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Analysis of Cell Polarity Signaling in <em>C. elegans</em>: A DissertationRocheleau, Christian Ernest 03 December 1999 (has links)
During embryonic development of the nematode Caenorhabditis elegans, cell fates are specified by asymmetric segregation of cell fate determinants and via cell-cell signaling events. Specification of the eight-cell stage blastomere E, the endoderm progenitor cell, requires both cell signaling and asymmetric cell division. At the four-cell stage, a polarity-inducing signal from the P2 cell is required for the EMS cell to divide asymmetrically to produce an anterior daughter MS, and posterior daughter E. In the absence of signal, the EMS cell divides symmetrically to produce two daughters that adopt the MS fate. This thesis describes the identification and analyses of seven genes required to tranduce this polarity-inducing signal and specify endoderm formation. The mom-1, mom-2, mom-5, apr-1, and wrm-1 genes are homologous to components of the Wnt/Wingless signal transduction pathway, and the mom-4, and lit-1 genes are related to components of the mitogen-activated protein kinase pathway. Biochemical analysis of these signaling molecules reveal a novel convergence of these pathways at the level of the LIT-1 and WRM-1 proteins, which appear to function as a kinase complex and are required for the downregulation of POP-1. Together these genes constitute components of a complex genetic pathway required for specification of the E cell fate.
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Avaliação do padrão de resposta de imunoglobulinas em diferentes linhagens de camundongos frente à infecção por T.cruziSILVA, ANDREIA dos S. 09 October 2014 (has links)
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Estudos da expressao genica mediante utilizacao de queratinocitos humanos normais transduzidos com o gene do hormonio de crescimento humano .Possivel utilizacao em terapia genicaMATHOR, MONICA B. 09 October 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2014-10-09T12:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Prolactina humana pseudofosforilada (S179D-hPRL) é um potente fator anti-angiogênico in vitro e in vivoUEDA, ERIC K.M. 09 October 2014 (has links)
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Regulação das células mesenquimais da matriz do cordão umbilical canino durante a osteogênese / Regulation of mesenchymal cells of the canine umbilical cord matrix during osteogenesisGonzaga, João Paulo Ignácio [UNESP] 07 August 2017 (has links)
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Dissertação João Paulo 2017.pdf: 958263 bytes, checksum: 7ef6cdf74470df5e3235cc2a1783d5ea (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo:
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Previous issue date: 2017-08-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As células mesenquimais derivadas da geleia de Wharton isoladas da matriz do cordão umbilical canino tem sido sugeridas como uma fonte promissora de MSCs para serem usadas nas aplicações clínicas em ciência veterinária, como uma ferramenta potencialmente efetiva na regeneração óssea. MicroRNA (miARN) é um regulador pós-transcricional da expressão gênica em várias condições fisiológicas, incluindo a osteogênese. Neste estudo, as MSCs caninos (cMSCs) isoladas da geléia de Wharton foram induzidos a osteogênese e a transcrição de miR-106b foi avaliada em 0, 7, 14 e 21 dias após a indução. Em outro experimento, as cMSC foram transfectadas com um imitador de miR106b e um inibidor e induzidos a osteogênese. Morfologicamente, cMSCs transfectadas com um inibidor de miR-106b produziram células semelhantes a osteócitos quando comparadas às mesmas células transfectadas com o mímico de miR-106b. cMSCs apresentaram transcrição de miR-106b após 7 dias de osteoindução em um nível baixo em comparação com o controle positivo, enquanto as células transfectadas com o mímico de miR-106b mostraram que o miR-106b deveria ser regulado positivamente. Após a inibição da expressão de miR-106b em cMSCs osteoinduzidas, a atividade da fosfatase alcalina (ALP) foi aumentada. A transcrição do mRNA de osteocalcina, osteopontina e RUNX2 foi regulada positivamente aos 21 dias após a osteoindução, após a inibição de miR106b. Esses achados, pela primeira vez, mostraram que a expressão de miR106b regula negativamente a osteogênese em MSCs caninos derivados da geléia de Wharton e parece interferir na diferenciação celular. / Wharton`s jelly derived-MSCs isolated from canine umbilical cord matrix have been suggested as a promising source of MSCs to be used for clinical applications in veterinary science, as a potentially effective tool in bone regeneration. MicroRNA (miRNA) is a post-transcriptional regulator of gene expression in several physiological conditions, including osteogenesis In this study, canine MSCs (cMSCs) isolated from Wharton´s jelly were induced to osteogenesis and miR-106b transcription was measured at 0, 7, 14 and 21 days following induction. In another experiment, cMSCs were transfected with a miR106b mimic and an inhibitor and induced to osteogenesis. Morphologically, cMSCs transfected with an inhibitor of miR-106b appeared as osteocyte-like cells when compared to the same cells transfected with the mimic of miR-106b. cMSCs showed miR-106b transcription after 7 days of osteoinduction was at a low level compared to the positive control, whereas transfected cells with the miR-106b mimic showed miR-106b to be upregulated. After inhibition of miR-106b expression in osteoinduced cMSCs, alkaline phosphatase (ALP) activity was increased. Osteocalcin, osteopontin and RUNX2 mRNA transcription were upregulated at 21 days after osteoinduction following miR-106b inhibition. These findings have, for the first time, shown that the expression of miR-106b negatively regulates osteogenesis in canine MSCs derived from Wharton´s jelly and seems to interfere with cell differentiation.
