<p>This study reports on a proteomic analysis of sorghum proteomes in response to salt and hyperosmotic stresses. Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) in combination with mass spectrometry (MS) was used to separate, visualise and identify sorghum proteins using both sorghum cell suspension cultures and whole plants. The sorghum cell suspension culture system was used as a source of culture filtrate (CF) proteins. Of the 25 visualised CBB stained CF spots, 15 abundant and well-resolved spots were selected for identification using a combination of MALDI-TOF and MALDI-TOFTOF MS, and database searching. Of these spots, 14 were positively identified as peroxidases, germin proteins, oxalate oxidases and alpha-galactosidases with known functions in signalling processes, defense mechanisms and cell wall metabolism.</p>

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 &#956;M, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de &#946;-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 &#956;g.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de &#946;-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 &#956;M methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of &#946;-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 &#956;g.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of &#946;-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A produção e a otimização de substâncias de valor medicinal têm sido alcançadas pelo uso das técnicas de cultura de tecidos vegetais, que têm apresentado grande relevância quando se considera o status de conservação de uma espécie ou sua ocorrência em ambientes ameaçados. No presente trabalho foi avaliada a produção de carotenoides em culturas de calos e células em suspensão de Cleome rosea Vahl ex DC, espécie nativa encontrada em áreas de restinga nos estados do Rio de Janeiro e de São Paulo. Plantas micropropagadas obtidas a partir de raízes produzidas in vitro foram usadas como fonte de explantes para o início das culturas de calos. A produção de massa calogênica foi avaliada em meio MS suplementado com diferentes concentrações das auxinas ácido 2,4-diclorofenoxiacético e ácido 4-amino- 3,5,6-tricloropicolínico, na presença de luz ou no escuro. O uso de diferentes meios básicos de cultura (B5, Nitsch, White) também foi avaliado. A calogênese foi induzida em todos os tratamentos, entretanto a maior produção de biomassa foi alcançada pelas culturas mantidas na presença de luz. A maior produção de massa calogênica foi obtida em culturas iniciadas no meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D. A exposição das culturas à luz foi um fator essencial para a produção de carotenoides, que só ocorreu nas culturas mantidas nessa condição. Culturas de calos foram submetidas a tratamentos com substâncias elicitoras (extrato de levedura, metil jasmonato, quitosana) em diferentes concentrações e por um período de exposição de sete ou 14 dias visando otimizar a produção do pigmento. A maior produção de carotenoides nas culturas elicitadas foi alcançada com o tratamento com metil jasmonato (MJ) na concentração de 300 &#956;M, independentemente do tempo de exposição ao elicitor. Análises cromatográficas mostraram que o processo de elicitação com MJ induziu ao aumento na produção de &#946;-caroteno. Calos elicitados nessa condição foram usados para iniciar culturas de células em suspensão (CCS). Estas culturas foram acompanhadas por três subculturas realizadas a cada 20 dias, durante a fase exponencial de crescimento. Embora as CCS tenham mantido uma produção de biomassa constante ao longo das subculturas, os valores de produção de carotenoides foram inferiores àqueles alcançados pelas culturas de calos e não houve diferenças estatísticas significativas quando comparadas às CCS iniciadas a partir de calos não elicitados. Extratos de calos produzidos em meio MS suplementado com 0,2 mg.L-1 de 2,4-D foram avaliados quanto à sua capacidade antioxidante por meio da incubação dos extratos com DNA plasmidial em presença de cloreto estanoso (SnCl2), um potente agente redutor capaz de produzir quebras na molécula de DNA. Os extratos foram avaliados em concentrações crescentes (25 - 500 &#956;g.mL-1) e apresentaram uma proteção dose dependente à ação do SnCl2. Estudos de toxicidade com o modelo de Artemia salina demonstraram que os extratos não apresentaram toxicidade