Alterações genéticas nos genes RET, RAS e BRAF resultam na ativação constitutiva da sinalização MAPK e estão presentes em aproximadamente 70% dos carcinomas papilífero de tiroide, a forma mais prevalente de câncer de tiroide. Múltiplas vias de sinalização podem atuar em conjunto com a via MAPK na oncogênese tiroidiana. Nesse estudo, testamos a hipótese que a via MAPK regula a sinalização Notch e que o crosstalk entre as vias de sinalizações são importantes na regulação da diferenciação e proliferação celular no câncer de tiroide. A ativação condicional dos oncogenes RET/PTC3 e BRAFT1799A em linhagem de célula folicular normal de tiroide aumentou a atividade da via de sinalização Notch. Por outro lado, o bloqueio farmacológico da sinalização MAPK reduziu a sinalização Notch na linhagem celular TPC-1 derivada de carcinoma papilífero de tiroide. Glândulas tiroide de animais transgênicos expressando BRAFT1799A e amostras de carcinoma papilífero de tiroide apresentaram elevados níveis de NOTCH1. A superexpressão de NOTCH1 em célula folicular normal de tiroide aumentou a expressão proteica de NIS. A inibição farmacológica e por RNA de interferência da sinalização Notch apresentou um efeito anti-proliferativo em linhagem de CPT. Além disso, a combinação do inibidor farmacológico de Notch e MAPK diminuiu a proliferação de células de carcinoma papilífero de tiroide. Esses dados sugerem um importante papel da sinalização Notch na oncogênese do carcinoma papilífero de tiroide induzida pela sinalização MAPK e que a via Notch pode ser uma potencial terapia adjuvante no câncer de tiroide. / Genetic alterations in RET, RAS and BRAF result in constitutive activation of the MAPK signaling and are present in approximately 70% of papillary thyroid carcinomas, the most prevalent form of thyroid cancer. Multiple signaling pathways can act with MAPK pathway in thyroid oncogenesis. In this study, we tested the hypothesis that MAPK pathway control Notch signaling and that the crosstalk between these pathways plays an important role in thyroid cancer cell differentiation and proliferation. The conditional activation of RET/PTC3 and BRAFT1799A enhanced Notch signaling pathway in normal follicular thyroid cell. By contrast, pharmacological inhibition of MAPK reduced Notch signaling in TPC-1 cell line derived from papillary thyroid carcinoma. Transgenic mice expressing BRAFT1799A restrict in thyroid gland and human papillary thyroid carcinoma samples showed higher Notch1 expression. NOTCH1 overexpression in normal thyroid follicular cell increased NIS protein expression. Pharmacological inhibition and RNA interference of Notch signaling showed an anti-proliferative effect in papillary thyroid carcinoma cells. Furthermore, the combination of MAPK and Notch signaling inhibitors reduced papillary thyroid carcinoma proliferation. These data suggest an important role of Notch signaling in papillary thyroid carcinoma induced by MAPK-related oncogenes and that Notch signaling pathway could be a potential adjuvant therapy in thyroid cancer.

O parasita da malária Plasmodium falciparum percebe o ambiente em que se encontra, elaborando respostas celulares adequadas, que envolvem secreção de proteínas, crescimento e diferenciação celular. Fatores relacionados com a geração de segundos-mensageiros e proteínas efetoras da sinalização celular estão descritos na literatura. Porém, a função de receptores responsáveis pela percepção de estímulos extracelulares no parasita é um tema pouco explorado. A identificação in silico de receptores de sete domínios transmembrânicos putativos no genoma de P. falciparum possibilitou a exploração da função dos mesmos. A tese caracteriza funcionalmente dois receptores, PFSR10 e PFSR25. A expressão proteica dos receptores foi demonstrada em fases eritrocíticas de P. falciparum. Os receptores possuem candidatos a parceiros moleculares que executam diversas funções celulares, entre elas invasão do eritrócito, endocitose e exocitose. Os receptores foram transfectados em células de mamíferos e, através de ensaios de dinâmica de cálcio de high-throughput, sugere-se que PFSR10 codifique um receptor que participa na percepção de ATP extracelular e que PFSR25 codifique um sensor de KCl. O trabalho também sugere que KCl modula cálcio citosólico em P. falciparum e que parasitas nocaute para PFSR25 são incapazes de modular cálcio citosólico em resposta a KCl. / The malaria parasite P. falciparum perceives its milieu and elaborates adequate intracellular responses, that involve protein secretion, growth and cell differentiation. Factors related to second messengers generation and effectors of cell signaling are described in the literature. However, the function of receptors responsible for stimulus perception remains elusive. The in silico identification of putative seven transmembrane receptors in the Plasmodium falciparum genome allowed the exploration of their function. In the thesis, two putative receptors were characterized, PFSR10 and PFSR25. The proteic expression of the receptors was demonstrated in erythrocytic stages of P. falciparum. The receptors have putative interaction partners that participate in cellular functions such as invasion, exocytosis and endocytosis.The receptors were transfected in mammalian cells and, through high-throughput calcium dynamics assays, it is suggested that PFSR10 codes for a receptor that participates in extracellular ATP perception and that PFSR25 codes for a KCl sensor. It is also suggested that KCl modulates cytosolic calcium in response to KCl and that knockout parasites for PFSR25 are incapable of modulating cytosolic calcium in response to KCl.

