Made available in DSpace on 2016-06-02T19:31:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3839.pdf: 1626274 bytes, checksum: c075bd1efdbc3e1e45bfb76e257e5b8f (MD5) Previous issue date: 2011-06-10 / Universidade Federal de Sao Carlos / This study aimed to assess the effects of temperature on different aspects of aerobic and anaerobic degradation of aquatic macrophytes from different ecological groups: Cyperus giganteus (emergent), Eichhornia azurea (fixed floating) and Egeria najas (submerged). Considering these purposes, the carbon balance and mass decay, the cellulase and peroxidase activity in the degradation of cellulose and lignin, the oxygen consumption, as well as changes in pH, conductivity and humification degree caused by decomposition in the environment were analysed. In laboratory, decomposition chambers containing aquatic macrophyte and water samples were prepared and maintained under controlled conditions according to the experimental design. The results showed that: (i) temperature changes affected the mass loss coefficients of labile/soluble fractions of debris, but did not alter the mass loss coefficients of refractory fraction; (ii) the temperature increase accelerated the cellulose decay of E. azurea and E. najas detritus, being indifferent to those of C. giganteus; increased the lignin decay of C. giganteus and E. najas debris, although there was no lignin degradation of E. azurea within the experimental period; increased the peroxidase activity of the three species selected detritus and of the cellulase of C. giganteus and E. najas detritus, having the opposite effect on E. azurea debris; led to an increase in oxygen consumption in C. giganteus and E. azurea debris decomposition, having the opposite effect on E. najas decomposition; (iii) regardless to temperature, the content of particulate organic carbon and the half-life times were lower for submerged species and higher for the emerging one, which showed the highest contents of cellulose and lignin; (iv) the E. najas decomposition presented the highest dissolved oxygen consumption in the shortest time; (v) the mass loss of macrophytes detritus were faster under aerobic than under anaerobic condition. / Este estudo teve por objetivo verificar os efeitos da temperatura em diferentes aspectos da degradação aeróbia e anaeróbia de macrófitas aquáticas de diferentes grupos ecológicos: Cyperus giganteus (emergente), Eichhornia azurea (flutuante fixa) e Egeria najas (submersa). Para tanto, foram analisados o balanço de carbono e perda de massa, a atividade das enzimas celulase e peroxidase na degradação da celulose e da lignina, o consumo de oxigênio, bem como alterações de pH, condutividade e grau de humificação causadas pela decomposição no meio. Em laboratório, câmaras de decomposição contendo amostras de macrófita e água foram preparadas e mantidas em condições controladas conforme o delineamento experimental. Os resultados permitiram concluir que: (i) a variação de temperatura interferiu nos coeficientes de perda de massa da fração lábil/solúvel do detrito, mas não alterou os coeficientes de perda de massa da fração refratária; (ii) o aumento da temperatura acelerou o decaimento da celulose dos detritos de E. azurea e E. najas, sendo indiferente para os de C. giganteus; incrementou o decaimento da lignina dos detritos de C. giganteus e E. najas, embora não tenha sido observada a degradação da lignina nos detritos de E. azurea no período experimental; elevou a atividade da peroxidase nos detritos das três espécies selecionadas e da celulase nos detritos de C. giganteus e E. najas, tendo o efeito oposto nos detritos de E. azurea; levou a um aumento no consumo de oxigênio na decomposição dos detritos de C. giganteus e E. azurea, tendo efeito oposto na decomposição de E. najas; (iii) independentemente da temperatura, os teores de carbono orgânico particulado refratário e os tempos de meia-vida foram menores para a espécie submersa e maiores para a emergente, que apresentou os maiores teores de celulose e lignina; (iv) a decomposição de E. najas foi a que apresentou os maiores consumos de oxigênio dissolvido no espaço mais curto de tempo; (v) a perda de massa dos detritos das macrófitas ocorreu mais rapidamente sob condição aeróbia do que sob anaeróbia. Palavras-chave: celulose. celulase. lignina. peroxidase. temperatura. 8

