Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

O ciclo de divisão celular compreende uma seqüência de fenômenos controlados por una complexa rede de regulação gênica muito estável e robusta. Aplicamos as Redes Genéticas Probabilísticas (PGNs) para construir um modelo cuja dinâmica e robustez se assemelham às observadas no ciclo celular biológico. A estrutura de nosso modelo PGN foi inspirada em fatos biológicos bem estabelecidos tais como a existência de subsistemas integradores, realimentação negativa e positiva e caminhos de sinalização redundantes. Nosso modelo representa as interações entre genes como processos estocásticos e apresenta uma forte robustez na presença de ruido e variações moderadas dos parâmetros. Um modelo determinístico recentemente publicado do ciclo celular da levedura não resiste a condições de ruido que nosso modelo suporta bem. A adição de mecanismos de auto excitação, permite a nosso modelo apresentar uma atividade oscilatória similar à observada no ciclo celular embrionário. Nossa abordagem de modelar e simular o comportamento observado usando mecanismos de controle biológico conhecidos fornece hipóteses plausíveis de como a regulação subjacente pode ser realizada na célula. A pesquisa atualmente em curso procura identificar tais mecanismos de regulação no ciclo celular da levedura, usando dados de expressão gênica provenientes de medições seqüenciais de microarray. / The cell division cycle comprises a sequence of phenomena controlled by a stable and robust genetic network. We applied a Probabilistic Genetic Network (PGN) to construct an hypothetical model with dynamical behaviour and robustness typical of the biological cell-cycle. The structure of our PGN model was inspired in well established biological facts such as the existence of integrator subsystems, negative and positive feedback loops and redundant signaling pathways. Our model represents genes\' interactions as stochastic processes and presents strong robustness in the presence of moderate noise and parameters fluctuations. A recently published deterministic yeast cell-cycle model collapses upon noise conditions that our PGN model supports well. In addition, self stimulatory mechanisms can give our PGN model the possibility of having a pacemaker activity similar to the observed in the oscillatory embryonic cell cycle. Our approach of modeling and simulating the observed behavior by known biological control mechanisms provides plausible hypotheses of how the underlying regulation may be performed in the cell. The ongoing research is lead to identify such regulation mechanisms in the yeast cell-cycle from time-series microarray gene expression data.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

O ciclo de divisão celular compreende uma seqüência de fenômenos controlados por una complexa rede de regulação gênica muito estável e robusta. Aplicamos as Redes Genéticas Probabilísticas (PGNs) para construir um modelo cuja dinâmica e robustez se assemelham às observadas no ciclo celular biológico. A estrutura de nosso modelo PGN foi inspirada em fatos biológicos bem estabelecidos tais como a existência de subsistemas integradores, realimentação negativa e positiva e caminhos de sinalização redundantes. Nosso modelo representa as interações entre genes como processos estocásticos e apresenta uma forte robustez na presença de ruido e variações moderadas dos parâmetros. Um modelo determinístico recentemente publicado do ciclo celular da levedura não resiste a condições de ruido que nosso modelo suporta bem. A adição de mecanismos de auto excitação, permite a nosso modelo apresentar uma atividade oscilatória similar à observada no ciclo celular embrionário. Nossa abordagem de modelar e simular o comportamento observado usando mecanismos de controle biológico conhecidos fornece hipóteses plausíveis de como a regulação subjacente pode ser realizada na célula. A pesquisa atualmente em curso procura identificar tais mecanismos de regulação no ciclo celular da levedura, usando dados de expressão gênica provenientes de medições seqüenciais de microarray. / The cell division cycle comprises a sequence of phenomena controlled by a stable and robust genetic network. We applied a Probabilistic Genetic Network (PGN) to construct an hypothetical model with dynamical behaviour and robustness typical of the biological cell-cycle. The structure of our PGN model was inspired in well established biological facts such as the existence of integrator subsystems, negative and positive feedback loops and redundant signaling pathways. Our model represents genes\' interactions as stochastic processes and presents strong robustness in the presence of moderate noise and parameters fluctuations. A recently published deterministic yeast cell-cycle model collapses upon noise conditions that our PGN model supports well. In addition, self stimulatory mechanisms can give our PGN model the possibility of having a pacemaker activity similar to the observed in the oscillatory embryonic cell cycle. Our approach of modeling and simulating the observed behavior by known biological control mechanisms provides plausible hypotheses of how the underlying regulation may be performed in the cell. The ongoing research is lead to identify such regulation mechanisms in the yeast cell-cycle from time-series microarray gene expression data.