Alterações genéticas nos genes RET, RAS e BRAF resultam na ativação constitutiva da sinalização MAPK e estão presentes em aproximadamente 70% dos carcinomas papilífero de tiroide, a forma mais prevalente de câncer de tiroide. Múltiplas vias de sinalização podem atuar em conjunto com a via MAPK na oncogênese tiroidiana. Nesse estudo, testamos a hipótese que a via MAPK regula a sinalização Notch e que o crosstalk entre as vias de sinalizações são importantes na regulação da diferenciação e proliferação celular no câncer de tiroide. A ativação condicional dos oncogenes RET/PTC3 e BRAFT1799A em linhagem de célula folicular normal de tiroide aumentou a atividade da via de sinalização Notch. Por outro lado, o bloqueio farmacológico da sinalização MAPK reduziu a sinalização Notch na linhagem celular TPC-1 derivada de carcinoma papilífero de tiroide. Glândulas tiroide de animais transgênicos expressando BRAFT1799A e amostras de carcinoma papilífero de tiroide apresentaram elevados níveis de NOTCH1. A superexpressão de NOTCH1 em célula folicular normal de tiroide aumentou a expressão proteica de NIS. A inibição farmacológica e por RNA de interferência da sinalização Notch apresentou um efeito anti-proliferativo em linhagem de CPT. Além disso, a combinação do inibidor farmacológico de Notch e MAPK diminuiu a proliferação de células de carcinoma papilífero de tiroide. Esses dados sugerem um importante papel da sinalização Notch na oncogênese do carcinoma papilífero de tiroide induzida pela sinalização MAPK e que a via Notch pode ser uma potencial terapia adjuvante no câncer de tiroide. / Genetic alterations in RET, RAS and BRAF result in constitutive activation of the MAPK signaling and are present in approximately 70% of papillary thyroid carcinomas, the most prevalent form of thyroid cancer. Multiple signaling pathways can act with MAPK pathway in thyroid oncogenesis. In this study, we tested the hypothesis that MAPK pathway control Notch signaling and that the crosstalk between these pathways plays an important role in thyroid cancer cell differentiation and proliferation. The conditional activation of RET/PTC3 and BRAFT1799A enhanced Notch signaling pathway in normal follicular thyroid cell. By contrast, pharmacological inhibition of MAPK reduced Notch signaling in TPC-1 cell line derived from papillary thyroid carcinoma. Transgenic mice expressing BRAFT1799A restrict in thyroid gland and human papillary thyroid carcinoma samples showed higher Notch1 expression. NOTCH1 overexpression in normal thyroid follicular cell increased NIS protein expression. Pharmacological inhibition and RNA interference of Notch signaling showed an anti-proliferative effect in papillary thyroid carcinoma cells. Furthermore, the combination of MAPK and Notch signaling inhibitors reduced papillary thyroid carcinoma proliferation. These data suggest an important role of Notch signaling in papillary thyroid carcinoma induced by MAPK-related oncogenes and that Notch signaling pathway could be a potential adjuvant therapy in thyroid cancer.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2000. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 89-105).

O parasita da malária Plasmodium falciparum percebe o ambiente em que se encontra, elaborando respostas celulares adequadas, que envolvem secreção de proteínas, crescimento e diferenciação celular. Fatores relacionados com a geração de segundos-mensageiros e proteínas efetoras da sinalização celular estão descritos na literatura. Porém, a função de receptores responsáveis pela percepção de estímulos extracelulares no parasita é um tema pouco explorado. A identificação in silico de receptores de sete domínios transmembrânicos putativos no genoma de P. falciparum possibilitou a exploração da função dos mesmos. A tese caracteriza funcionalmente dois receptores, PFSR10 e PFSR25. A expressão proteica dos receptores foi demonstrada em fases eritrocíticas de P. falciparum. Os receptores possuem candidatos a parceiros moleculares que executam diversas funções celulares, entre elas invasão do eritrócito, endocitose e exocitose. Os receptores foram transfectados em células de mamíferos e, através de ensaios de dinâmica de cálcio de high-throughput, sugere-se que PFSR10 codifique um receptor que participa na percepção de ATP extracelular e que PFSR25 codifique um sensor de KCl. O trabalho também sugere que KCl modula cálcio citosólico em P. falciparum e que parasitas nocaute para PFSR25 são incapazes de modular cálcio citosólico em resposta a KCl. / The malaria parasite P. falciparum perceives its milieu and elaborates adequate intracellular responses, that involve protein secretion, growth and cell differentiation. Factors related to second messengers generation and effectors of cell signaling are described in the literature. However, the function of receptors responsible for stimulus perception remains elusive. The in silico identification of putative seven transmembrane receptors in the Plasmodium falciparum genome allowed the exploration of their function. In the thesis, two putative receptors were characterized, PFSR10 and PFSR25. The proteic expression of the receptors was demonstrated in erythrocytic stages of P. falciparum. The receptors have putative interaction partners that participate in cellular functions such as invasion, exocytosis and endocytosis.The receptors were transfected in mammalian cells and, through high-throughput calcium dynamics assays, it is suggested that PFSR10 codes for a receptor that participates in extracellular ATP perception and that PFSR25 codes for a KCl sensor. It is also suggested that KCl modulates cytosolic calcium in response to KCl and that knockout parasites for PFSR25 are incapable of modulating cytosolic calcium in response to KCl.