A linhagem S1M29 de Penicillium echinulatum é um fungo filamentoso cujo sistema celulolítico tem potencial para aplicação em processos de degradação de materiais lignocelulósicos visando a obtenção de produtos com interesse biotecnológico, como o etanol de segunda geração. A abundância de biomassas lignocelulósicas associada à busca por alternativas aos combustíveis fósseis faz aumentar o interesse em estudos que envolvam a elucidação dos mecanismos de secreção de enzimas lignocelulolíticas. Neste estudo, o P. echinulatum S1M29 foi crescido em condições de indução para a produção de endoglicanases, celobiohidrolases, β-glicosidases, xilanases e swoleninas. Foram avaliados os perfis enzimáticos em géis de poliacrilamida e o padrão de expressão gênica para estas proteínas. Observou-se que a produção enzimática foi favorecida pela presença de celulose Celufloc E® e bagaço de cana-de-açúcar (BCA) no meio de cultivo em comparação à glicose, sendo que o uso de resíduo de biomassa proporcionou a obtenção dos melhores rendimentos. Resultado semelhante foi atingido na análise dos perfis de secreção enzimática em gel de poliacrilamida, sugerindo ainda, a presença de uma endoglicanase constitutiva de aproximadamente 80 kDa. O estudo de qRT-PCR revelou a presença de quatro genes para endoglicanases com padrão de expressão distintos, destacando-se um acúmulo de transcritos 9779,19 vezes superior à amostra calibradora do gene egl1 em 24 h de cultivo no meio formulado com celulose Celufloc E®. Este mesmo gene gerou 1257,58 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora em meio suplementado com BCA. Na avaliação da expressão relativa do gene para celobiohidrolase obteve-se expressão superior no meio formulado com BCA em 48 h em relação ao meio com celulose Celufloc E® em 24 h, correspondendo, respectivamente, a 6464,49 e 3093,26 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora. O gene para β-glicosidase expressou-se em meio formulado com BCA no início do cultivo, embora a atividade desta enzima tenha ocorrido ao final do cultivo. A expressão de xilanases foi mais significativa com o uso de celulose Celufloc E® no meio de cultivo. Já o gene para swolenina apresenta um perfil de expressão com valores semelhantes em comparação ao uso de celulose Celufloc E® e BCA no meio de cultivo, apesar da presença de BCA ter proporcionado uma expressão mais tardia. Para todos os genes avaliados foram verificados valores muito reduzidos de expressão quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono para o P. echinulatum. Observou-se ainda uma expressão coordenada de genes codificadores de endoglicanases, celobiohidrolase, β-glicosidase e swolenina. / Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2016-01-27T12:06:29Z No. of bitstreams: 1 Tese Denise Zampieri.pdf: 4586084 bytes, checksum: be5eb9fbb555f957a4e737205334ac6d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-27T12:06:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Denise Zampieri.pdf: 4586084 bytes, checksum: be5eb9fbb555f957a4e737205334ac6d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. / The strain S1M29 of Penicillium echinulatum is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential for application in the degradation process of lignocellulosic materials to obtain products of biotechnological interest, such as second-generation ethanol. The availability of lignocellulosic biomass associated with the search for alternatives to fossil fuels increases the interest in studies that involve understanding the secretion mechanisms of lignocellulolytic enzymes. In this study, P. echinulatum S1M29 was grown under inducing conditions for the production of endoglucanases, cellobiohydrolases, β-glucosidases, xylanases and swollenins. The enzyme secretion profiles were evaluated in polyacrylamide gels and the pattern of gene expression for these proteins was also assessed. It was observed that enzyme production was enhanced in the presence of cellulose Celufloc E® and sugar cane bagasse (SCB) in the culture medium compared to glucose, with the use of biomass residue providing the best yields. A similar result was obtained analyzing enzyme secretion profiles in polyacrylamide gels, suggesting the presence of constitutive endoglucanases of approximately 80 kDa. Studies with qRT-PCR revealed the presence of four genes encoding endoglucanases with distinct expression patterns, standing out an accumulation of transcripts from egl1 gene 9779.19 times higher than the calibrator sample in 24 h of growth in medium formulated with cellulose Celufloc E®. The same gene generated 1257.58 more accumulated transcripts than the reference sample in medium supplemented with SCB. Evaluation of gene expression for cellobiohydrolase yielded higher expression levels in the medium formulated with SCB in 48 h, in comparison to the