nas concentrações avaliadas. Os resultados alcançados mostram que a elicitação foi eficiente para a otimização da produção de &#946;-caroteno nas culturas in vitro e que os extratos obtidos a partir desses materiais apresentaram atividade antioxidante, indicando o êxito das técnicas de cultura de tecidos para a produção deste metabólito sob condição in vitro. / The production and optimization of plants secondary metabolites with medicinal value have been achieved by using plant tissue culture techniques, which have showed great relevance when considering the conservation status of a species or their occurrence in degraded environments. The present study assessed the production of carotenoids in callus and cell suspension cultures of Cleome rosea Vahl ex DC (Capparaceae), a Brazilian native herbaceous species that occurs mainly in coastal sandy plains (restingas) in the states of Rio de Janeiro and São Paulo. Micropropagated plants obtained from in vitro roots were used as source of explants for callus cultures. Callus biomass accumulation was evaluated on MS medium supplemented with different concentrations of the auxins 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 4-Amino-3,5,6-trichloropicolinic acid (PIC), in the presence of light and in the dark. The use of different culture basal media (B5, Nitsch, and White) was also evaluated. Calogenesis was induced in all treatments; however greater efficiency was achieved by cultures maintained in the light. Exposure of cultures to light was also an essential factor to induce the production of carotenoids. The highest biomass accumulation was achieved by cultures established on MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D. Callus cultures were subject to treatments with a range of elicitors (chitosan, methyl jasmonate, yeast extract), at different concentrations and time of exposure (7 or 14 days). The highest production of carotenoids was achieved by cultures treated with 300 &#956;M methyl jasmonate (MJ), regardless of time exposure. The chromatographic analysis showed that elicitation with MJ induced an increase in the production of &#946;-carotene. Elicited calluses were used to establish cell suspension cultures (CSC). These cultures were evaluated during three subsequent subcultures performed at 20 days each during the exponential growth phase. Although the CSC have maintained a steady biomass accumulation along successive subcultures, carotenoids content were lower than those achieved by callus cultures and did not present significant differences when compared to CSC established from no elicited callus. Extracts of callus obtained from MS medium supplemented with 0.2 mg.L-1 2,4-D were evaluated for their antioxidant potential. These extracts were incubated with plasmid DNA in the presence of stannous chloride (SnCl2), a potent reduced agent. Extracts were used at increasing concentrations (25 - 500 &#956;g.mL-1) and showed a dose-dependent protective action, regardless of their origin. Studies of toxicity using the brine shrimp lethality bioassay revealed that the extracts were not toxic at tested concentrations. This study showed that the use of elicitation was a powerful tool in the optimization of &#946;-carotene production in in vitro cultures of C. rosea and that extracts obtained from these cultures have antioxidant activity, indicating the success of plant tissue culture techniques for production of this metabolite under in vitro condition.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Metabólitos secundários produzidos por espécies vegetais são, há tempos, reconhecidos como moléculas capazes de desempenhar ações farmacológicas. Entre as plantas medicinais mais utilizadas estão espécies do gênero Hypericum, pertencente à família Guttiferae, e que possui 494 espécies. Destas, aproximadamente 20 estão distribuídas no sul e sudeste do Brasil e apresentam o acúmulo de compostos fenólicos como flavonoides, xantonas, benzopiranos e floroglucinois. Como forma de garantia da qualidade e quantidade de plantas medicinais para consumo da indústria farmacêutica, bem como uma alternativa para preservação das espécies, o estabelecimento de protocolos de cultivo apresenta-se como uma opção vantajosa frente ao uso de plantas coletadas diretamente de seus locais de crescimento. Por este motivo, espécies nativas do sul do Brasil como H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre tiveram seus protocolos de cultivo in vitro e ex vitro (aclimatização) estabelecidos, verificando-se a possibilidade da produção de biomassa vegetal uniforme e de maneira otimizada, com a manutenção da síntese dos metabólitos de interesse. H. teretiusculum, espécie recém identificada na região central do estado, apresenta o acúmulo de metabólitos secundários e escassos relatos na literatura, focados em seus aspectos botânicos. Estes fatos levaram ao estabelecimento do protocolo de cultivo in vitro e aclimatização da espécie. As plântulas apresentaram crescimento satisfatório quando cultivadas in vitro em meio MΔ apenas ou suplementado com ácido indol butírico. Após 18 semanas de aclimatização, verificou-se o aumento da biomassa e o acúmulo dos derivados do floroglucinol uliginosina B e isohyperbrasilol B, verificados em traços na planta in natura, bem como hiperbrasilol B e japonicina A, não detectados nos extratos das plantas coletadas de seu habitat natural. Este resultado evidencia a relevância do cultivo in vitro como forma de otimização da produção de moléculas bioativas. Entre as espécies nativas estudadas, H. polyanthemum destaca-se por ser a única, até o momento, produtora dos três benzopiranos, HP1, HP2 e HP3. Além deles, a planta também produz o derivado do floroglucinol uliginosina B. A presença de HP1, com atividades analgésica e antidepressiva bem como de uliginosina B, que se classifica como novo protótipo para moléculas antidepressivas, levou ao desenvolvimento de um depósito de patente para o extrato n-hexano da espécie e requer estudos para a investigação da otimização em sua biossíntese. Neste sentido, a influência da imposição de estresse abiótico (ácido salicílico e dano mecânico, sozinhos ou combinados, fertilização e seca, sozinhos ou combinados) em plantas aclimatizadas de H. polyanthemum foi investigada na décima oitava semana de aclimatização. Embora HP2 não tenha apresentado aumento em nenhum dos tratamentos aplicados, o aumento de 40 e 6 vezes na produção de uliginosina B nas folhas e flores, respectivamente, destaca-se entre os resultados obtidos, bem como aumento significativo na síntese de HP1 nas folhas e flores e HP3 nas folhas após a aplicação de seca e seca com fertilização, respectivamente. Os resultados sugerem que a biossíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum pode ser consideravelmente incrementada com a exploração do recurso da imposição de estresse hídrico no mesmo. O estabelecimento do cultivo in vitro de raízes adventícias de H. polyanthemum foi realizado como alternativa de produção rápida e “limpa” dos metabólitos secundários de interesse. No entanto, embora apresentando crescimento satisfatório em meio líquido, a síntese de benzopiranos e floroglucinois não foi verificada, mas a produção de diversas xantonas. Interessante é ressaltar que apenas traços de uma xantona é relatado para plantas in natura da espécie, não sendo detectada em plântulas cultivadas in vitro. Com o objetivo de compreender a produção e regulação na síntese destes compostos, realizou-se a investigação de enzimas poliacetídeo sintases (PKS) do tipo III nos tecidos da espécie, com o objetivo principal da obtenção de uma isobutirofenona sintase, envolvida com a biossíntese de floroglucinois e benzopiranos. Dos screenings realizados com primers de expressão de algumas PKS do tipo III foi possível isolar uma benzofenona sintase (BPS) das culturas de células em suspensão e um fragmento 3’-terminal de uma ORF específica para PKS do tipo III, sem apresentar enzimas funcionalmente relacionadas à BPSs. Estes achados concordam com o perfil fitoquímico das culturas de células em suspensão, que apresentam no mínimo duas xantonas como componentes majoritários, e das plântulas in vitro, que apresentam majoritariamente benzopiranos e derivados do floroglucinol em seus extratos, sem detecção de estruturas relacionadas à xantonas. Considerados em seu conjunto, os resultados do presente trabalho contribuem para a preservação e manutenção da qualidade do material vegetal das espécies de Hypericum com potencial uso na terapêutica, bem como contribui para o entendimento da biosíntese dos principais metabólitos de H. polyanthemum que demonstram variar de acordo com o tecido vegetal. / Plant secondary metabolites are long ago known to be able to perform pharmacological effects. Hypericum genus