A colina quinase, 1ª enzima de uma via que forma 45% da membrana de P. falciparum foi clonada, expressa e purificada, e um anticorpo policlonal desenvolvido. Estudos de transporte da enzima demonstraram que a PfChok é transportada para o citossol por uma via independente do inibidor Brefeldina A. Obteve-se informação da estrutura secundária e uma modelagem da estrutura terciária da proteína, tendo sido localizados sítios de fosforilação para proteínas quinases. Através de uma nova abordagem em genômica funcional de Plasmodium, o gene da proteína adaptadora PfRACK foi códon otimizado e inserido em células de mamíferos. Estudos de dinâmica de Ca2+ em microscopia confocal indicaram que sua sinalização nas células estudadas é inibida na presença de PfRACK, dependente da interação direta com receptores de IP3. A enzima localiza-se distintivamente em relação à RACK1 endógena. Nossos resultados abrem a possibilidade de novos estudos, ao estabelecer a transfecção de genes do parasita para estudos de mecanismos de transdução de sinal na interação Plasmodium-hospedeiro. / Choline Kinase, the first enzyme of a pathway responsible for up to 45% of Plasmodium falciparum parasite membrane, was cloned, expressed and purified, and a policlonal antibody was developed to follow its localization along the intraerythrocytic cycle. The enzyme is transported to parasite´s cytosol, through a pathway independent of the Endoplasmic Reticulum to Golgi apparatus. Information about the secondary structure was obtained, as well a model of the tertiary structure, where several kinases phosphorylation sites were identified. The PfRACK gene was codon-optimized and transfected in mammalian cells. Dynamic Ca2+ studies by confocal microscope have revealed that Ca2+ signaling of the transfected cells was inhibited by PfRACK, dependent on direct interaction with InsP3 receptors. The protein co-localizes distinctly of the endogenous RACK1. Our results open new possibilities of malaria functional genomics, by establishing the transfection of parasites genes into mammalian cells with the aim to study transduction signals mechanisms of the Plasmodium-host interaction.

A colina quinase, 1ª enzima de uma via que forma 45% da membrana de P. falciparum foi clonada, expressa e purificada, e um anticorpo policlonal desenvolvido. Estudos de transporte da enzima demonstraram que a PfChok é transportada para o citossol por uma via independente do inibidor Brefeldina A. Obteve-se informação da estrutura secundária e uma modelagem da estrutura terciária da proteína, tendo sido localizados sítios de fosforilação para proteínas quinases. Através de uma nova abordagem em genômica funcional de Plasmodium, o gene da proteína adaptadora PfRACK foi códon otimizado e inserido em células de mamíferos. Estudos de dinâmica de Ca2+ em microscopia confocal indicaram que sua sinalização nas células estudadas é inibida na presença de PfRACK, dependente da interação direta com receptores de IP3. A enzima localiza-se distintivamente em relação à RACK1 endógena. Nossos resultados abrem a possibilidade de novos estudos, ao estabelecer a transfecção de genes do parasita para estudos de mecanismos de transdução de sinal na interação Plasmodium-hospedeiro. / Choline Kinase, the first enzyme of a pathway responsible for up to 45% of Plasmodium falciparum parasite membrane, was cloned, expressed and purified, and a policlonal antibody was developed to follow its localization along the intraerythrocytic cycle. The enzyme is transported to parasite´s cytosol, through a pathway independent of the Endoplasmic Reticulum to Golgi apparatus. Information about the secondary structure was obtained, as well a model of the tertiary structure, where several kinases phosphorylation sites were identified. The PfRACK gene was codon-optimized and transfected in mammalian cells. Dynamic Ca2+ studies by confocal microscope have revealed that Ca2+ signaling of the transfected cells was inhibited by PfRACK, dependent on direct interaction with InsP3 receptors. The protein co-localizes distinctly of the endogenous RACK1. Our results open new possibilities of malaria functional genomics, by establishing the transfection of parasites genes into mammalian cells with the aim to study transduction signals mechanisms of the Plasmodium-host interaction.