medium containing cellulose Celufloc E® in 24 h, corresponding, respectively, to 6464.49 and 3093.26 more accumulated transcripts than the reference sample. The β-glucosidase gene was expressed in medium formulated with SCB at the beginning of growth, as opposed to that seen for activity of this enzyme, which occurred at the end of cultivation. The xylanase expression was more significant with the use of cellulose Celufloc E® in the culture medium. On the other hand, the gene for swollenin presents an expression profile with similar values compared to using cellulose Celufloc E® and SCB in the culture medium, although the presence of SCB has provided a later expression. Very low values of gene expression have been found for all genes evaluated when glucose was used as carbon source for P. echinulatum. A coordinated expression of endoglucanases, cellobiohydrolase, β-glucosidase and swollenin was was also verified.

Submitted by Ana Guimarães Pereira (agpereir@ucs.br) on 2017-07-14T14:43:43Z No. of bitstreams: 1 Tese Laisa dos Reis.pdf: 202579 bytes, checksum: 65cd12057624b5708899c86c663d936c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-14T14:43:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Laisa dos Reis.pdf: 202579 bytes, checksum: 65cd12057624b5708899c86c663d936c (MD5) Previous issue date: 2017-07-14 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul, FAPERGS.

Orientador: João Martins Pizauro Junior / Banca: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Haroldo Alves Pereira Junior / Resumo: Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas, uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares que ajudam na mineralização da matéria orgânica, liberação de carbono e nutrientes na forma de serem assimilados. Devido a esses importantes fatores é que cada vez mais aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas, ela é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose através da quebra da ligação ~,1-4. A partir disso foi realizada uma busca de gene r~lacionado com a hidrolise da celulose em biblioteca metagenômica de DNA extraído de solo de arboreto de eucalipto. Foram realizado testes bioquímicos e moleculares, partindo de um par de oligonucleotídeo iniciadores degenerado que foi construído para identificar gene da glucanase que está ligado na hidrolise da celulose. Com o teste bioquímico foi possível selecionar clones que estão relacionados com hidrolise da celulose, a confirmação dos clones positivos foi feita através de reações de PCR. Após a escolha do clone foi feita uma sub-biblioteca, os clones da sub-biblioteca foram sequenciados e através do sequenciamento foi possível encontrar gene relacionado à hidrólise da celulose. / Abstract: The microorganisms show a abundant genetic diversity and perform unique and crucial ecosystems maintence, one of this function is the produce of extracellular enzymes that mineralize organic matte and release carbon and nutrients in forms that can be assimilated. Due this important factors its increasing the search of enzymes who can be use on the manufacturing with better utilization and low cust. The cellulase belongs to this class of enzymes and its formed by a complex multienzimatic who its able to hydrolisar a cellulose trough the broke of the linked (3- 1-4. The cellulose, o homopolissacarideo wich we see in big amount on the biosphere. So, was made a screening to genes related with cellulase in metagenômic library of aboreto of eucalyptus cloning larg fragmenets in vector cosmídeo, with size who was between 30 and 45kb. There was made tests biochemists and molecular starting of a couple degenerate primes wich vvas made to identify the gene of glucanase that its connected in hydrolise da cellulose.With this tests we could detect the dones related with hydrolose of cellulose. / Mestre

O processamento da uva para produção de suco e vinho engloba diferentes processos tecnológicos, como por exemplo, o tratamento enzimático, onde usualmente são utilizadas preparações de enzimas comerciais, buscando-se aprimorar processos como clarificação e extração. Entretanto, esse é um tratamento que demanda elevado tempo de processamento, sendo relevante a busca por novas tecnologias a fim de apurar o processo. O ultrassom pode ser utilizado como uma alternativa para reduzir o tempo de processamento e acrescer qualidade ao produto, pois além de ser uma técnica sustentável, pode proporcionar benefícios no uso combinado com enzimas, favorecendo as reações em decorrência de seus efeitos. Neste trabalho, o uso em conjunto de tratamento enzimático (ET), ultrassom (US), e