possesses 494 species distributed around the world and approximately 20 grow in south Brazil and accumulate phenolic compounds such as flavonoids, xanthones, benzopyrans and phloroglucinol derivatives. Aiming plant quantity and quality for pharmaceutical industry purposes, as well as to avoid natural resource exploitation, in vitro and ex vitro (acclimatization) protocols were established for H. polyanthemum, H. ternum, H. myrianthum, H. carinatum e H. campestre, affording uniform and increased vegetal biomass. H. teretiusculum is a species recently found in the state center, demonstrating secondary metabolite accumulation and only few information in literature, most of them directed to botanical aspects. These data leaded to the establishment of in vitro and ex vitro propagation protocols for the species. Plants were successfully micropropagated in MΔ medium with or without IBA supplementation. After 18 weeks of field growth, vegetal biomass increase and phloroglucinol derivatives accumulation was verified, with uliginosin B and isohyperbrasilol B, just found as traces in in natura plants as well as hyperbrasilol B and japonicin A, not detected in plants harvested directly from the wild. These results attest the relevance of cultivation protocols establishment aiming to optimize bioactive molecules obtainment. Among the native studied species, H. polyanthemum is highlighted for HP1, HP2 and HP3 benzopyrans productions, described just for the species until now. Besides, the phloroglucinol uliginosin B is also produced. The presence of HP1, with antinociceptive and antidepressant activities and uliginosin B, classified as a novel prototype for antidepressant-like molecules, a patent was deposited for n-hexanic extract of the species, claiming for investigations focusing on biosynthesis increment. Guided for this objective, abiotic stresses (SA application and mechanical damage, alone or combined, mild fertilization and drough, alone or combined) was imposed to acclimatized plants of H. polyanthemum on eighteenth week of field growth. Although HP2 was not increased with any of the applied treatments, a 40-fold and 6-fold increase on uliginosin B production in leaves and reproductive parts, respectively are highlighted among the obtained results, as well as significant increase in HP1 in leaves and HP3 in reproductive parts after drought and drought + fertilization treatment, respectively. The data suggest that main H. polyanthemum metabolites might be strongly induced by drought stress modulation. The establishment of in vitro adventitious root cultures of H. polyanthemum was described as alternative for rapid and “clean” secondary metabolites obtainment. Nevertheless, even demonstrating ability for stable in vitro growth, benzopyrans and phloroglucinol derivatives were not detected in this tissue, but a wide array of xanthones was detected instead. It is interesting to point out that only traces of xanthone is related for in natura plants and such class of compounds was not detected in in vitro plants. Aiming to understand biosynthesis of these compound, type III polyketide synthases (type III PKS) were investigated in H. polyanthemum tissue, focusing mainly on BUS discovery, involved in benzopyrans and phloroglucinol biosynthesis. After screening cell suspension cultures cDNA, a benzophenone synthase (BPS) enzyme was isolated and biochemically characterized, while in vitro plants afforded a 3’-end fragment of a type III PKS specific ORF and neither other enzymes related with xanthone biosynthesis. These data are in accordance with phytochemical profile displayed by cells suspensions, presenting at least two xanthones as majoritarian compounds in the extracts, and plants, which just accumulate benzopyrans and uliginosin B. Considered compiled data, the present work direct medicinal plant studies into increment of valuable secondary metabolites.