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Caracterização da diferenciação neural induzida por ácido retinóico da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y e seu uso como ferramenta para pesquisa em neurociênciasLopes, Fernanda Martins January 2012 (has links)
Os mecanismos moleculares que levam ao dano da via nigroestriatal durante a progressão da Doença de Parkinson (DP) ainda não estão totalmente elucidados. Dessa forma, existe a necessidade de desenvolver modelos experimentais adequados para o estudo desse distúrbio neurodegenerativo. A linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratada com neurotoxinas indutoras deste distúrbio (ex.: 6-hidroxidopamina - 6-OHDA) é amplamente utilizada como modelo in vitro da DP. Muitos estudos mostram que esta linhagem pode ser diferenciada em células dopaminérgicas através da combinação da diminuição do soro fetal bovino (SFB) em meio de cultura e da adição de neurotrofinas como o ácido retinóico (AR). No entanto, há poucos estudos mostrando as diferenças entre células proliferativas e diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y, além do efeito do tratamento com 6-OHDA. Ainda, não há um consenso nos protocolos de diferenciação. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi estabelecer um protocolo de diferenciação dopaminérgica da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como avaliar a potencialidade do modelo como plataforma para o screening de neurotoxicidade/neuroproteção de compostos e a possibilidade de manipulação gênica. As células proliferativas SH-SY5Y foram mantidas em meio de cultura DMEM/F12 (1:1) suplementado com 10% de SFB. A diferenciação foi induzida pela combinação de 10 μM de AR e meio de cultura com 1% de SFB durante 4, 7 e 10 dias. Foram avaliados parâmetros morfológicos (presença de neuritos) e neuroquímicos, através marcadores de diferenciação neuronal (DAT- transportador de dopamina; TH – tirosina hidroxilase; ENS – enolase neurônio específica; NeuN – proteína nuclear de neurônio; Nestina). Ainda, avaliamos parâmetros de estresse oxidativo através da atividade de enzimas antioxidantes e dos níveis de tióis reduzidos. Nossos dados mostraram que as células SH-SY5Y diferenciadas por 7 dias apresentaram mudanças morfológicas e o aumento do imunoconteúdo de todos os marcadores neuronais testados, e a concomitantemente diminuição do imunoconteúdo de nestina (marcador de células indiferenciadas). Além disso, o fenótipo neuronal apresentou uma maior atividade de alguns sistemas antioxidantes. Também foi avaliada a citotoxicidade frente ao H2O2 e à 6-OHDA nos dois fenótipos. As células diferenciadas se mostraram mais resistentes ao dano causado pelo H2O2 e mais sensíveis à 6-OHDA. Dessa forma, a citotoxicidade da 6-OHDA pode estar relacionada com o aumento do imunoconteúdo do DAT, visto que a neurotoxina entra na célula dopaminérgica através deste transportador. Interessantemente, as células diferenciadas apresentaram aumento dos níveis da proteína neuroprotetora DJ-1, que está relacionada a uma forma prematura de Parkinsonismo em humanos. Após a caracterização do modelo, nós utilizamos o fenótipo diferenciado como plataforma experimental para o screening de compostos neuroprotetores como os organocalcogênios. Nós determinamos a citotoxidade destes compostos em células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y. A partir destes dados, foram selecionados compostos com baixa citotoxicidade e avaliamos a morfologia celular (densidade de neuritos). Nós verificamos que antes da perda de viabilidade, ocorre a perda de neuritos, sendo que este parâmetro é outra vantagem do modelo de célula diferenciada para avaliação da neurototoxicidade. Ainda, verificamos que estes compostos são capazes de prevenir o dano celular causado pela 6-OHDA. Além disso, nós caracterizamos a capacidade do modelo de ser manipulado geneticamente através da transfecção e superexpressão de plasmídeo contendo a