Der transformierende Wachstumsfaktor-β (TGFβ) übt verschiedene Wirkungen auf die Regulierung zahlreicher biologischer Prozesse aus. Insbesondere die zytostatische Wirkung von TGFβ ist wichtig, um die Homöostase in Geweben aufrechtzuerhalten und proliferative Störungen, wie in Krebs, zu verhindern. Frühere Studien zur Regulation des Zellzyklus mit TGFβ wurden auf Populationsebene, oft durch physikalische oder chemische Synchronisation durchgeführt. Dabei wird die Heterogenität auf zellulärer Ebene vernachlässigt und die Anfälligkeit gegen potenzielle Artefakte erhöht. Um zu verstehen, wie einzelne Zellen TGFβ-Signale entschlüsseln und diese in die Entscheidung zur Zellproliferation integrieren, wurden sowohl die Dynamik der TGFβ-Signale als auch die Zellzyklusprogression in asynchronen Zellen durch „Live Cell Imaging“ quantifiziert. In Kombination von experimentellen und theoretischen Studien wurde gezeigt, dass TGFβ einen „Alles-oder-Nichts-G1- Stillstand“ auslöst, der sowohl dosisabhängig als auch phasenabhängig ist. Wenn die Zellen während der S / G2 / M-Phase TGFβ ausgesetzt werden, erfahren sie in der darauf folgenden G1-Phase einen ererbten, verzögerten Stillstand. Zusätzlich sind die Zellen nach einem TGFβ-Stimulationsimpuls für weitere TGFβ-Behandlungen unempfindlich. In Anbetracht der Bedeutung von Einzelzellinformationen und den Herausforderungen bei der automatischen Zellverfolgung wurde ein Rahmenkonzept von „Population to Single Cell“ (P2S-Framework) erarbeitet, um von der Populationsdynamik auf die Abstammung einzelner Zellen zu schließen. Zusammengefasst bietet diese Arbeit neue Einblicke in Strategien zur Kontrolle der Zellproliferation durch Manipulation der TGFβ-Signalgebung. / The transforming growth factor-β (TGFβ) exerts diverse effects on regulating numerous biological processes. Especially, the cytostatic effect of TGFβ is important for maintaining tissue homeostasis and preventing proliferative disorders, like cancer. Previous studies on the regulation of cell cycle by TGFβ were conducted at the population level, and often through physical or chemical synchronization, which neglected cellular heterogeneity and might introduce artifacts. To understand how individual cells decode and integrate TGFβ signals into cell proliferation decisions, we quantitatively characterized both TGFβ signaling dynamics and cell cycle progression in asynchronous cells by live cell imaging. Combining experimental and theoretical studies, we demonstrated that TGFβ triggers all-or-none G1 arrest, which is both dose-dependent and phase- dependent. When exposed to TGFβ during S/G2/M phase, cells undergo an inherited, delayed arrest at the next G1 phase. In addition, after one pulse of TGFβ stimulation, cells are refractory to further TGFβ treatments. Considering the importance of single cell information and challenges in automatic cell tracking, we proposed a Population to Single cell framework (P2S framework) to infer single- cell lineages from population dynamics. Taken together, this work provides new insight into strategies to control cell proliferation by manipulating TGFβ signaling.