agitação mecânica (MS) foi avaliado na extração do mosto da uva Cabernet Sauvignon, a fim de compreender os efeitos das técnicas combinadas. Inicialmente, nove preparados enzimáticos comerciais foram caracterizados segundo suas atividades enzimáticas e aplicados para extração do mosto, avaliando a variação de temperatura (40, 50 e 60 °C), tempo (15 e 30 min), e concentração de enzima (0,01 a 2,0 U.g-1). Os melhores resultados foram obtidos com o preparado Zimopec PX5® nas condições de 1,0 U.g-1 de pectinase a 50 °C por 30 min. A extração do mosto apresentou aumento significativo nos parâmetros de qualidade avaliados (cor, sólidos solúveis totais, rendimento de extração, capacidade antioxidante, antocianinas totais) quando os três métodos de extração (US, MS e ET) foram combinados, principalmente na presença do ultrassom. Tendo em vista o efeito sinérgico obtido entre a aplicação enzimática e o ultrassom na extração do mosto, um novo estudo foi conduzido buscando investigar a influência da sonicação na eficiência catalítica das enzimas pectinase (PE), xilanase (XLN) e celulase (CE). Para isso, as atividades enzimáticas foram avaliadas em diferentes pHs e em amostras de enzima e substratos submetidas a um tratamento prévio de sonicação por tempos determinados (0 – 30 min). Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos foram estimados, apresentando um efeito positivo do US na atividade das enzimas. A sonicação prévia do substrato contribuiu significativamente para o aumento da atividade de XLN, enquanto a sonicação prévia da enzima melhorou a atividade da CE e PE. Os resultados apresentaram um aumento na velocidade de hidrólise das enzimas com o uso do US, assim como um aumento da eficiência catalítica (Vmax/Km), mostrando o potencial da aplicação do US para ativação das enzimas. De acordo com os resultados obtidos, pode-se afirmar que o ultrassom proporcionou melhorias na extração do mosto, podendo ser utilizado como uma técnica alternativa de processo, bem como apresentou efeitos benéficos sobre as atividades enzimáticas. / Grape processing for juice and wine production encompasses different technological processes, such as enzymatic treatment, that usually uses commercial enzyme preparations to improve clarification and extraction processes. However, this is a treatment that demands high processing time, being relevant the search for new technologies in order to improve the whole process. Ultrasound (US) can be used as an alternative to reduce the processing time and improve the quality of the product, moreover, it can provide benefits in the combined use with enzymes, favoring the enzymatic reactions. In this work, the combined use of enzymatic treatment (ET), ultrasound (US), and mechanical agitation (MS) was studied in order to understand the effects of the techniques on Cabernet Sauvignon must extraction. Initially, nine commercial enzyme preparations were characterized according to their enzymatic activities and applied to must extraction, evaluating temperature (40, 50 and 60 °C), time (15 and 30 min), and enzyme concentration (0.01 to 2.0 Ug-1). The best results were obtained for the preparation Zimopec PX5® under conditions of 1.0 U.g-1 of pectinase at 50 °C for 30 min. A significant increase on quality parameters (color, °Brix, yield, antioxidant capacity, total anthocyanins) was obtained to extraction combining the three methods (US, MS and ET), mainly when US were applied. Based on these previous results, a new study was conducted to investigate the influence of sonication on the catalytic efficiency of the enzymes pectinase (PE), xylanase (XLN) and cellulase (CE). The enzymatic activities were evaluated at different pH and in samples of enzyme and substrates submitted to a previous treatment of sonication by determined times (0 - 30 min). The kinetic and thermodynamic parameters were estimated, showing a positive effect of the ultrasonic treatment on the enzymatic activity. Previous sonication of the substrate contributed significantly to the increase in XLN activity, whereas the previous sonication of the enzyme improved the activity of CE and PE. This research showed the potential benefits of ultrasound treatment on reaction rate and catalytic efficiency (Vmax/Km) improvement of enzymes, attesting that US can be used to increase the catalytic efficiency of pectinase, xylanase and cellulase enzymes. According to the obtained results, it can be affirmed that ultrasound improved the extraction process, and can be applied as an alternative technique, as well as provided beneficial effects on the enzymatic activity.