Foi investigada a resposta antioxidante de culturas em suspensão celular de café (Coffea arabica L.) ao cádmio (Cd) e níquel (Ni). As células de café foram tratadas por doze dias com zero (controle), 0,05 e 0,5 mM de NiCl2 ou CdCl2. O Cd e o Ni acumularam rapidamente nas células e este acúmulo foi diretamente correlacionado com o aumento na concentração de metal no meio externo. Em 0,05 mM CdCl2 e 0,05 mM NiCl2, o crescimento foi estimulado, mas em 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2 a taxa de crescimento foi reduzida. As alterações no metabolismo do oxigênio ativo foram detectadas pela análise visual, assim como pelo aumento na peroxidação lipídica, nos tratamentos com 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2. As atividades das enzimas catalase (CAT; EC 1.11.1.6), glutationa redutase (GR; EC 1.6.4.2) e superóxido dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) aumentaram após exposição ao Cd, particularmente na maior concentração de CdCl2. A atividade da ascorbato peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) foi elevada por 0,05 mM CdCl2, mas não pode ser detectada em células cultivadas na maior concentração de CdCl2 após 24 h de cultivo, enquanto que a guaiacol peroxidase (GOPX; EC 1.11.1.7) não demonstrou um padrão claro de resposta ao tratamento com Cd. As atividades das enzimas CAT, GR, APX, GOPX e SOD foram aumentadas, particularmente nos períodos iniciais de exposição ao NiCl2 e as atividades foram maiores na dosagem 0,5 mM NiCl2, na maioria dos tempos de exposição testados. A análise em PAGE não desnaturante seguido pela revelação da atividade enzimática, apresentou uma isoenzima da CAT, nove isoenzimas da SOD e quatro isoenzimas da GR. As isoenzimas da SOD foram diferencialmente afetadas pelo tratamento com CdCl2 e NiCl2 e uma isoenzima da GR mostrou responder especificamente ao CdCl2 e ao NiCl2. Os resultados sugerem que 0,5 mM CdCl2 e 0,5 mM NiCl2 podem levar ao estresse oxidativo. O CdCl2 e o NiCl2 a 0,05 mM não induziram peroxidação lipídica e a principal resposta aparenta ser via indução das atividades das enzimas SOD, CAT e APX nas células tratadas com Cd e das enzimas SOD, CAT, GOPX e APX nas células tratadas com Ni, para a remoção das espécies ativas de oxigênio (EAOs), e pela indução da GR para garantir a disponibilidade de glutationa reduzida. A síntese de peptídeos de ligação ao Cd, deve também estar relacionada com a inibição da atividade da APX, provavelmente devido ao esgotamento da glutationa e ascorbato na maior concentração de CdCl2. / The antioxidant responses of coffee (Coffea arabica L.) cell suspension cultures to cadmium (Cd) and nickel (Ni) were investigated. Coffee cells were treated for twelve days with 0 (control), 0.05 and 0.5 mM NiCl2 or CdCl2. Cd and Ni accumulated very rapidly in the cells and this accumulation was directly correlated with an increase in applied metal concentration in the external medium. At 0.05 mM CdCl2 and 0.05 mM NiCl2, growth was stimulated, but at 0.5 mM CdCl2 and 0.5 mM NiCl2 the growth rate was reduced. An alteration in activated oxygen metabolism was detected by visual analysis as well as by an increase in lipid peroxidation at 0.5 mM CdCl2 and 0.5 mM NiCl2. Catalase (CAT; EC 1.11.1.6), glutathione reductase (GR; EC 1.6.4.2) and superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) activity increased after Cd exposure, particularly at the higher concentration of CdCl2. Ascorbate peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) activity was higher at the lower CdCl2 concentration used, but could not be detected in cells growing in the higher CdCl2 concentration after 24 h of growth, whilst guaiacol peroxidase (GOPX; EC 1.11.1.7) did not show a clear response to Cd treatment. CAT, GR, APX, GOPX and SOD activities were increased due to Ni treatment, particularly at earlier NiCl2 exposure times and the activities were higher at 0.5 mM NiCl2 for most of exposure times tested. An analysis by non-denaturing PAGE followed by staining for enzyme activity, revealed one CAT isoenzyme, nine SOD isoenzymes and four GR isoenzymes. The SOD isoenzymes were differently affected by CdCl2 and NiCl2 treatment and one GR isoenzyme was shown to specifically respond to CdCl2 and NiCl2. The results suggest that the higher concentrations of CdCl2 and NiCl2 may lead to oxidative stress. CdCl2 and NiCl2 at 0.05 mM did not induce lipid peroxidation and the main response appeared to be via the induction of SOD, CAT and APX activities in Cd treated cells and SOD, CAT, GOPX and APX activities in Ni treated cells, for the removal of reactive oxygen species (ROS), and by the induction of GR to ensure the availability of reduced glutathione. The synthesis of Cd-binding proteins may also be related to the inhibition of APX activity probably due to glutathione and ascorbate depletion at higher CdCl2 concentration.

