Avaliamos as causas moleculares da deficiência de C3 ou de FI em 07 pacientes, chegando a caracterizar a causa molecular em cinco deles. As mutações encontradas em cada um dos pacientes foram: C3def3 - C364G troca Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, troca Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, troca Arg187Stop; FIdef6 e -7 - Inserção 1382<font face=\"Symbol\">DAT, códon de parada prematura 13 bases a montante. Além disso, analisamos se a ausência dessas proteínas levava a alterações na expressão gênica em fibroblastos de pele de pacientes deficientes de C3 ou de FI em relação a indivíduos normais e saudáveis através de ensaios com microarranjos de cDNA. Confirmamos uma tendência à alteração da expressão através de PCR em tempo real dos genes CHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B e MASP1 nos deficientes de C3; dos genes SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 e JAKMIP3 nos deficientes de FI e o gene ETV6 nos dois grupos de pacientes. Dessa forma, podemos sugerir que deficiências das proteínas C3 e FI podem possivelmente influenciar a expressão de outros genes neste tipo de célula. / We investigated C3 and Factor I deficiency in 07 patients and could characterize the molecular basis in five of them. The mutations found were: C3def3 - C364G change Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, change Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, change Arg187Stop; FIdef6 e -7 - insertion 1382<font face=\"Symbol\">DAT, Stop codon generation after 13 bp. Furthermore, we analyzed if the absence of these proteins cause alterations in gene expression profiles in skin fibroblasts from C3 and FI deficients compared to fibroblasts from normal individuals by cDNA microarrays. We confirmed a tendency of altered gene expression by Real Time PCR atCHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B and MASP1 genes on C3 deficients, SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 and JAKMIP3 on FI deficient and ETV6 gene in both groups. Thus, we concluded that C3 and FI deficiencies could affect gene expression profiles in skin fibroblasts.

O splicing alternativo é o processo pelo qual diversos transcritos podem ser gerados a partir de um único gene, sendo de extrema importância para diversidade do repertório transcricional e proteico. Diferentes variantes de splicing são expressas entre os diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento garantindo o funcionamento normal da célula, portanto, qualquer alteração neste padrão pode resultar no aparecimento de doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de metodologias para identificação de variantes de splicing em câncer de mama sob influência do oncogene ERBB2, o qual é um marcador de mau prognóstico altamente expresso em cerca de 30% dos tumores de mama. Foram estabelecidas duas estratégias para construção de bibliotecas de cDNA. A construção de bibliotecas de cDNA enriquecidas para splicing alternativo, baseada na formação e captura de moléculas de heteroduplexes em combinação com a amplificação de RNAm, foi realizada a partir de RNA total de linhagem celular de mama e a partir de um grupo de cinco amostras tumorais, todas com alta expressão de ERBB2. Foram identificadas 79 possíveis variantes de splicing alternativo em câncer de mama, das quais 18 foram selecionadas para validação por RT-PCR. Foi obtida uma taxa de vallidação de 94% e foram identificadas duas novas variantes de splicing alternativo. A regulação da expressão mediada por ERBB2 de três variantes de splicing foi confirmada por duas metodologias distintas, eletroforese em chip e estratégia baseada na ligação de sondas específicas, que revelou desbalanço de expressão entre as variantes, demonstrando a influência do oncogene na regulação de variantes de splicing. A segunda abordagem utilizada, foi a construção de bibliotecas de cDNA para avaliação do transcriptoma total, utilizando sequênciamento de alto desempenho. Foram utilizados RNA total de duas linhagens celulares de mama que diferem apenas na expressão do gene ERBB2. Foram identificadas 2.865 novas variantes de splicing, das quais 20, que reportaram a identificação de um novo éxon, foram selecionadas para validação, com uma taxa de validação de 90%. Seis destas variantes apresentaram aumento de expressão na linhagem com alta expressão de ERBB2. Além disso, foi detectado um enriquecimento de algumas categorias de variantes na linhagem celular com alta expressão de ERBB2, reforçando a influência do oncogene na regulação do splicing alternativo, podendo resultar em variantes de splicing associadas a este grupo de câncer de mama, que podem ser candidatas a marcadores moleculares. / Alternative splicing is a process, by which many differente transcripts can be generated by one single gene, significantly expanding the transcriptional and proteomic diversity. Different splicing variants are generated among different transcripts and developmental stages, assuring normal cell function. Therefore, alterations in the splicing process can lead to diseases outcome. In this context, the aim of this study was the establishment of methodologies for the identification of alternative splicing in breast cancer influenced by ERBB2 oncogene, which is a poor prognostic molecular marker, highly expressed in 30% of human breast cancer. Two strategies were established for the construction of cDNA libraries. Alternative enriched splicing libraries, based on heteroduplex capture combined with mRNA amplification, were constructed from total RNA from a cell line and also from five tumor samples, all of them presenting high ERBB2 expression. Seventy nine putative splicing variants were identified and 18 of them were selected for RT-PCR validation. A high validation level was obtained (94%) and two novel alternative splicing variants were identified. ERBB2 mediated regulation was confirmed for three variants by two distinct methodologies, electrophoresis on a chip and probe specific ligation approach. The alteration in the expression balance of variants suggests the influence of the oncogene in the splicing pattern regulation. The second strategy was the construction of cDNA libraries for global transcriptome analysis based on deep sequencing. Total RNA from two mammary epithelial cell lines expressing different ERBB2 levels were used and 2,865 novel splicing variants were identified. Twenty novel events reporting the inclusion of novel exons were selected for RT-PCR validation with 90% validation rate. Six variants presented higher expression in the cell line with high levels of ERBB2. Moreover enrichment in splicing events was detected in the ERBB2 high expressing cell line, supporting the ERBB2 influence in alternative splicing regulation, possibly resulting in splicing variants associated to this subgroup of cancer that can be tested as molecular markers.