My work concentrates on feeding behavior of overwintering diapausing and post {--} diapausing bark beetles and developmental treshold. This is done either biochemically by measuring the enzymatic activity in the midgut and by assessing the feeding status from the size and consistence of the food bolus in the gut. Detailed knowledge of feeding behaviour and development treshold may help to predict the overwintering success of local populations with all the consequencies for spring dispersal and reproduction.

A importância do estudo das celulases não se limita à aquisição de conhecimento científico, mas também ao grande potencial biotecnológico que elas representam. Isso se deve ao fato da celulose ser a molécula mais abundante presente na natureza e prover uma vasta gama de produtos e processos sustentáveis. Muitas famílias de celulases já foram bem caracterizadas, enquanto outras permanecem ainda desconhecidas. Dentre estas últimas, a família 45 das hidrolases de glicosídeos é a família de celulases fúngicas menos caracterizada tanto estruturalmente quanto funcionalmente. Recentemente foi proposta a divisão dessa família em três subfamílias e, até agora, apenas membros da subfamília A tiveram enzimas estruturalmente elucidadas. Nesse trabalho reportamos a estrutura cristalográfica da proteína recombinante endoglucanase de Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), a primeira das hidrolases de glicosídeos da subfamília C, e seu complexo com celobiose a 1,4 Å e 1,7 Å de resolução, respectivamente. A PcCel45A é uma enzima de domínio único, com uma estrutura em β-barril e seu empacotamento geral remete ao formato de âncora. O sítio ativo da enzima forma um longo sulco na superfície da estrutura, sendo que o seu centro catalítico é diferente das outras enzimas publicadas dessa família e o aspartato catalítico, que atua como aceptor de próton na reação de inversão, (Asp10) não é conservado. Adicionalmente, a estrutura cristalográfica dessa enzima apresenta mais similaridades com as β-expansinas (proteínas de plantas) e transglicosilases líticas (proteínas que clivam o peptidoglicano de bactérias) do que com as outras representantes da família 45, o que a torna ainda mais singular. Para entendermos melhor seu funcionamento foram realizadas mutações sítio-dirigidas nos principais resíduos do sítio ativo. O Asp121, conhecido por participar da reação de inversão das outras enzimas da família como doador de próton, mostrou-se essencial para a atividade da enzima, enquanto que outros resíduos conservados como a Tyr25, o Trp161 e o Asp92 afetaram, mas não aniquilaram a atividade da enzima, apresentando aproximadamente 20%, 50% e 10% da atividade da enzima nativa, respectivamente. / The importance of the study of the cellulases is not limited to generating significant scientific knowledge, since these enzymes represents an enormous potential in biotechnology. This is partly because cellulose is the most abundant molecule in nature and provides a wide range of products and sustainable process. Many cellulases families have been well characterized, while others still remain unknown. Among them, the glycoside hydrolase family 45 is the least well characterized both structurally and functionally, between fungal cellulases. It was recently proposed the subdivision of this family into three subfamilies, with structural information available only for subfamily A. In this work, we report the chrystallographic structure of the recombinant endoglucanase from Phanerochaete chrysosporium (PcCel45A), the first GH45 subfamily C and its complex with cellobiose at 1.4 Å and 1.7 Å respectively. The PcCel45A is a single domain enzyme, which has a β-barrel structure with the overall shape resembling an anchor. The active site of the enzyme has a long cleft on the surface, being remarkably different from those members of subfamily A, and the catalytic