proteína verde fluorescente, onde verificamos que a expressão é mantida durante a diferenciação. Dessa forma, nossos dados mostraram a eficácia da padronização da diferenciação induzida por AR da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, pois estas células apresentam características morfológicas e neuroquímicas adequadas de neurônio dopaminérgico bem como pode ser aplicado não só para avaliação de neurototoxicidade/neuroproteção, mas também pode ser manipulado geneticamente. / The molecular mechanisms underlying the massive cellular loss found in the nigrostriatal pathway during the progression of Parkinson’s disease (PD) are not completely understood. Therefore, it is important to develop more suitable experimental models to study the molecular mechanisms of this neurodegenerative disorder. Proliferative human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with neurotoxins (e.g.: 6-hydroxydopamine – 6-OHDA) has been widely used as an in vitro model for PD. Many lines of evidence showed that this cell line differentiates with the combination of lower fetal bovine serum (FBS) and retinoic acid (RA) to dopaminergic-like neural cell. However, there are few studies addressing the differences between proliferative and RA-differentiated SH-SY5Y cells as well as their responses to 6-OHDA cytotoxicity. Moreover, there is no consensus in differentiation protocols. Hence, the objective of this study was to establish a RAinduced dopaminergic differentiation protocol and also evaluate its capabilities for drug screening of neurotoxicity/neuroprotection and genetic manipulation. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained with DMEM/F12 (1:1) medium plus 10% FBS. Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 4, 7 and 10 days. We evaluated the cell morphology (neurites) and the neuronal markers (Dopamine Transporter- DAT, Tyrosine Hydroxylase-TH, Neuron-Specific Enolase-NSE, Neuronal Nuclei Protein- NeuN, and Nestin immunocontent). Furthermore, we verify the activity of antioxidant enzymes and the reduced thiol levels. Our data demonstrated that SH-SY5Y cells differentiated for 7 days expresses all neuronal markers tested with concomitant decrease in nondifferentiated marker (nestin). Besides, they showed a higher activity of some antioxidant systems. We also evaluated the cytotoxicity of H2O2 and 6-OHDA in both phenotypes. Differentiated cells are more resistant to H2O2 and more sensitive to 6- OHDA. Hence, the damage caused by 6-OHDA could be related with the increase of DAT immuncontent, because this neurotoxin enters into the dopaminergic cell through this transporter. Interestingly, the differentiated cells have more levels of neuroprotective DJ-1 protein, which is related with a juvenile Parkinsonism. After establish the conditions of differentiation, we used the neuronal phenotype to perform a drug screening with organoselenide compounds. We verify the cytotoxicity of these compounds in differentiated cells. From these data, we selected compounds with low toxicity and evaluated the cell morphology (neurites density). We verify that before the loss of viability, there is a loss of neurites. This parameter is another advantage of the differentiated cells model to neurotoxicity evaluation. Moreover, these compounds were able to prevent neuronal cell death caused by 6-OHDA. We also characterized the ability of the model to be manipulated genetically through transfection and overexpression of a green fluorescent protein (GFP) plasmid. We verify that the expression of GFP is maintained during the differentiation. Hence, our data showed the efficacy of the RA-induced differentiation protocol of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, because these cells have morphological and neurochemical characteristics of dopaminergic neurons. Furthermore, the neuronal phenotype can be applyed not only to evaluate neurocytotoxicity/neuroprotection but also can be manipulated genetically.