Gramíneas cultivadas, como trigo, cevada e milho são produtos agrícolas de fundamental importância no Brasil. Entre os fatores causadores de perdas na produção de grãos dessas espécies estão os estresses causados por fitopatógenos como Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae Schw.), agente causador da fusariose e de difícil controle químico, biológico ou mesmo genético. Uma estratégia que tem se mostrado eficiente no controle de doenças é a utilização de microrganismos antagonistas a diferentes fitopatógenos, dentre os quais destaca-se a bactéria P. agglomerans. O presente trabalho teve como objetivo identificar genes diferencialmente expressos em interações fungo fitopatogênico-microrganismo antagonista, considerando como modelo o sistema F. graminearum-P. agglomerans. A construção de uma biblioteca de cDNA de F. graminearum cultivado in vitro proporcionou a geração de 1.983 seqüências válidas, resultando em 1.283 unigenes. As categorias de maior representatividade desta biblioteca foram aquelas constituídas por proteínas envolvidas em vias da informação genética - DNA-RNA-proteína (26 %); proteínas hipotéticas (24 %) e proteínas do metabolismo (16 %). Tanto a categoria de proteínas envolvidas nos processos de desenvolvimento como as envolvidas na percepção a estímulos externos constituíram 10 % dos unigenes. Dentre os genes presumivelmente anotados, foram identificados aqueles codificadores de enzimas de importantes rotas metabólicas como gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, fosfoglicerato quinases e fosfoenolpiruvato carboxilases, como também componentes produzidos pelo metabolismo secundário como micotoxinas e outras proteínas associadas a estresse e patogenicidade de fungos. Neste trabalho também foi verificado o potencial de antagonismo in vitro da bactéria P. agglomerans frente a três fitopatógenos de trigo: Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem e Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorok.) e F. graminearum. Foi verificado que a inibição do crescimento destes fungos está associada à liberação de compostos solúveis e voláteis pela bactéria, que foram responsáveis por cerca de 50 % e 40 % de inibição, respectivamente. O perfil da expressão gênica de F. graminearum na interação com a bactéria P. agglomerans foi avaliado via macroarranjo. Dos 1.014 genes avaliados, 29 genes de F. graminearum foram diferencialmente expressos (p < 0,05) durante a interação com a bactéria antagonista, sendo 19 genes induzidos e 10 genes reprimidos. Entre os transcritos induzidos foram identificadas proteínas envolvidas nos processos de defesa e/ou virulência de fungos, cuja expressão foi induzida em resposta a estresses tanto abióticos como bióticos. Dos genes que foram reprimidos, destacaram-se: um transcrito com similaridade a uma proteína com um domínio do tipo dedo de zinco ?zinc finger? que é um fator de transcrição importante no processo de divisão celular, bem como proteínas envolvidas na cadeia respiratória, na modulação protéica e sinalização celular. Os dados do macroarranjo foram validados via transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCRq), metodologia que se mostrou adequada para complementar a análise transcricional obtida por macroarranjo. As informações geradas na análise de antagonismo in vitro, bem como a análise e seqüenciamento dos transcritos, juntamente com a quantificação do nível de expressão na interação, foram fundamentais para compreender o padrão de resposta do fungo F. graminearum na interação com a bactéria P. agglomerans. / Cultivated grasses such as wheat, barley and maize are agricultural products of fundamental economic and social importance in Brazil. Among causing factors of important grain production losses in these species are diseases caused by phytopathogenic fungi such as Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae Schw.), the causal agent of fusariosis, a disease of difficult chemical, biological or even genetic control. An efficient and promising strategy to be adopted in order to protect cultivated plants against such diseases is the selection of antagonist microorganisms, amongst them the bacteria Pantoea agglomerans. This microbiota might have an important impact in scab control, isolated or in an integrated management program with chemical treatment. The present work aimed at identifying differentially expressed sequences in pathogenic fungi-antagonistic microorganisms interactions, considering