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O Vírus Polioma (Py), induz a formação de múltiplos tumores em camundongos, e causa transformação maligna em cultura, levando à menor dependência de soro e ancoragem para crescimento. Dentre as proteínas codificadas pelo vírus polioma, o antígeno MT (Middle T), isoladamente, é capaz de transformar linhagens celulares imortalizadas e gerar tumores quando injetadas em camundongos, sendo que este caráter transformante está relacionado à sua capacidade de se ligar e modular a atividade de diversas proteínas, muitas das quais relacionadas com o controle do ciclo celular. Para melhor compreender os mecanismos moleculares da transformação maligna mediada por MT e do controle do ciclo celular, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar novas vias de transdução de sinal e novos genes regulados por MT. Para a busca de genes regulados pela atividade de MT, comparou- se o perfil da expressão gênica da linhagem que expressa MT (MTWT) com o da linhagem controle (PLJ) através de três metodologias: membranas de nylon comerciais (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), bibliotecas subtrativas de cDNA construídas através da técnica de RDA (Análise de Diferença Representacional) e lâminas comercias de microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). As três metodologias permitiram a identificação de cerca de 1.200 genes-candidatos a serem regulados por MT, dos quais 84 genes foram selecionados para terem sua expressão diferencial analisada por Real-Time PCR. Para identificar possíveis vias de transdução de sinal relacionadas à regulação dos genes analisados utilizou-se, como template, além do cDNA proveniente das linhagens PLJ e MTWT, cDNAs de linhagens que expressam a proteína MT mutada nas tirosinas 315, 322, 250 e 315/322. Após confirmação por Real-Time PCR, dois genes foram selecionados para analise funcional: Dlk1 (Delta Like-1 homolog) que, apesar de não ter relação direta com o controle do ciclo celular, está ligado à formação de alguns tumores, e MN1 (Meningioma 1), um gene pouco caracterizado que já foi relacionado à formação de leucemias mielóides e meningiomas. - I - RESUMO Para caracterizar o papel de MN1 na linhagem PLJ, foram geradas linhagens PLJ que superexpressam RNAi de MN1. A análise dos parâmetros de crescimento, em substrato sólido e semi-sólido, da linhagem PLJ parental e PLJ expressando o RNAi de MN1 não apresentou alterações estatisticamente significativas. Para o estudo do efeito de Dlk1 na transformação mediada por MT, foram geradas linhagens MTWT que superexpressam Dlk1, o que levou a um aumento estatisticamente significativo na taxa de divisão celular, quando comparada com a linhagem controle (vetor vazio), indicando um possível papel de Dlk1 no sinal desencadeado por MT e no controle do ciclo celular. Visando identificar novas vias de regulação entre os genes analisados, os níveis de expressão gênica dos demais genes foram avaliados por Real-Time PCR e analisados através de correlação de Pearson, aplicada a cada par de genes. Após a análise, foram identificadas 64 possíveis vias de regulação, sendo que 13 destas foram descritas pela primeira vez no presente trabalho e as demais, por já estarem descritas na literatura, permitiram validar o modelo estudado. / Polyomavirus (Py) induces multiple tumors in mice and malignant transformation in culture, leading to a lower serum and anchorage dependence. Among the proteins coded by the polyomavirus genome, the MT antigen (Middle T) alone is able to transform immortalized cell lines and to generate tumors when injected into animals. This transforming ability is related to its capacity of bind to and modulate several proteins, many of which are related to cell cycle control. Aiming at a better understanding not only of the molecular mechanisms of malignant transformation mediated by MT, but, also, of the processes underlying cell cycle control, the objectives of this work were to identify and characterize novel genes and signal transduction pathways regulated by MT. For screening of the MT regulated genes, the gene expression profiles of the MT expressing MTWT cell line and of the PLJ control cell line were compared using three methodologies: commercial nylon membranes (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), subtracted cDNA libraries constructed using the RDA methodology (Representational Difference Analysis) and commercial microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). These three methodologies allowed us to identify about 1,200 candidate genes as being regulated by MT, from which 84 genes were selected to have their differential expression analyzed by Real- Time PCR. In an attempt to identify possible signal transduction pathways related to these genes, we used as templates, in addition