aspartate responsible for acting as proton acceptor (Asp10) is not present. Additionally, the chrystallographic structure of this enzyme has shown more similarity with β -expansins (plant proteins) and lytic transglycosylase (proteins that cleave the peptidoglycan of bacteria) than others representants of family 45, which makes it more singular. For a better understanding of its function, we perform pontual mutations in the main residues from active site. The Asp121, known for acting as proton acceptor in the inversion reaction of others enzymes, proved to be essential for the enzyme activity, while others conserved residues as Tyr25, Trp161 and Asp92 affected but not annihilated the enzyme activity, leaving approximately 20%, 50% and 10% of the native enzyme activity.

Na produção do etanol 2G, as celulases representam um componente importante do custo. Com base em informações da literatura e resultados obtidos no Laboratório de Engenharia Bioquímica da Escola Politécnica da USP, foi feito um estudo do custo de produção das celulases via fermentação em estado sólido (FES) em escala industrial. Foram consideradas as seguintes variáveis no processo de produção das celulases, denominadas cenários de produção: concentração das celulases no meio de cultura de 1 a 150 FPU/gms; produtividade em celulases em 0,11 e 0,45FPU/gms.h; atividade de celulase na hidrólise de bagaço de cana-de-açúcar entre 7 e 30 FPU/g de substrato seco; massa de bagaço de cana a ser hidrolisada entre 5 e 30% do bagaço gerado numa usina sucroalcooleira de referência (1.000.000 ton. de cana-de-açúcar /ano); custo dos substratos para a FES variando entre US$6,00 a US$12,00 por tonelada para o bagaço de cana-de-açúcar (80% da massa do meio) e US$80,00 a US$110,00 por tonelada para o farelo de trigo (20% da massa do meio); capacidade volumétrica dos reatores de FES variando entre 5 e 50 m3. Os impactos das variáveis consideradas foram: concentração de celulases no meio de cultura, acima de 45FPU/gms causam reduções menores que 5% no custo de produção; produtividades iguais em celulases (0,45FPU/gms.h), apresenta um processo 11% menos custoso para aquela com maior produção de enzimas, em relação ao tempo de fermentação; destinação de até 10% do bagaço gerado pela usina, reduz em 7% o custo de produção das celulases e a dosagem de celulase não causa redução significativa nos custos de produção, assim como o custo das matérias-primas; o aumento da capacidade dos reatores de FES causam redução de até 47% no custo de produção das celulases. A análise de regressão linear das variáveis apresentadas indica qual o impacto percentual dobre o custo de produção das celulases: quantidade de bagaço de cana-de-açúcar destinado à hidrólise (0,6%), atividade enzimática para a reação de hidrólise (0,3%), produção de celulase (73,4%), volume dos reatores de inóculo (0,5%), volume dos reatores de FES (2,7%), tempo de crescimento do inóculo (0,1%), tempo de fermentação (3,7%), custo do bagaço de cana-de-açúcar (0,9%), custo do farelo de trigo (0,6%) e outras variáveis não analisadas (17,2%). Conclui-se que, com os dados atuais sobre FES, a probabilidade de se obter um processo em escala industrial com custo de produção de celulase menor que US$0,50/100.000FPU é de 15%. Desenvolvimento de culturas microbianas mais produtivas em celulases e tecnologias mais avançadas de reatores de grande escala, são necessárias à viabilidade da produção das celulases via FES para aplicação na hidrólise de celulose. / In ethanol 2G production, cellulases are an important component of the cost. Based on information from literature and results obtained in the Labotatório de Engenharia Bioquímica da Escola Politécnica da USP, a study was made of the production cost of cellulases via solid state fermentation (SSF) on industrial scale. The following variables were considered in the production of cellulases, called \"production scenarios\": the concentration of cellulase in the culture medium from 1 to 150 FPU / gms; productivity cellulases in 0.11 and 0.45 FPU / gms.h; cellulase activity in the hydrolysis of bagasse from sugar cane between 7 and 30 FPU / g substrate dry mass; cane bagasse hydrolyzed to be between 5 and 30% of sugarcane bagasse generated in a reference plant (1,000,000 ton of cane sugar per year) and the cost of substrates for SSF ranging from $ 6.00 to $ 12.00 per ton for the sugarcane bagasse (80% by weight of medium) and $ 80, 00 to $ 110.00 per ton for wheat bran (20% of the mass medium); volumetric capacity of the reactors of FES ranged between 5 and 50 m3. The impacts of the variables considered were: concentration of cellulase in the culture medium above 45FPU/gms cause reductions of less than 5% of the cost of production; for equal productivities of cellulose (0.45 FPU / gms.h) shows a process 11% less costly when the production of enzymes is higher in relation to fermentation time; using up to 10% of sugarcane bagasse generated by the reference plant, reduces by 7% the cost of production of cellulases and cellulase dosage does not cause significant reduction in production costs as well as the cost of raw materials; increasing the capacity of the reactors of FES cause a reduction of up to 47% on cost of production of cellulases. The linear regression analysis of the variables presented indicates what percentage impact the production cost of cellulases: The amount of bagasse cane sugar for the hydrolysis (0.6%), enzymatic activity for the hydrolysis reaction (0, 3%), production of cellulase (73.4%), the reactor volume of inoculum (0.5%), volume of the reactors of FES (2.7%), time of growth of the inoculum (0.1%) fermentation time (3.7%), cost of sugarcane bagasse (0.9%), cost of wheat bran (0.6%) and other variables not analyzed (17.2%). It was concluded that with current data on FES, the probability of obtaining a process on an industrial scale with production cost of cellulase less than $ 0.50/100.000FPU is 15%. Development of microbial cultures more productive in cellulases and more advanced technologies for large-scale reactors are necessary for the viability of the production of cellulases for FES for application in the hydrolysis of cellulose.

A linhagem S1M29 de Penicillium echinulatum é um fungo filamentoso cujo sistema celulolítico tem potencial para aplicação em processos de degradação de materiais lignocelulósicos visando a obtenção de produtos com interesse biotecnológico, como o etanol de segunda geração. A abundância de biomassas lignocelulósicas associada à busca por alternativas aos combustíveis fósseis faz aumentar o interesse em estudos que envolvam a elucidação dos mecanismos de secreção de enzimas lignocelulolíticas. Neste estudo, o P. echinulatum S1M29 foi crescido em condições de indução para a produção de endoglicanases, celobiohidrolases, β-glicosidases, xilanases e swoleninas. Foram avaliados os perfis enzimáticos em géis de poliacrilamida e o padrão de expressão gênica para estas proteínas. Observou-se que a produção enzimática foi favorecida pela presença de celulose Celufloc E® e bagaço de cana-de-açúcar (BCA) no meio de cultivo em comparação à glicose, sendo que o uso de resíduo de biomassa proporcionou a obtenção dos melhores rendimentos. Resultado semelhante foi atingido na análise dos perfis de secreção enzimática em gel de poliacrilamida, sugerindo ainda, a presença de uma endoglicanase constitutiva de aproximadamente 80 kDa. O estudo de qRT-PCR revelou a presença de quatro genes para endoglicanases com padrão de expressão distintos, destacando-se um acúmulo de transcritos 9779,19 vezes superior à amostra calibradora do gene egl1 em 24 h de cultivo no meio formulado com celulose Celufloc E®. Este mesmo gene gerou 1257,58 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora em meio