the F. graminearum ? P. agglomerans model. The construction of a cDNA library for F. graminearum grown in PDA medium generated 1,983 valid sequences and provided 1,283 unigenes. The most representative categories in this library were proteins involved in genetic information pathways, DNA-RNA-protein (26 %); hypothetical proteins (24 %); and proteins involved in metabolism (16 %). The protein category involved in developmental processes as well as those related to external stimuli perception comprised 10 % of the obtained unigenes. Among putatively annotated genes, some coding for enzymes of important metabolic routes were identified, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase and phophoenolpyruvate carboxylase. Also secondary metabolism compounds, specially micotoxins and proteins related to fungi stresses and pathogenicity were identified. In the present work, the control of three wheat phytopathogens, Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem, Bipolaris sorokiniana (Sacc.in Sorok.) and F. graminearum, using specific isolates of P. agglomerans was demonstrated. It was observed that the 50 % and 40 % growth inhibition of these fungi is associated to the bacteria release of soluble and volatile compounds, respectively. The gene expression profile of F. graminearum during interaction with the bacteria P. agglomerans was evaluated via macroarray. Among the 1,014 analysed genes, 29 F. graminearum genes were differentially expressed (p < 0,05) during its interaction with the antagonist bacteria: 19 genes were induced while 10 genes were repressed. Among the induced transcripts, proteins involved in fungi defense and/or virulence processes were identified, whose expression was induced in reponse to abiotic or biotic stresses. Among the identified repressed genes, a transcript similar to a protein containing a zinc finger-type domain, a transcription factor relevant in cell division, deserves special attention, as well as proteins involved in respiratory chain, in protein modulation and in cell signaling. Additionally, the macroarray data were validated by reverse transcription followed by real-time quantitative PCR (RT-PCRq), a suitable method for complementing transcriptional analysis through macroarray. Finally, the information generated in in vitro pathogenic fungi-antagonistic microorganisms interactions analysis, as well as in the analysis and sequencing of the obtained transcripts, together with the determination of the level of expression during the evaluated interactions were essential for better understanding the response pattern of the fungus F. graminearum in interaction with the bacteria P. agglomerans

Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). / This work shows purification of an apyrase from the tegument membrane of S. mansoni adult worms that exhibited an ADP/ATP hydrolysis ratio near 2. MALDI-TOF analyses showed that helicase and carboxylesterase were present in the sample, however in the literature there is no ADPase activity described for either enzyme. Western blot analyses showed that the purified apyrase ha no epitopes common to members of the CD39 apyrase family. On the other hand, a CD39-like apyrase remained in the insoluble fraction that was not used in the purification procedures. This work studied the construction of cDNA libraries with Hybrid Consensus-degenerate Oligonucleotide Primers (40bp) and low stringency RT-PCR. Introduction of touch-down PCR in the standard ORESTES technique improved the number of non-redundant sequences per library twofold. Association of touch-down with hybrid consensus-degenerated oligonucleotide primers increased this number to 300 sequences per library. The modifications resulted in a 10-fold decrease in the amount of work required for libraries construction and high-throughput sequencing (Fietto et al., 2000; addendum to patent application #196,716 - Ludwig Institute for Cancer Research). The best amplification profiles were obtained in RT-PCR reactions with low salt and a slow temperature ramp. Libraries made with shorter hybrid primers (25bp) showed more redundant sequences, reflecting a higher specificity for few templates. These shorter primers were used in combination with tegument mRNA to clone a gene fragment homologous to CD39 of mouse. This sequence was used in RACE-PCR reactions (rapid amplification of cDNA ends) to clone a 2.9 Kb cDNA corresponding to most of the predicted coding sequence of the Schistosoma gene.