to cDNAs from the PLJ and MTWT cell lines, cDNAs from cell lines which express MT mutated in tyrosines 315, 322, 250 and 315/322. After confirmation by Real-Time PCR, two genes were selected for further functional analysis: Dlk1 (Like-1 Delta homolog), which is related to the differentiation process and to formation of some tumors, and MN1 (Meningioma 1), a newly identified gene, which can induce leukemia and meningioma tumor formation. To characterize the functional role of MN1, we generated PLJ cell lines in which MN1 was knocked-down by RNAi. The growth characteristics in solid and semi-solid substrates of control PLJ and of - III - ABSTRACT MN1 knocked down PLJ cells did not present any statistically significant alteration. To study the effect of Dlk1 in MT mediated cell transformation, we generated MTWT cell lines overexpressing Dlk1, which induced a significant increase in cell division rate when compared to the empty vector control cell line, indicating a possible role of Dlk1 in the MT induced signals and in cell cycle control. Aiming at identifying new regulatory pathways among the genes analyzed, the Real-Time PCR results were subjected to analysis by Pearson correlation, applied to each pair of genes, allowing us to identify 64 possible regulatory pathways, 13 of which were described, for the first time, in the present work. The other pathways, which had previously been described in the literature, allowed us to validate the model studied.

O objetivo desta tese é estudar o papel de FGF2 no controle do ciclo celular em células de mamíferos. Nosso principal modelo, a linhagem Y1, é derivada de um tumor funcional de córtex de camundongo que possui o proto-oncogene c-ki-ras amplificado, tendo consequentemente a super-expressão da proteína c-Ki-Ras na forma ativa (c-Ki-Ras-GTP). Células Y1 sincronizadas na interface G0/G1 do ciclo celular são prontamente responsivas a tratamentos de FGF2 (fator de crescimento de fibroblasto-2) sendo este capaz de ativar toda a progressão G0/G1 → S do ciclo celular, mas surpreendentemente, sob estas mesmas condições, FGF2 induz em cultura e in vivo morte celular nesta linhagem, bloqueando o progresso no ciclo após a entrada na fase S. Sob condições induzidas de baixo c-Ki-Ras-GTP, células Y1 respondem à FGF2 com um aumento na proliferação, mostrando que a indução de morte nesta linhagem está diretamente relacionado com os níveis de Ki-Ras-GTP. Além disso, a população de células Y1 é heterogênea, caracterizada por uma maioria de células FGF2-sensíveis e uma minoria de células que são selecionadas positivamente na presença de FGF2. Estas células FGF2-resistentes exibem uma resposta proliferativa a FGF2 e apresentam traços fenotípicos próximos aos observados em uma célula normal, embora o mecanismo de resistência independa da redução dos níveis de Ki-Ras-GTP. Semelhantemente, linhagens normais de fibroblastos 3T3 exibem uma resposta mitogênica a FGF2 que é substituída por uma resposta de morte após sua transformação com o oncogene EJ-ras. Nosso conjunto de resultados associados a uma nova análise dos dados bibliográficos permite-nos sugerir um novo efeito biológico de FGF2: proteção adicional contra o surgimento de tumores originados por oncogene. / The purpose of this work is to study the role of FGF2 (fibroblast growth factor-2) in the cell cycle control of mammalian cells. Our model of study is the lineage Y1, derived from a murine adrenocortical functional tumor, which presents the proto-oncogene c-ki-ras amplified and, as a consequence, exhibits enhanced expression of the c-Ki-Ras protein in its active forms (c-Ki-Ras-GTP). Arrested Y1 cells in the G0/G1 interface of the cell cycle are promptly responsive to FGF2 treatments, responding with progression through G0/G1 → S, but surprisingly, under the same conditions, FGF2 elicits a strong death response in cultured or in vivo cells, blocking the progress in the cell cycle after S phase entry. Under low c-Ki-Ras-GTP conditions, Y1 cells respond to FGF2 with enhanced proliferation, showing that death induction is related to c-Ki-Ras-GTP levels. Moreover, the Y1 population is heterogeneous, with a majority of FGF2-sensitive cells, and a minority of cells that can be positively selected in the presence of FGF2. These FGF2-resistant cells exhibit a proliferative response to FGF2 and phenotypic traits close to those observed in normal cells, even though the mechanisms of resistance are independent of c-Ki-Ras-GTP decrease. Comparable to that, normal lineages 3T3 display a mitogenic response to FGF2 that is substituted by a death response after their transformation with the oncogene EJ-Ras. The collection of our results associated with a review in the bibliography lead us to suggest a new biological effect of FGF2: enhanced protection against tumors originated by oncogenes.

