Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-06-07T17:40:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lylyan_2014.2.pdf: 1468134 bytes, checksum: 8d21d1e0d24b3b3ae2fff646c4652a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T17:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lylyan_2014.2.pdf: 1468134 bytes, checksum: 8d21d1e0d24b3b3ae2fff646c4652a34 (MD5) Previous issue date: 2014-11-26 / FACEPE / As Calcificações Cerebrais Familiares Primárias (CCFP) constituem uma rara condição genética de herança autossômica dominante e se caracterizam, primordialmente, pela deposição simétrica e bilateral de cálcio nos gânglios da base do cérebro. Em 2012 foi identificada a primeira mutação associada com as CCFP no gene responsável pela codificação do tipo III de um transportador de fosfato inorgânico sódio-dependente (PiT2), o SLC20A2. Ele é reportado como o principal elemento do mecanismo patológico das CCFP, visto que, sua perda funcional está relacionada com o acúmulo de fosfato inorgânico na matriz extracelular. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o padrão de expressão do gene SLC20A2 sob o efeito de mutações encontradas em amostras de pacientes com CCFP. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total que foi isolado do sangue dos pacientes. Em seguida, com o uso da técnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), quantificou-se a expressão do mRNA nas amostras com base no método ΔΔCt. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão do SLC20A2 foi levemente reduzida (~10%) na amostra de um paciente portador de uma mutação nonsense, em comparação ao grupo controle. O eletroferograma do sequenciamento do cDNA indicou uma diminuição no pico do alelo mutante comparativamente ao DNA genômico, indicando que está ocorrendo o decaimento do mRNA mediado pela presença da mutação nonsense. Juntamente com os achados reportados na literatura, os dados desta pesquisa reforçam a necessidade da triagem dos genes relacionados às CCFP bem como das mutações envolvidas com suas bases moleculares. / The Primary Familial Brain Calcifications (PFBC) is a rare genetic disease which present an autosomal dominant inheritance and is characterized by bilateral calcifications affecting basal ganglia. In 2012 it was identified the first mutation in SLC20A2 associated with PFBC. The SLC20A2 gene is responsible for encoding type III carrier of inorganic phosphate (Pi) sodium-dependent (PiT2) and it is reported as the major element of the PFBC pathological mechanism, once their functional loss is associated with the Pi accumulation in extracellular matrix. Therefore, this study aimed to evaluate the SLC20A2 expression under the effect of mutations, in patients with PFBC. The cDNA was synthesized from total RNA isolated from patients peripheral blood. Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) was used to measure mRNA level amongst patients and controls based on the ΔΔCt method. The results showed that the SLC20A2 expression was slightly decreased (~ 10%) in the proband with a missense mutation, compared to control group expression. The results of cDNA sequencing showed reduced expression compared to genomic DNA mutant allele, indicating that the mRNA decay is occurring mediated by the presence of nonsense mutation. Together with the findings already reported in the literature, our data reinforce the need to screening for genes associated to the PFBC and the mutations involved with their molecular bases.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura. Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1. Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon. Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de 55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína durante a infecção. Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional, dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum. O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento. Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro que os isolados apresentam em camundongos B10.A. / Paracoccidioides brasiliensis is the dimorphic fungus responsible for paracoccidioidomycosis in man, who is infected by inhalation of conidia. The cellular differentiation of P. brasiliensis from mycelium (M) to yeast (Y) in the lungs is essential for infection to occur. J-domain (DnaJ) proteins, of the Hsp40 family, are essential cofactors of their cognate Hsp70 chaperones, besides acting as independent chaperones. In the present study, we have cloned and sequenced the heat shock gene PbMDJ1, which encodes an Mdj1 homologue that is a mitocondrial DnaJ in yeasts. The gene sequence consists of an ORF of 1719bp interrupted by three introns and translates 551 amino acid residues. PbMdj1 is organized in modules consisting of a J domain, followed by a glycine/phenylalanine-rich segment and four CXXCXGXG (zinc finger) domains. The C-terminal is not conserved. We expressed a His-tagged N-terminal region of PbMdj1 and used the recombinant protein to immunize rabbits to obtain anti-PbMdj1r serum. Immune-localization was performed using confocal and electron microscopy, and also flow cytometry. We demonstrated the presence of PbMdj1 not only in the