O timo é um órgão complexo estruturado por um estroma, o qual é formado principalmente por células epiteliais corticais (cTECs) e por células epiteliais medulares (mTECs) além de outros tipos celulares como células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos B e fibroblastos. Além disso, os precursores das células T originados da medula óssea chegam ao timo (timócitos) se maturando em linfócitos T, os quais migram para a periferia. O timo é, portanto, o local de eventos muito importantes durante a maturação do sistema imune, incluindo o controle de sua própria homeostase. No presente estudo, procuramos retratar as principais características do timo por meio da análise da expressão gênica em grande escala, isto é, descrevendo parte de seu transcriptoma. Fizemos uso da tecnologia dos cDNA microarrays em duas versões. Na primeira delas utilizamos cDNA microarrays construídos em lâminas de vidro e sondas fluorescentes marcadas com fluorocromos Cy3 ou Cy5 e, na segunda versão utilizamos cDNA microarrays em membranas de náilon e sondas radioativas marcadas com o isótopo 33P. Para a análise dos dados, utilizamos programas de bioinformática dedicados, tais como o SAM (Significance analysis of microarrays) e o Cluster e TreeView. Três conjuntos de resultados foram possíveis. No primeiro conjunto observamos a ocorrência da expressão gênica promíscua (PGE) de antígenos de tecidos/órgãos parenquimatosos (TSAs), demarcando sua emergência temporal durante a ontogenia do timo murino, a qual é influenciada pelo background genético das linhagens isogênicas estudadas. A ocorrência da PGE no timo é associada às bases genético-moleculares da indução de tolerância imunológica nas células T, contribuindo com a prevenção da auto-imunidade. O segundo conjunto de resultados consistiu na análise da expressão gênica do timo de camundongos nocautes (KO) envolvendo genes importantes para a maturação das células T, tais como TCR?, LAT, Rel-b, RAG-1 e CD3?, possibilitando a observação de seus efeitos na regulação da transcrição neste órgão. Finalmente, o terceiro conjunto consistiu na definição da dissecação molecular virtual do timo. Por meio de perfis de expressão gênica particulares exibidos por cada tipo principal que povoa o timo, foi possível dissecar este órgão usando a tecnologia dos cDNA microarrays. / The thymus is a complex organ structured by a stroma, which is formed mainly by cortical epithelial cells (cTECs) and medullary epithelial cells (mTECs) besides of other cell types such as dendritic cells (DC), macrophages, B lymphocytes and fibroblasts. Moreover, the T cell precursors arising from the bone marrow reach the thymus (thymocytes) maturing in T lymphocytes, which migrate to the periphery. Thus, the thymus is the place of very important events during the maturation of the immune system, including the control of their own homeostasis. In the present study, we search to picture the main characteristics of the thymus by means of the large scale gene expression analysis that is, describing part of their transcriptome. We made use of the cDNA microarray technology in two versions. In the first one we used cDNA microarrays constructed on glass slides and fluorescent probes labeled with the fluorochromes Cy3 or Cy5 and in the second version we used cDNA microarrays on nylon membranes and radioactive probes labeled with 33P isotope. To data analysis we used dedicated bioinformatics programs, such as SAM (significance analysis of microarrays) and Cluster-Tree View. Three sets of results were possible. In the first set we observed the occurrence of the promiscuous gene expression (PGE) of parenchymal tissue/organ specific antigens (TSAs), demarking their temporal emergence during the murine thymus ontogeny, which is influenced by the genetic background of the inbred strains studied. The occurrence of PGE in the thymus is associated to the molecular-genetics basis of the immune tolerance of T cells, contributing with the prevention of autoimmunity. The second set of results consisted in the analysis of gene expression of thymus from knockout mice (KO) involving genes important for T cell maturation, such as TCR?, LAT, Relb, RAG-1 and CD3?, allowing the observation of its effects on the transcription regulation in this organ. Finally, the third set consisted in the definition of the virtual molecular dissection of the thymus. By means of particular gene expression profiling featured by each main cell type populating the thymus, it was possible to dissect this organ using the cDNA microarray technology.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA068.pdf: 13593 bytes, checksum: bb2118cc19310d22381d61f71c63aee7 (MD5) Previous issue date: 2011-06-01 / The mitochondrial enzyme Glutamate Dehydrogenase (GDH: EC 1.4.1.2) catalyzes the reversible deamination of the L-glutamate for 2-oxoglutarate (&#945;-ketoglutarate) using NAD+ and NADP+ as coenzymes. It is a complex allosteric enzyme that consists of six identical subunits being its activity influenced by both, the ADP its positive modulator, and by the GTP, its negative modulator.It is one of the most important liver enzymes found in hepatocytes of cattle, sheep and goats. Infections by Fasciola spp or severe acute intoxication by toxins of plants such as Xanthium spp and Senecio spp as well as intoxication by copper result in the release of this enzyme in blood. The increase of the GDH indicates damage or hepatic necrosis in cattle and sheep. This is an enzyme of choice to evaluate the function of the ruminants. In the present study the cDNA, that codifies the GDH enzyme of the hepatocyte of sheep, was synthesized by means of the RT-PCR making use of mRNA extracted from the liver of sheep. Part of the region where the cDNA of the GDH of the ovine is codified was amplified by PCR from primers