Der Zellzyklus organisiert die Zellteilung, und kontrolliert die Replikation der DNA sowie die Weitergabe des Genoms an die nächste Zellgeneration. Er unterliegt einer strengen Kontrolle auf molekularer Ebene. Diese molekularen Kontrollmechanismen sind für das Überleben eines Organismus essentiell, da Fehler Krankheiten begüngstigen können. Vor allem Krebs ist assoziiert mit Abweichungen im Ablauf des Zellzyklus. Die Aufklärung solcher Kontrollmechanismen auf molekularer Ebene ermöglicht einerseits das Verständnis deren grundlegender Funktionsweise, andererseits können solche Erkenntnisse dazu beitragen, Methoden zu entwickeln um den Zellzyklus steuern zu können. Um die molekularen Abläufe des Zellzyklus in ihrer Gesamtheit besser zu verstehen, eignen sich computergestützte Analysen. Beim Zellzyklus handelt es sich um einen Signaltransduktionsweg. Die Eigenschaften dieser Prozesse stellen Rekonstruktion und Übersetzung in digital lesbare Formate vor besondere Herausforderungen in Bezug auf Skalierbarkeit, Simulierbarkeit und Parameterschätzung. Diese Studie präsentiert eine großskalige Netzwerkrekonstruktion des Zellzyklus des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae. Hierfür wurde die reaction-contingency Sprache benutzt, die sowohl eine mechanistisch detaillierte Rekonstruktion auf molekularer Ebene zulässt, als auch deren Übersetzung in ein bipartites Boolesches Modell. Für das Boolesche Modell mit 2506 Knoten konnte ein zyklischer Attraktor bestimmt werden, der das Verhalten einer sich teilenden Hefezelle darstellt. Das Boolesche Modell reproduziert zudem das erwartete phänotypische Verhalten bei Aktivierung von vier Zellzyklusinhibitoren, und in 32 von 37 getesteten Mutanten. Die Rekonstruktion des Zellzyklus der Hefe kann in Folgestudien genutzt werden, um Signaltransduktionswege zu integrieren, die mit dem Zellzyklus interferieren, deren Schnittstellen aufzuzeigen, und dem Ziel, die molekularen Mechanismen einer ganzen Zelle abzubilden, näher zu kommen. Diese Studie zeigt zudem, dass eine auf reaction- contingency Sprache basierte Rekonstruktion geeignet ist, um ein biologisches Netzwerk konsistent mit empirischer Daten darzustellen, und gleichzeitig durch Simulation die Funktionalität des Netzwerkes zu überprüfen. / The survival of a species depends on the correct transmission of an intact genome from one generation to the next. The cell cycle regulates this process and its correct execution is vital for survival of a species. The cell cycle underlies a strict control mechanism ensuring accurate cell cycle progression, as aberrations in cell cycle progression are often linked to serious defects and diseases such as cancer. Understanding this regulatory machinery of the cell cycle offers insights into how life functions on a molecular level and also provides for a better understanding of diseases and possible approaches to control them. Cell cycle control is furthermore a complex mechanism and studying it holistically provides for understanding its collective properties. Computational approaches facilitate holistic cell cycle control studies. However, the properties of the cell cycle control network challenge large-scale in silico studies with respect to scalability, model execution and parameter estimation. This thesis presents a mechanistically detailed and executable large-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae cell cycle control network based on reaction- contingency language. The reconstruction accounts for 229 proteins and consists of three individual cycles corresponding to the macroscopic events