Philosophiae Doctor - PhD / This study reports on a proteomic analysis of sorghum proteomes in response to salt and hyperosmotic stresses. Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) in combination with mass spectrometry (MS) was used to separate, visualise and identify sorghum proteins using both sorghum cell suspension cultures and whole plants. The sorghum cell suspension culture system was used as a source of culture filtrate (CF) proteins. Of the 25 visualised CBB stained CF spots, 15 abundant and well-resolved spots were selected for identification using a combination of MALDI-TOF and MALDI-TOFTOF MS, and database searching. Of these spots, 14 were positively identified as peroxidases, germin proteins, oxalate oxidases and alpha-galactosidases with known functions in signalling processes, defense mechanisms and cell wall metabolism. / South Africa

Plant cell and tissue cultivations are of growing interest for the production of structurally complex and expensive plant-derived products, especially in pharmaceutical production. Problems with up-scaling, low yields and high-priced process conditions result in an increased demand for models to provide comprehension, simulation, and optimization of production processes. In the last 25 years, many models have evolved in plant biotechnology; the majority of them are specialized models for a few selected products or nutritional conditions. In this article we review, delineate, and discuss the concepts and characteristics of the most commonly used models. Therefore, the authors focus on models for plant suspension and submerged hairy root cultures. The article includes a short overview of modeling and mathematics and integrated parameters, as well as the application scope for each model. The review is meant to help researchers better understand and utilize the numerous models published for plant cultures, and to select the most suitable model for their purposes.

Philosophiae Doctor - PhD / Sorghum (Sorghum bicolorï, a drought tolerant cereal crop, is not only an important food source in the semi arid/arid regions but also a potential model for studying and gaining a better understanding of the molecular mechanisms of drought and salt stress tolerance in cereals. This study reports on a proteomic analysis of sorghum proteomes in response to salt and hyperosmotie stresses. Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) in combination with mass spectrometry (MS) was used to separate, visualise and identify sorghum proteins using both sorghum cell suspension cultures and whole plants. The sorghum cell suspension culture system was used as a source of culture filtrate (CF) proteins. Of the 25 visualised CBB stained CF spots, 15 abundant and well-resolved spots were selected for identification using a combination of MALDI- TOF and MALDI- TOFTOF MS, and database searching. Of these spots, 14 were positively identified as peroxidases, germ in proteins, oxalate oxidases and alpha-galactosidases with known functions in signalling processes, defense mechanisms and cell wall metabolism. Following 200 mM NaCl and 400 mM sorbitol stress treatments, the expression/abundance of a protein spot similar to a rice wall-associated protein kinase was upregulated in the sorghum secretome in response to both stresses. Amino acid sequence alignment of the matching peptides between these two proteins showed that the sorghum CF spot possesses a protein kinase domain. Therefore, this protein could possibly participate in cell signalling functions, which link the external environment with the cell's cytoplasm. Using whole plant systems, a comparative study of leaf protein expression between two sorghum varieties, AS6 (salt sensitive) and MN1618 (salt tolerant) was conducted. Forty well resolved spots of varying abundances were picked for MS analysis. Of these, 28 were positively identified, representing proteins with functions in carbohydrate metabolism (60.7%), proton transport (17.9%), protein synthesis (7.1%), hydrolytic functions (7.1%), nucleotide metabolism (3.6%) and detoxification (3.6%). Using PDQuest™ Advanced 2D Analysis Software version 8.0.1 (BIO-RAD), a comparative analysis of leaf proteome expression patterns between the two sorghum varieties was conducted. The results indicated proteins with similar expression patterns as well as qualitative and quantitative differences between the two leaf proteomes. The effect of 100 mM NaCI on leaf proteome expression between the two sorghum varieties was also studied. Western blotting analysis of leaf, sheath and root tissues using Hsp70 antibodies showed that this treatment induced Hsp70 expression, a known stress protein, in both varieties. Thereafter, the partially annotated leaf proteome map was used to landmark other salt responsive proteins. Examples of differential expression patterns included glutathione S transferase and hydroxynitrile lyase proteins whose abundances were upregulated in both varieties, while the large subunit of RuBisCo was downregulated in AS6 but upregulated in MN1618. Qualitative spot expression differences in response to salt stress were also observed between the two sorghum varieties but these remained unidentified after both MALDI-TOF and MALDI-TOF-TOF MS, possibly indicating novel and previously uncharacterised sorghum proteins. The results of this study can be used as reference tools by proteomics researchers worldwide as well as a foundation for future studies.