synthesized through the comparison of the aligned sequences of Ovis aries with those of the Bos taurus,. Homo sapiens, Rattus norvegicus and Mus musculus available in the database, where highly conserved regions, as well as variable regions were identified.The cDNA was cloned in the vector pGEM®-T Easy Vector Systems and inserted in competent cells of the Escherichia coli DH10B by means heat shock. The plasmid DNA was purified and after sequencing, the presence of an insert of 1292 pb was confirmed. The alignment of the sequence deduced of amino acid with other species revealed high homology among the GDH / A enzima mitocondrial Glutamato Desidrogenase (GDH : EC 1.4.1.2) catalisa a desaminação reversível do L- glutamato para 2-oxoglutarato (&#945;-cetoglutarato) usando o NAD+ e NADP+ como coenzimas . É uma enzima alostérica complexa que consiste em seis subunidades idênticas sendo sua atividade influenciada tanto pelo ADP, seu modelador positivo, como pelo GTP, seu modelador negativo. É uma das mais importantes enzimas hepáticas encontradas em hepatócitos de bovinos, ovinos e caprinos. Infecções por Fasciola spp ou intoxicação grave aguda por toxinas de plantas tais como Xanthium spp e Senecio spp e intoxicação por cobre resultam na liberação dessa enzima no sangue. O aumento da GDH indica danos ou necrose hepática em bovinos e ovinos. Esta é a enzima de escolha para avaliar a função hepática dos ruminantes. No presente trabalho o cDNA que codifica a enzima GDH do hepatócito de ovino foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando mRNA extraído do fígado de ovino. Parte da região de codificação do cDNA da GDH de ovino foi amplificada por PCR a partir de oligonucleotídeos iniciadores sintetizados através da comparação das sequências alinhadas de Ovis aries com de Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus e Mus musculus disponíveis em banco de dados, onde foram identificadas regiões bastante conservadas e regiões variáveis. O cDNA foi clonado no vetor pGEM® -T Easy Vector Systems e inserido em células competentes de Escherichia coli DH10B através de choque térmico. O DNA plasmidial foi purificado e após o sequenciamento a presença de um inserto de 1292 pb foi confirmado. O alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos com outras espécies revelou alta homologia entre as GDH

Gramíneas cultivadas, como trigo, cevada e milho são produtos agrícolas de fundamental importância no Brasil. Entre os fatores causadores de perdas na produção de grãos dessas espécies estão os estresses causados por fitopatógenos como Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae Schw.), agente causador da fusariose e de difícil controle químico, biológico ou mesmo genético. Uma estratégia que tem se mostrado eficiente no controle de doenças é a utilização de microrganismos antagonistas a diferentes fitopatógenos, dentre os quais destaca-se a bactéria P. agglomerans. O presente trabalho teve como objetivo identificar genes diferencialmente expressos em interações fungo fitopatogênico-microrganismo antagonista, considerando como modelo o sistema F. graminearum-P. agglomerans. A construção de uma biblioteca de cDNA de F. graminearum cultivado in vitro proporcionou a geração de 1.983 seqüências válidas, resultando em 1.283 unigenes. As categorias de maior representatividade desta biblioteca foram aquelas constituídas por proteínas envolvidas em vias da informação genética - DNA-RNA-proteína (26 %); proteínas hipotéticas (24 %) e proteínas do metabolismo (16 %). Tanto a categoria de proteínas envolvidas nos processos de desenvolvimento como as envolvidas na percepção a estímulos externos constituíram 10 % dos unigenes. Dentre os genes presumivelmente anotados, foram identificados aqueles codificadores de enzimas de importantes rotas metabólicas como gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, fosfoglicerato quinases e fosfoenolpiruvato carboxilases, como também componentes produzidos pelo metabolismo secundário como micotoxinas e outras proteínas associadas a estresse e patogenicidade de fungos. Neste trabalho também foi verificado o potencial de antagonismo in vitro da bactéria P. agglomerans frente a três fitopatógenos de trigo: Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem e Bipolaris sorokiniana (Sacc. in Sorok.) e F. graminearum. Foi verificado que a inibição do crescimento destes fungos está associada à liberação de compostos solúveis e voláteis pela bactéria, que foram responsáveis por cerca de 50 % e 40 % de inibição, respectivamente. O perfil da expressão gênica de F. graminearum na interação com a bactéria P. agglomerans foi avaliado via macroarranjo. Dos 1.014 genes avaliados, 29 genes de F. graminearum foram diferencialmente expressos (p < 0,05) durante a interação com a bactéria antagonista, sendo 19 genes induzidos e 10 genes reprimidos. Entre os transcritos induzidos foram identificadas proteínas envolvidas nos processos de defesa e/ou virulência de fungos, cuja expressão foi induzida em resposta a estresses tanto abióticos como bióticos. Dos genes que foram reprimidos, destacaram-se: um transcrito com similaridade a uma proteína com um domínio do tipo dedo de zinco ?zinc finger? que é um fator de transcrição importante no processo de divisão celular, bem como proteínas envolvidas na cadeia respiratória, na modulação protéica e sinalização celular. Os dados do macroarranjo foram validados via transcrição reversa seguida de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCRq), metodologia que se mostrou adequada para complementar a análise transcricional obtida por macroarranjo. As informações geradas na análise de antagonismo in vitro, bem como a análise e seqüenciamento dos transcritos, juntamente com a quantificação do nível de expressão na interação, foram fundamentais para compreender o padrão