of DNA replication, spindle pole body duplication, and bud emergence and growth. The reconstruction translated into a bipartite Boolean model has, using an initial state determined with a priori knowledge, a cyclic attractor which reproduces the cyclic behavior of a wildtype yeast cell. The bipartite Boolean model has 2506 nodes and correctly responds to four cell cycle arrest chemicals. Furthermore, the bipartite Boolean model was used in a mutational study where 37 mutants were tested and 32 mutants found to reproduce known phenotypes. The reconstruction of the cell cycle control network of S. cerevisiae demonstrates the power of the reaction-contingency based approach, and paves the way for network extension with regard to the cell cycle machinery itself, and several signal transduction pathways interfering with the cell cycle.

Descrevemos, recentemente, que FGF2 parácrino dispara senescência nas linhagens celulares murinas Y1 e 3T3-B61, transformadas malignamente por Ras, mas sem ativação das vias apoptóticas (Costa et al., 2008). Nesta tese, estudamos os mecanismos celulares e moleculares desta resposta de estresse irreversível, disparada por FGF2. Focalizamos, principalmente, a linhagem Y1, que carrega uma amplificação do oncogene Kras, mas apresenta um controle parcial da transição G0/G1 → S do ciclo celular. Por estas características fenotípicas, as células Y1 foram utilizadas no estudo dos mecanismos das ações antagônicas de FGF2, isto é, a atividade mitogênica clássica e a nova ação citotóxica que causa senescência. Análises de citometria de fluxo e marcação com BrdU mostraram que FGF2 promove a transição G0/G1 → S (atividade mitogênica), mas bloqueia a progressão através de S e G2/M (atividade antimitogênica). Ensaios de viabilidade celular (MTS e Cyto-Tox) demonstraram que, durante o bloqueio do ciclo celular por FGF2, as células permanecem íntegras e metabolicamente ativas, embora exibam alterações morfológicas, que sugerem estresse celular. Além disso, experimentos de tomada de 3H-timidina em DNA evidenciaram que, já nas primeiras horas de G1, FGF2 dispara um processo antimitogênico que só tardiamente vai se manifestar na fase S, bloqueando a síntese de DNA. Verificamos ainda, que o inibidor específico da Tyr-quinase dos receptores de FGF, PD173074, abole completamente, tanto os efeitos mitogênicos como os antimitogênicos de FGF2 nas células Y1, demonstrando que ambos os processos iniciam-se com a ativação da Tyr-quinase dos FGFRs. Por outro lado, inibidores específicos das vias de sinalização de MEK/ERK, PI3K/AKT e PKC (todas mitogênicas e à jusante dos FGFRs) bloqueiam a progressão no ciclo celular, sem proteger as células Y1 de FGF2, evidenciando que estas vias mitogênicas não participam dos mecanismos moleculares citotóxicos disparados por FGF2. Entretanto, inibidores das Tyr-quinases Src protegem parcialmente as células Y1 de FGF2, implicando a família Src na transformação maligna destas células. Para buscar novos genes pertinentes à ação citotóxica de FGF2 analisamos expressão gênica por RT-qPCR, dando continuidade a estudos anteriores desenvolvidos no laboratório, através de microarranjos de cDNA (Asprino & Armelin, 2006). Desta busca, resultaram genes codificantes de proteínas envolvidas no controle de ciclo celular, adesão e citoesqueleto, com destaque para proteínas reguladoras de RhoGTPases e os receptores de FGF. Procuramos também examinar especificidades entre os FGFRs, quanto ao disparo das ações antagônicas de FGF2. As células Y1 expressam FGFR1IIIc, FGFR2IIIc e FGFR5 enquanto as 3T3-B61 expressam FGFR1IIIc