suplementado com BCA. Na avaliação da expressão relativa do gene para celobiohidrolase obteve-se expressão superior no meio formulado com BCA em 48 h em relação ao meio com celulose Celufloc E® em 24 h, correspondendo, respectivamente, a 6464,49 e 3093,26 vezes mais transcritos acumulados que a amostra calibradora. O gene para β-glicosidase expressou-se em meio formulado com BCA no início do cultivo, embora a atividade desta enzima tenha ocorrido ao final do cultivo. A expressão de xilanases foi mais significativa com o uso de celulose Celufloc E® no meio de cultivo. Já o gene para swolenina apresenta um perfil de expressão com valores semelhantes em comparação ao uso de celulose Celufloc E® e BCA no meio de cultivo, apesar da presença de BCA ter proporcionado uma expressão mais tardia. Para todos os genes avaliados foram verificados valores muito reduzidos de expressão quando a glicose foi utilizada como fonte de carbono para o P. echinulatum. Observou-se ainda uma expressão coordenada de genes codificadores de endoglicanases, celobiohidrolase, β-glicosidase e swolenina. / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, CNPq. / The strain S1M29 of Penicillium echinulatum is a filamentous fungus that presents a cellulolytic system with potential for application in the degradation process of lignocellulosic materials to obtain products of biotechnological interest, such as second-generation ethanol. The availability of lignocellulosic biomass associated with the search for alternatives to fossil fuels increases the interest in studies that involve understanding the secretion mechanisms of lignocellulolytic enzymes. In this study, P. echinulatum S1M29 was grown under inducing conditions for the production of endoglucanases, cellobiohydrolases, β-glucosidases, xylanases and swollenins. The enzyme secretion profiles were evaluated in polyacrylamide gels and the pattern of gene expression for these proteins was also assessed. It was observed that enzyme production was enhanced in the presence of cellulose Celufloc E® and sugar cane bagasse (SCB) in the culture medium compared to glucose, with the use of biomass residue providing the best yields. A similar result was obtained analyzing enzyme secretion profiles in polyacrylamide gels, suggesting the presence of constitutive endoglucanases of approximately 80 kDa. Studies with qRT-PCR revealed the presence of four genes encoding endoglucanases with distinct expression patterns, standing out an accumulation of transcripts from egl1 gene 9779.19 times higher than the calibrator sample in 24 h of growth in medium formulated with cellulose Celufloc E®. The same gene generated 1257.58 more accumulated transcripts than the reference sample in medium supplemented with SCB. Evaluation of gene expression for cellobiohydrolase yielded higher expression levels in the medium formulated with SCB in 48 h, in comparison to the medium containing cellulose Celufloc E® in 24 h, corresponding, respectively, to 6464.49 and 3093.26 more accumulated transcripts than the reference sample. The β-glucosidase gene was expressed in medium formulated with SCB at the beginning of growth, as opposed to that seen for activity of this enzyme, which occurred at the end of cultivation. The xylanase expression was more significant with the use of cellulose Celufloc E® in the culture medium. On the other hand, the gene for swollenin presents an expression profile with similar values compared to using cellulose Celufloc E® and SCB in the culture medium, although the presence of SCB has provided a later expression. Very low values of gene expression have been found for all genes evaluated when glucose was used as carbon source for P. echinulatum. A coordinated expression of endoglucanases, cellobiohydrolase, β-glucosidase and swollenin was was also verified.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul, FAPERGS.