de resposta do fungo F. graminearum na interação com a bactéria P. agglomerans. / Cultivated grasses such as wheat, barley and maize are agricultural products of fundamental economic and social importance in Brazil. Among causing factors of important grain production losses in these species are diseases caused by phytopathogenic fungi such as Fusarium graminearum Schwabe (teleomorfo Gibberella zeae Schw.), the causal agent of fusariosis, a disease of difficult chemical, biological or even genetic control. An efficient and promising strategy to be adopted in order to protect cultivated plants against such diseases is the selection of antagonist microorganisms, amongst them the bacteria Pantoea agglomerans. This microbiota might have an important impact in scab control, isolated or in an integrated management program with chemical treatment. The present work aimed at identifying differentially expressed sequences in pathogenic fungi-antagonistic microorganisms interactions, considering the F. graminearum ? P. agglomerans model. The construction of a cDNA library for F. graminearum grown in PDA medium generated 1,983 valid sequences and provided 1,283 unigenes. The most representative categories in this library were proteins involved in genetic information pathways, DNA-RNA-protein (26 %); hypothetical proteins (24 %); and proteins involved in metabolism (16 %). The protein category involved in developmental processes as well as those related to external stimuli perception comprised 10 % of the obtained unigenes. Among putatively annotated genes, some coding for enzymes of important metabolic routes were identified, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, phosphoglycerate kinase and phophoenolpyruvate carboxylase. Also secondary metabolism compounds, specially micotoxins and proteins related to fungi stresses and pathogenicity were identified. In the present work, the control of three wheat phytopathogens, Drechslera tritici-repentis (Died.) Shoem, Bipolaris sorokiniana (Sacc.in Sorok.) and F. graminearum, using specific isolates of P. agglomerans was demonstrated. It was observed that the 50 % and 40 % growth inhibition of these fungi is associated to the bacteria release of soluble and volatile compounds, respectively. The gene expression profile of F. graminearum during interaction with the bacteria P. agglomerans was evaluated via macroarray. Among the 1,014 analysed genes, 29 F. graminearum genes were differentially expressed (p < 0,05) during its interaction with the antagonist bacteria: 19 genes were induced while 10 genes were repressed. Among the induced transcripts, proteins involved in fungi defense and/or virulence processes were identified, whose expression was induced in reponse to abiotic or biotic stresses. Among the identified repressed genes, a transcript similar to a protein containing a zinc finger-type domain, a transcription factor relevant in cell division, deserves special attention, as well as proteins involved in respiratory chain, in protein modulation and in cell signaling. Additionally, the macroarray data were validated by reverse transcription followed by real-time quantitative PCR (RT-PCRq), a suitable method for complementing transcriptional analysis through macroarray. Finally, the information generated in in vitro pathogenic fungi-antagonistic microorganisms interactions analysis, as well as in the analysis and sequencing of the obtained transcripts, together with the determination of the level of expression during the evaluated interactions were essential for better understanding the response pattern of the fungus F. graminearum in interaction with the bacteria P. agglomerans

Avaliamos as causas moleculares da deficiência de C3 ou de FI em 07 pacientes, chegando a caracterizar a causa molecular em cinco deles. As mutações encontradas em cada um dos pacientes foram: C3def3 - C364G troca Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, troca Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, troca Arg187Stop; FIdef6 e -7 - Inserção 1382<font face=\"Symbol\">DAT, códon de parada prematura 13 bases a montante. Além disso, analisamos se a ausência dessas proteínas levava a alterações na expressão gênica em fibroblastos de pele de pacientes deficientes de C3 ou de FI em relação a indivíduos normais e saudáveis através de ensaios com microarranjos de cDNA. Confirmamos uma tendência à alteração da expressão através de PCR em tempo real dos genes CHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B e MASP1 nos deficientes de C3; dos genes SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 e JAKMIP3 nos deficientes de FI e o gene ETV6 nos dois grupos de pacientes. Dessa forma, podemos sugerir que deficiências das proteínas C3 e FI podem possivelmente influenciar a expressão de outros genes neste tipo de célula. / We investigated C3 and Factor I deficiency in 07 patients and could characterize the molecular basis in five of them. The mutations found were: C3def3 - C364G change Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, change Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, change Arg187Stop; FIdef6 e -7 - insertion 1382<font face=\"Symbol\">DAT, Stop codon generation after 13 bp. Furthermore, we analyzed if the absence of these proteins cause alterations in gene expression profiles in skin fibroblasts from C3 and FI deficients compared to fibroblasts from normal individuals by cDNA microarrays. We confirmed a tendency of altered gene expression by Real Time PCR atCHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B and MASP1 genes on C3 deficients, SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 and JAKMIP3 on FI deficient and ETV6 gene in both groups. Thus, we concluded that C3 and FI deficiencies could affect gene expression profiles in skin fibroblasts.