e FGFR5. A redução da expressão de FGFR2 por RNAi, em células Y1, não impediu a ação citotóxica de FGF2, mas a redução de FGFR1 protegeu as células da ação morfológico-estressante de FGF2. Como FGFR5 não possui domínio de Tyr-quinase, concluímos que o FGFR1 é o receptor mais relevante para o efeito citotóxico de FGF2, em ambas as células. Em conclusão, FGF2 ativa a Tyr-quinase dos FGFRs, disparando mecanismos moleculares antagônicos, paralelos e independentes, onde o efeito final é o bloqueio do ciclo celular nas fases S e G2/M e, consequentemente, senescência celular. / We have recently described that paracrine FGF2 triggers senescence in Ras-driven murine cell lines Y1 and 3T3-B61, without activation of apoptotic pathways (Costa et al., 2008). On this thesis, we studied the molecular and cellular mechanisms of this irreversible stress response triggered by FGF2. We have mainly focused on the Y1 cell line, which carries Kras oncogene amplification, but presents a certain control of the G0/G1 → S cell cycle transition. Because of these phenotypic features, the Y1 cells were utilized to study the mechanisms of FGF2 antagonic actions, i. e., the classical mitogenic activity and the new cytotoxic action, which causes senescence. Flow cytometer analysis and BrdU labeling have shown that FGF2 promotes the G0/G1 → S transition (mitogenic activity), but arrests the progression through S and G2/M (antimitogenic activity). Viability assays (MTS and Cyto-Tox) have shown that, during the cell cycle arrest by FGF2, cells remain intact and metabolically active, although exhibiting morphologic alterations, which suggested cellular stress. Moreover, 3H-thymidine uptake into DNA has evidenced that, within the first hours of G1, FGF2 triggers an antimitogenic process that only lately will manifest in S phase, blocking DNA synthesis. We have further verified that the specific Tyr-kinase inhibitor, PD173074, completely abolishes both FGF2 mitogenic and antimitogenic effects, showing that both processes start at FGFRs Tyr-kinase. On the other hand, specific inhibitors of MEK/ERK, PI3K/AKT and PKC signaling pathways (all mitogenic and downstream of FGFRs) block the cell cycle progression, but do not protect cells from FGF2, showing that these pathways do not participate of the cytotoxic molecular mechanisms triggered by FGF2. However, Src Tyr-kinases inhibitors partially protect Y1 cells from FGF2, implicating the Src family on malignant transformation of these cells. To search new genes pertinent to the cytotoxic action of FGF2, we analyzed gene expression by RT-qPCR, continuing previous studies developed in our laboratory through cDNA microarrays (Asprino & Armelin, 2006). This search revealed protein-coding genes involved on cell cycle control, cellular adhesion and cytoskeleton, in which we highlighted regulatory proteins of RhoGTPases and FGF receptors. We also examined specificities among FGFRs in relation to FGF2 antagonic actions. Y1 cells express FGFR1IIIc, FGFR2IIIc and FGFR5 whereas 3T3-B61 cells express FGFR1IIIc and FGFR5. In Y1 cells, the knockdown of FGFR2 expression by RNAi do not stop FGF2 cytotoxic actions, but knockdown of FGFR1 expression protects cells from the FGF2 morphologic-stressing action. Since FGFR5 lacks Tyr-kinase domain, we concluded that FGFR1 is the most relevant receptor for FGF2 cytotoxic effect in both cells. In conclusion, FGF2 activates FGFRs Tyr-kinase, triggering parallel and independent antagonic molecular mechanisms, in which the final effect is the S and G2/M cell cycle arrest and, consequently, cellular senescence.