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Targeting T-bet for Prevention of Graft-Versus-Host Disease and Leukemia Relapse after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell TransplantationFu, Jianing 01 January 2015 (has links)
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) is an effective therapeutic option for many malignant diseases. However, the efficacy of allo-HSCT is limited by the occurrence of destructive graft-versus-host disease (GVHD). Since allogeneic T cells are the driving force in the development of GVHD, their activation, proliferation, and differentiation are key factors to understanding GVHD pathogenesis. On the other hand, antigen-presenting cells (APCs) are essential for allogeneic T-cell priming and the development of GVHD. The T-box transcription factor T-bet is a master regulator for IFN-γ production and Th1 differentiation. T-bet also regulates the functions of APCs including dendritic cells (DCs) and B cells. Therefore, we investigated the role of T-bet in T cell responses, as well as on APC functions, in acute GVHD (aGVHD) using murine models of allogenic bone marrow transplantation (allo-BMT).
In Chapter 2, we evaluated the roles of T-bet and IFN-γ in T-cell responses. T-bet-/- T cells induced significantly less GVHD compared with either wild-type (WT) or IFN-γ-/- counterparts in CD4-driven major histocompatibility complex (MHC)- or minor histocompatibility antigen (miHA)-mismatched models. We defined several T-bet-dependent but IFN-γ-independent molecules that may account for this distinct outcome. Further study indicates that T-bet also controls the optimal activity of Th17 cells to induce GVHD. Moreover, the compromised graft-versus-leukemia (GVL) effect of T-bet-/- T cells could be essentially reversed by IL-17 neutralization. Thus, targeting T-bet or regulating its downstream effectors independent of IFN-γ may be a promising strategy to control GVHD in the clinic.
In Chapter 3, we evaluated the role of T-bet on APCs and found that T-bet-/- recipients developed much milder GVHD than their WT counterparts in MHC-mismatched or CD4-depedent miHA-mismatched models. As the functional readout of APCs, allogeneic donor T cells, particular CD4 subpopulation, significantly reduced IFN-γ production, proliferation and migration, and caused less damage in liver and gut in T-bet-/- recipients. We further observed that T-bet on recipient hematopoietic APCs, particular DCs, was primarily responsible for donor T-cell response and pathogenicity in GVHD. In fact, Trail/DR5 interaction served as a major signaling pathway responsible for donor T-cell apoptosis and impaired GVHD development in T-bet-/- recipients. Furthermore, T-bet expression on the host is largely dispensable for the GVL effect.
Taken together, we propose that T-bet is a potential therapeutic target for the control of GVHD through regulating T cells as well as APCs. We believe further exploration and understanding of the immunobiology of T-bet in controlling the activities of T cells and APCs in GVHD will expand therapeutic options for the continuing success of allo-HSCT.
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Características de expansão, diferenciação e criopreservação de células-tronco mesenquimais obtidas do líquido amniótico no segundo trimestre de gestação / Characteristics of expansion, differentiation and cryopreservation of mesenchymal stem cells obtained from amniotic fluid in second trimester of pregnancyFelipe de Lara Janz 06 October 2010 (has links)
As células-tronco mesenquimais (CTM) são células progenitoras indiferenciadas que apresentam altas taxas de proliferação em cultivo, capacidade de diferenciação em inúmeros tecidos e podem ser encontradas no organismo adulto e, também, em tecidos fetais, como cordão umbilical, placenta e liquido amniótico (LA). Estudos demonstraram que o LA humano obtido por amniocentese no segundo trimestre de gestação, comumente utilizado em exames de diagnóstico fetal, apresenta-se como uma fonte em potencial destas células progenitoras. Contudo, estas células necessitam de mais estudos quanto às técnicas de isolamento, expansão e, sobretudo, acerca dos protocolos de congelamento utilizados em sua criopreservação. Com isso, nos propusemos a padronizar técnicas de cultivo para as CTLA, como melhor meio de cultura e densidade de inóculo; avaliar as características biológicas como estado de indiferenciação, ciclo celular, marcadores de membrana, plasticidade e, ainda, testar dois protocolos de congelamento celular (padrão e gradual) com diferentes criopreservantes (DMSO, glicerol, trealose e sacarose) que mantivessem uma alta viabilidade e as demais características das células-tronco após períodos de 3 e 6 meses de armazenamento em nitrogênio líquido. Ao fim dos experimentos constatamos ser o líquido amniótico uma rica fonte de CTM passíveis de serem isoladas e cultivadas com meio de cultura a-MEM suplementado com 20% de SFB. Padronizamos, também, uma contagem celular inicial das amostras para otimizar o plaqueamento primário, uma densidade de inóculo ideal para as passagens posteriores (5.000 céls/cm2) e o tempo de dobramento (30 ± 4 horas) das mesmas. As CTLA expressaram genes de indiferenciação: Oct-4, Sox-2 e Nanog; apresentaram positividade para marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105; alta taxa de proliferação in vitro e diferenciaram-se em tecido ósseo, adiposo, cartilaginoso e neuronal. Não encontramos diferenças significativas entre os dois métodos de congelamento avaliados no que diz respeito à viabilidade pós-congelamento. Todos os criopreservantes analisados mantiveram o estado de indiferenciação e plasticidade das células-tronco congeladas por 3 e 6 meses, contudo o DMSO 10% proporcionou maiores taxas de viabilidade do que os demais. As CTLA ficam desta maneira melhor caracterizadas, com protocolos de cultivo e estocagem bem estabelecidos, facilitando a produção de células-tronco funcionais em larga escala aptas a serem utilizadas em experimentos futuros / Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated progenitor cells that have high proliferation rates in culture, ability to differentiate into various tissues and can be found in adult and fetal tissues such as umbilical cord, placenta and amniotic fluid (AF). Studies showed that human AF obtained by amniocentesis in second trimester of pregnancy, commonly used in fetal diagnostic, is a potential source of progenitor cells. However, these cells require further studies above techniques of isolation, expansion and, especially, about freezing protocols used in their cryopreservation. For then, we analyzed isolation and expansion methods to AFSC as the best culture medium and inoculum density; biological characteristics such as undifferentiated state, cell cycle, membrane markers, plasticity, and also we tested two freezing protocols (standard and graduated) with different cryoprotectors (DMSO, glycerol, trehalose and sucrose) that could be able to maintain high viability and other characteristics of stem cells after 3 and 6 months of storage in liquid nitrogen. At the end of experiments we found that amniotic fluid is a rich source of mesenchymal stem cells that can be isolated and cultured with a-MEM medium supplemented with 20% FBS. Standardized an initial cell samples counting to optimize primary plating, an ideal inoculum density for the later passages (5000 cells/cm2) and doubling time (30 ± 4 hours). AFSC expressed undifferentiated genes: Oct-4, Sox-2 and Nanog, were positive for surface markers CD29, CD44, CD90 and CD105; presented high in vitro proliferation rate and capability to differentiate into bone, adipose, cartilage and neuronal tissues. There was not statistical significance in cell viability between standard and graduated freezing protocols. All evaluated cryoprotectors maintained the basic features of amniotic fluid stem cells, as Oct-4 gene expression, surface markers and plasticity. DMSO 10% showed higher rates of viability than the others. We can conclude that AF is a rich source of MSC with great capacity for expansion and differentiation and that both methods of freezing could be used for AF cells storage. All tested cryoprotectors maintains stemness of AFSC, therefore the highest viability rate is supplied by 10% DMSO. In this way, AFSC are better characterized, with cultivation and storage protocols standardized, resulting in large scale production of functional stem cells suitable for use in future experiments
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Caracterização da diferenciação neural induzida por ácido retinóico da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y e seu uso como ferramenta para pesquisa em neurociênciasLopes, Fernanda Martins January 2012 (has links)