O timo é um órgão complexo estruturado por um estroma, o qual é formado principalmente por células epiteliais corticais (cTECs) e por células epiteliais medulares (mTECs) além de outros tipos celulares como células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos B e fibroblastos. Além disso, os precursores das células T originados da medula óssea chegam ao timo (timócitos) se maturando em linfócitos T, os quais migram para a periferia. O timo é, portanto, o local de eventos muito importantes durante a maturação do sistema imune, incluindo o controle de sua própria homeostase. No presente estudo, procuramos retratar as principais características do timo por meio da análise da expressão gênica em grande escala, isto é, descrevendo parte de seu transcriptoma. Fizemos uso da tecnologia dos cDNA microarrays em duas versões. Na primeira delas utilizamos cDNA microarrays construídos em lâminas de vidro e sondas fluorescentes marcadas com fluorocromos Cy3 ou Cy5 e, na segunda versão utilizamos cDNA microarrays em membranas de náilon e sondas radioativas marcadas com o isótopo 33P. Para a análise dos dados, utilizamos programas de bioinformática dedicados, tais como o SAM (Significance analysis of microarrays) e o Cluster e TreeView. Três conjuntos de resultados foram possíveis. No primeiro conjunto observamos a ocorrência da expressão gênica promíscua (PGE) de antígenos de tecidos/órgãos parenquimatosos (TSAs), demarcando sua emergência temporal durante a ontogenia do timo murino, a qual é influenciada pelo background genético das linhagens isogênicas estudadas. A ocorrência da PGE no timo é associada às bases genético-moleculares da indução de tolerância imunológica nas células T, contribuindo com a prevenção da auto-imunidade. O segundo conjunto de resultados consistiu na análise da expressão gênica do timo de camundongos nocautes (KO) envolvendo genes importantes para a maturação das células T, tais como TCR?, LAT, Rel-b, RAG-1 e CD3?, possibilitando a observação de seus efeitos na regulação da transcrição neste órgão. Finalmente, o terceiro conjunto consistiu na definição da dissecação molecular virtual do timo. Por meio de perfis de expressão gênica particulares exibidos por cada tipo principal que povoa o timo, foi possível dissecar este órgão usando a tecnologia dos cDNA microarrays. / The thymus is a complex organ structured by a stroma, which is formed mainly by cortical epithelial cells (cTECs) and medullary epithelial cells (mTECs) besides of other cell types such as dendritic cells (DC), macrophages, B lymphocytes and fibroblasts. Moreover, the T cell precursors arising from the bone marrow reach the thymus (thymocytes) maturing in T lymphocytes, which migrate to the periphery. Thus, the thymus is the place of very important events during the maturation of the immune system, including the control of their own homeostasis. In the present study, we search to picture the main characteristics of the thymus by means of the large scale gene expression analysis that is, describing part of their transcriptome. We made use of the cDNA microarray technology in two versions. In the first one we used cDNA microarrays constructed on glass slides and fluorescent probes labeled with the fluorochromes Cy3 or Cy5 and in the second version we used cDNA microarrays on nylon membranes and radioactive probes labeled with 33P isotope. To data analysis we used dedicated bioinformatics programs, such as SAM (significance analysis of microarrays) and Cluster-Tree View. Three sets of results were possible. In the first set we observed the occurrence of the promiscuous gene expression (PGE) of parenchymal tissue/organ specific antigens (TSAs), demarking their temporal emergence during the murine thymus ontogeny, which is influenced by the genetic background of the inbred strains studied. The occurrence of PGE in the thymus is associated to the molecular-genetics basis of the immune tolerance of T cells, contributing with the prevention of autoimmunity. The second set of results consisted in the analysis of gene expression of thymus from knockout mice (KO) involving genes important for T cell maturation, such as TCR?, LAT, Relb, RAG-1 and CD3?, allowing the observation of its effects on the transcription regulation in this organ. Finally, the third set consisted in the definition of the virtual molecular dissection of the thymus. By means of particular gene expression profiling featured by each main cell type populating the thymus, it was possible to dissect this organ using the cDNA microarray technology.

