduced in pancreatic cancer tissues. Finally, we uncovered the interactome of ASB14 in Ras-induced senescent cells. Overall, we have discovered two new senescence mediators: ribosomal protein L22 and E3 ubiquitin ligase ASB14. These proteins are implicated in the post-translational regulation of the senescent phenotype. RPL22 acts as a CDK4 inhibitor to activate RB pathway and regulate cell cycle arrest and ASB14 is an important mediator of senescence maintenance. Taken together, our results suggest that RPL22 and ASB14 are important for cellular senescence and tumor suppression.

Le cancer de la prostate est la forme de cancer la plus fréquente et la troisième cause de décès par cancer chez l’homme dans les sociétés occidentales. Alors que la plupart des cancers de la prostate localisés sont éradiqués chirurgicalement, la plupart des tumeurs métastatiques répondant initialement aux thérapies par privation d’androgènes deviennent résistantes au traitement, causant généralement le décès du patient. Les gènes suppresseurs de tumeur PTEN et p53 étant fréquemment mutés dans les cancers de la prostate métastatiques et résistants à la castration, le laboratoire d’accueil a généré des modèles murins dans lesquels Pten et/ou Trp53 sont sélectivement invalidés à l’âge adulte dans les cellules épithéliales prostatiques dans le but de déterminer les évènements clés conduisant à la progression du cancer de la prostate. Notre étude révèle que l’invalidation de PTEN stimule la prolifération des cellules épithéliales prostatiques et conduit à des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux en quelques mois. Cette hyper-prolifération induit un stress réplicatif et une réponse aux dommages de l’ADN qui va conduire à un arrêt progressif de la croissance cellulaire et une entrée en sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent de nombreuses cytokines et de chimiokines, et peuvent accumuler des mutations contribuant ainsi à la progression de la tumeur. Il est notable qu’en l’absence de Trp53, les épithéliums prostatiques dépourvus de Pten développent des néoplasmes prostatiques intraépithéliaux entrant en sénescence. Cependant, la formation d’adénocarcinomes est accélérée et des tumeurs sarcomatoïdes pouvant générer à long terme des métastases apparaissent. En l’absence de Pten, certaines cellules épithéliales prostatiques perdent leur identité moléculaire en exprimant des marqueurs caractéristiques de cellules souches et différenciation neuroendocrinienne. Nous avons également mis en évidence des cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN et p53 résistantes à la castration exprimant à la fois des marqueurs de cellules basales et luminales. En conclusion, nos travaux ont permis une avancée dans la compréhension des mécanismes conduisant à des formes incurables de cancer de la prostate. Les traitements actuels ayant des effets secondaires importants et pouvant générer des résistances, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant l’élimination des cellules sénescentes mais aussi des cellules épithéliales prostatiques exprimant des marqueurs de cellules basales et luminales dans les lésions précancéreuses représente des perspectives intéressantes pour traiter le cancer de la prostate. / Prostate cancer (PCa) is a leading cause of male cancer death worldwide. While most locally PCa are curable, metastatic tumors initially respond to androgen deprivation therapy but ultimately relapse to castration-resistant prostate cancer (CRPC), which is a lethal disease. Since the tumor suppressor genes PTEN and p53 are frequently mutated in metastatic and CRPC, the host laboratory generated mouse models in which Pten and/or Trp53 are selectively ablated in adult prostatic epithelial cells (PECs) in order to unravel the key events leading to prostate cancer progression. Our study reveals that Pten ablation stimulates PECs proliferation forming prostatic intraepithelial neoplasia (PIN) within a few months. This hyper-proliferation induces replicative stress and a DNA damage response (DDR), which in turn leads to a progressive growth arrest with characteristics of cell senescence. As senescent cells secrete a large number of cytokines and chemokines, and can accumulate other mutations, they might contribute to tumor progression. Importantly, in the absence of Trp53, most Pten-null PECs develop PINs that enter senescence. However partial loss of PECs identity is detected as we show enhanced stemness and focal neuroendocrine differentiation of luminal Pten-null PECs. In some cases, adenocarcinoma and sarcomatoid tumors are formed, and more than one-third of the latter develop metastases. Strikingly, we also show formation of a castrate-resistant cell entity of both Pten and Pten/Trp53-null PECs sharing luminal and basal markers. Taken together, as current treaments lead to side effects and resistance, the development of therapeutic strategies to eliminate senescent cells/and or PECs expressing luminal and basal/stem progenitor in pre- cancerous lesions represents promising option for prostate cancer treatment.