Os mecanismos moleculares que levam ao dano da via nigroestriatal durante a progressão da Doença de Parkinson (DP) ainda não estão totalmente elucidados. Dessa forma, existe a necessidade de desenvolver modelos experimentais adequados para o estudo desse distúrbio neurodegenerativo. A linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratada com neurotoxinas indutoras deste distúrbio (ex.: 6-hidroxidopamina - 6-OHDA) é amplamente utilizada como modelo in vitro da DP. Muitos estudos mostram que esta linhagem pode ser diferenciada em células dopaminérgicas através da combinação da diminuição do soro fetal bovino (SFB) em meio de cultura e da adição de neurotrofinas como o ácido retinóico (AR). No entanto, há poucos estudos mostrando as diferenças entre células proliferativas e diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y, além do efeito do tratamento com 6-OHDA. Ainda, não há um consenso nos protocolos de diferenciação. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi estabelecer um protocolo de diferenciação dopaminérgica da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como avaliar a potencialidade do modelo como plataforma para o screening de neurotoxicidade/neuroproteção de compostos e a possibilidade de manipulação gênica. As células proliferativas SH-SY5Y foram mantidas em meio de cultura DMEM/F12 (1:1) suplementado com 10% de SFB. A diferenciação foi induzida pela combinação de 10 μM de AR e meio de cultura com 1% de SFB durante 4, 7 e 10 dias. Foram avaliados parâmetros morfológicos (presença de neuritos) e neuroquímicos, através marcadores de diferenciação neuronal (DAT- transportador de dopamina; TH – tirosina hidroxilase; ENS – enolase neurônio específica; NeuN – proteína nuclear de neurônio; Nestina). Ainda, avaliamos parâmetros de estresse oxidativo através da atividade de enzimas antioxidantes e dos níveis de tióis reduzidos. Nossos dados mostraram que as células SH-SY5Y diferenciadas por 7 dias apresentaram mudanças morfológicas e o aumento do imunoconteúdo de todos os marcadores neuronais testados, e a concomitantemente diminuição do imunoconteúdo de nestina (marcador de células indiferenciadas). Além disso, o fenótipo neuronal apresentou uma maior atividade de alguns sistemas antioxidantes. Também foi avaliada a citotoxicidade frente ao H2O2 e à 6-OHDA nos dois fenótipos. As células diferenciadas se mostraram mais resistentes ao dano causado pelo H2O2 e mais sensíveis à 6-OHDA. Dessa forma, a citotoxicidade da 6-OHDA pode estar relacionada com o aumento do imunoconteúdo do DAT, visto que a neurotoxina entra na célula dopaminérgica através deste transportador. Interessantemente, as células diferenciadas apresentaram aumento dos níveis da proteína neuroprotetora DJ-1, que está relacionada a uma forma prematura de Parkinsonismo em humanos. Após a caracterização do modelo, nós utilizamos o fenótipo diferenciado como plataforma experimental para o screening de compostos neuroprotetores como os organocalcogênios. Nós determinamos a citotoxidade destes compostos em células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y. A partir destes dados, foram selecionados compostos com baixa citotoxicidade e avaliamos a morfologia celular (densidade de neuritos). Nós verificamos que antes da perda de viabilidade, ocorre a perda de neuritos, sendo que este parâmetro é outra vantagem do modelo de célula diferenciada para avaliação da neurototoxicidade. Ainda, verificamos que estes compostos são capazes de prevenir o dano celular causado pela 6-OHDA. Além disso, nós caracterizamos a capacidade do modelo de ser manipulado geneticamente através da transfecção e superexpressão de plasmídeo contendo a proteína verde fluorescente, onde verificamos que a expressão é mantida durante a diferenciação. Dessa forma, nossos dados mostraram a eficácia da padronização da diferenciação induzida por AR da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, pois estas células apresentam características morfológicas e neuroquímicas adequadas de neurônio dopaminérgico bem como pode ser aplicado não só para avaliação de neurototoxicidade/neuroproteção, mas também pode ser manipulado geneticamente. / The molecular mechanisms underlying the massive cellular loss found in the nigrostriatal pathway during the progression of Parkinson’s disease (PD) are not completely understood. Therefore, it is important to develop more suitable experimental models to study the molecular mechanisms of this neurodegenerative disorder. Proliferative human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with neurotoxins (e.g.: 6-hydroxydopamine – 6-OHDA) has been widely used as an in vitro model for PD. Many lines of evidence showed that this cell line differentiates with the combination of lower fetal bovine serum (FBS) and retinoic acid (RA) to dopaminergic-like neural cell. However, there are few studies addressing the differences between proliferative and RA-differentiated SH-SY5Y cells as well as their responses to 6-OHDA cytotoxicity. Moreover, there is no consensus in differentiation protocols. Hence, the objective of this study was to establish a RAinduced dopaminergic differentiation protocol and also evaluate its capabilities for drug screening of neurotoxicity/neuroprotection and genetic manipulation. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained with DMEM/F12 (1:1) medium plus 10% FBS. Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 4, 7 and 10 days. We evaluated the cell morphology (neurites) and the neuronal markers (Dopamine Transporter- DAT, Tyrosine Hydroxylase-TH, Neuron-Specific Enolase-NSE, Neuronal Nuclei Protein- NeuN, and Nestin immunocontent). Furthermore, we verify the activity of antioxidant enzymes and the reduced thiol levels. Our data demonstrated that SH-SY5Y cells differentiated for 7 days expresses all neuronal markers tested with concomitant decrease in nondifferentiated marker (nestin). Besides, they showed a higher activity of some antioxidant systems. We also evaluated the cytotoxicity of H2O2 and 6-OHDA in both phenotypes. Differentiated cells are more resistant to H2O2 and more sensitive to 6- OHDA. Hence, the damage caused by 6-OHDA could be related with the increase of DAT immuncontent, because this neurotoxin enters into the dopaminergic cell through this transporter. Interestingly, the differentiated cells have more levels of neuroprotective DJ-1 protein, which is related with a juvenile Parkinsonism. After establish the conditions of differentiation, we used the neuronal phenotype to perform a drug screening with organoselenide compounds. We verify the cytotoxicity of these compounds in differentiated cells. From these data, we selected compounds with low toxicity and evaluated the cell morphology (neurites density). We verify that before the loss of viability, there is a loss of neurites. This parameter is another advantage of the differentiated cells model to neurotoxicity evaluation. Moreover, these compounds were able to prevent neuronal cell death caused by 6-OHDA. We also characterized the ability of the model to be manipulated genetically through transfection and overexpression of a green fluorescent protein (GFP) plasmid. We verify that the expression of GFP is maintained during the differentiation. Hence, our data showed the efficacy of the RA-induced differentiation protocol of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, because these cells have morphological and neurochemical characteristics of dopaminergic neurons. Furthermore, the neuronal phenotype can be applyed not only to evaluate neurocytotoxicity/neuroprotection but also can be manipulated genetically.
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Avaliação do padrão de resposta de imunoglobulinas em diferentes linhagens de camundongos frente à infecção por T.cruziSILVA, ANDREIA dos S. 09 October 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2014-10-09T12:52:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O presente trabalho realizou-se com diferentes linhagens de camundongos (A/J, C57BL/6, B6AF1, BXA1 e BXA2) que foram desafiados com diferentes doses da cepa Y de T. cruzi. O objetivo foi avaliar o padrão de resposta de imunoglobulinas produzidas por estas linhagens e para tanto, amostras de soros foram analisadas pelo método imunoenzimático. A partir dos resultados obtidos observou-se que todas as linhagens apresentaram uma resposta superior para IgG2a e IgG2b, quando comparados ao IgG1. Indicando um padrão Th1 que expressa resposta imunológica celular. As diferentes linhagens utilizadas nessa pesquisa apresentam padrões de resposta imunológica também diferentes frente à infecção por T. cruzi. Animais da linhagem C57BL/6 mostraram-se resistentes a infecção, enquanto que os animais da linhagem A/J mostraram-se susceptíveis, corroborando com a literatura. Os animais da linhagem híbridos B6AF1 foram mais resistentes à infecção que seu parental original C57BL/6. Sua resposta imunológica apresenta traços tanto do parental original A/J quanto do C57BL/6. Os animais da linhagem BXA1 puderam ser considerados resistentes à infecção, mas não apresentaram o mesmo controle observado nos animais das linhagens B6AF1 e C57BL/6. Os animais da linhagem BXA2 foram considerados susceptíveis à infecção, mas a controlaram por um período maior, sobrevivendo assim, por tempo superior àquele observado na linhagem A/J. Os resultados obtidos indicam que a subclasse de imunoglobulinas IgG2b desempenha importante papel na resistência à cepa Y de T. cruzi. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP
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