O splicing alternativo é o processo pelo qual diversos transcritos podem ser gerados a partir de um único gene, sendo de extrema importância para diversidade do repertório transcricional e proteico. Diferentes variantes de splicing são expressas entre os diferentes tecidos e estágios de desenvolvimento garantindo o funcionamento normal da célula, portanto, qualquer alteração neste padrão pode resultar no aparecimento de doenças. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de metodologias para identificação de variantes de splicing em câncer de mama sob influência do oncogene ERBB2, o qual é um marcador de mau prognóstico altamente expresso em cerca de 30% dos tumores de mama. Foram estabelecidas duas estratégias para construção de bibliotecas de cDNA. A construção de bibliotecas de cDNA enriquecidas para splicing alternativo, baseada na formação e captura de moléculas de heteroduplexes em combinação com a amplificação de RNAm, foi realizada a partir de RNA total de linhagem celular de mama e a partir de um grupo de cinco amostras tumorais, todas com alta expressão de ERBB2. Foram identificadas 79 possíveis variantes de splicing alternativo em câncer de mama, das quais 18 foram selecionadas para validação por RT-PCR. Foi obtida uma taxa de vallidação de 94% e foram identificadas duas novas variantes de splicing alternativo. A regulação da expressão mediada por ERBB2 de três variantes de splicing foi confirmada por duas metodologias distintas, eletroforese em chip e estratégia baseada na ligação de sondas específicas, que revelou desbalanço de expressão entre as variantes, demonstrando a influência do oncogene na regulação de variantes de splicing. A segunda abordagem utilizada, foi a construção de bibliotecas de cDNA para avaliação do transcriptoma total, utilizando sequênciamento de alto desempenho. Foram utilizados RNA total de duas linhagens celulares de mama que diferem apenas na expressão do gene ERBB2. Foram identificadas 2.865 novas variantes de splicing, das quais 20, que reportaram a identificação de um novo éxon, foram selecionadas para validação, com uma taxa de validação de 90%. Seis destas variantes apresentaram aumento de expressão na linhagem com alta expressão de ERBB2. Além disso, foi detectado um enriquecimento de algumas categorias de variantes na linhagem celular com alta expressão de ERBB2, reforçando a influência do oncogene na regulação do splicing alternativo, podendo resultar em variantes de splicing associadas a este grupo de câncer de mama, que podem ser candidatas a marcadores moleculares. / Alternative splicing is a process, by which many differente transcripts can be generated by one single gene, significantly expanding the transcriptional and proteomic diversity. Different splicing variants are generated among different transcripts and developmental stages, assuring normal cell function. Therefore, alterations in the splicing process can lead to diseases outcome. In this context, the aim of this study was the establishment of methodologies for the identification of alternative splicing in breast cancer influenced by ERBB2 oncogene, which is a poor prognostic molecular marker, highly expressed in 30% of human breast cancer. Two strategies were established for the construction of cDNA libraries. Alternative enriched splicing libraries, based on heteroduplex capture combined with mRNA amplification, were constructed from total RNA from a cell line and also from five tumor samples, all of them presenting high ERBB2 expression. Seventy nine putative splicing variants were identified and 18 of them were selected for RT-PCR validation. A high validation level was obtained (94%) and two novel alternative splicing variants were identified. ERBB2 mediated regulation was confirmed for three variants by two distinct methodologies, electrophoresis on a chip and probe specific ligation approach. The alteration in the expression balance of variants suggests the influence of the oncogene in the splicing pattern regulation. The second strategy was the construction of cDNA libraries for global transcriptome analysis based on deep sequencing. Total RNA from two mammary epithelial cell lines expressing different ERBB2 levels were used and 2,865 novel splicing variants were identified. Twenty novel events reporting the inclusion of novel exons were selected for RT-PCR validation with 90% validation rate. Six variants presented higher expression in the cell line with high levels of ERBB2. Moreover enrichment in splicing events was detected in the ERBB2 high expressing cell line, supporting the ERBB2 influence in alternative splicing regulation, possibly resulting in splicing variants associated to this subgroup of cancer that can be tested as molecular markers.