mitochondria, where it is apparently sorted, but also in the cell wall of P. brasiliensis. Labeling was abundant throughout the cell wall and especially in the budding regions; however, anti-PbMdj1r did not affect fungal growth in the concentrations tested in vitro, possibly due to the poor access of the antibodies to their target in growing cells. Labeled mitochondria stood preferentially close to the plasma membrane and gold particles were detected in the thin space between them, towards the cell surface. The anti-rPbMdj1 antibodies used in the reactions specifically recognized a single 55 kDa mitochondrial and cell wall (alkaline β-mercaptoethanol extract) component, compatible with the predicted size of the protein devoid of its matrix peptidetargeting signal. This is the first time a DnaJ member has been observed on the cell surface, where its function is speculative. In the present work we show that Mdj1 and the mitochondrial proteinase Lon homologues are heat shock proteins in the P. brasiliensis and that their gene organization is conserved among thermodimorphic fungi and Aspergillus, where the genes are adjacent and have a common 5´region. We mapped and validaded transcription elements in the 5´-shared intergenic (ML) region of MDJ1/LON from P. brasiliensis using both DNAse I protection footprinting and mobility shift assays. Three of them were similar to canonical and nonconventional heat shock elements and one is a putative AP-1 binding domain (ARE), related to oxidative stress. Similar motifs were detected in the correspondent locus of B. dermatitidis and H. capsulatum. Our studies compared P. brasiliensis Pb18 with genetically distinct Pb3, where the ML region is polymorphic outside mapped motifs. In these isolates, different numbers of elements were detected and the pattern of mRNA accumulation of the genes was distinct during phase transition. In Pb18, PbMDJ1 was preferentially expressed in the yeast phase. This is the first study of transcription elements in P. brasiliensis that might help to understand regulation of stress-related genes involved in fungal adaptation to the host. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho mostra o envolvimento de motivos de ligação do tipo NIT2 na modulação da transcrição do gene PbGP43, que codifica um importante antígeno do patógeno humano Paracoccidioides brasiliensis. Esta investigação foi motivada pela descoberta de um elevado número de motivos do tipo GATA (ou TATC) dentro dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 do isolado Pb339, presentemente clonado e sequenciado neste trabalho. Este fragmento de 2047 pb contém 23 sítios NIT2, que formam 4 “clusters” putativos, dois deles idênticos. Nossa análise foi baseada em ensaios de EMSA (“electrophoretic mobility shift assay”) usando sondas selecionadas e ensaios de PCR em tempo real do gene PbGP43 de culturas de P. brasiliensis expostas a, ou depletadas, de sulfato de amônio e glutamina. Os resultados sugerem que pelo menos alguns motivos NIT2 podem ser funcionais e que o PbGP43 é modulado por fontes primárias de nitrogênio. Nós mapeamos 4 oligonucleotídeos contendo motivos TATC que formaram complexos DNA-proteína possivelmente envolvendo um fator NIT2. Esta afirmação é baseada nas seguintes observações: i) eles formaram bandas de maior intensidade nos ensaios de EMSA com extrato de células que cresceram na ausência de sulfato de amônio; ii) uma mutação pontual no núcleo TATC (para GATC) diminuiu a intensidade das bandas formadas e iii) todos os complexos migraram de forma semelhante. Tanto sulfato de amônio quanto glutamina provocaram diminuição no acúmulo de mRNA do PbGP43, sendo que o efeito pôde ser revertido quando o sal foi retirado do meio. Esta modulação foi vista não só em Pb339, mas também nos isolados Pb3 e Pb18. Os oligonucleotídeos usados para iniciar a reação para amplificação dos 2047 pb da região 5´ intergênica do PbGP43 usando DNA do isolado Pb339 também amplificaram um fragmento de tamanho similar usando DNA do Pb18 e de seis outros isolados. Para os isolados Pb2, Pb3, Pb4 e Pb5 os amplicons foram de ~1500 pb e para Pb9 e Pb17 foi de ~3000 pb. No Pb18, esta sequência é 98% idêntica à de Pb339. No Pb3, além do amplicom de menor tamanho, o número de motivos NIT2 e “clusters” é menor. Ensaios de gene repórter conduzidos em A. nidulans mostraram que os primeiros 480 pb da região 5´ intergênica não só foram responsáveis pela transcrição do gene, mas também continham os elementos necessários para a regulação negativa na presença de sulfato de amônio como fonte de nitrogênio. Além de terem sido testadas fontes de nitrogênio na modulação do PbGP43, o efeito da adição de glicose e soro fetal bovino também foi analisado. Nas condições testadas, o aumento de glicose de 0,18 para 1,5% levou a uma queda no acúmulo de mRNA do gene, no entanto, o contrário foi visto quando a concentração do açúcar subiu de 1,5 para 3%. Para o soro fetal bovino, não houve alteração significativa. Por fim, o mapeamento de elementos de transcrição da região proximal ao ATG (-1 a –326 pb) pelas técnicas de DNAse I footprinting e EMSA levaram à identificação de três regiões de proteção localizadas entre os nucleotídeos –216 e –260 da região promotora proximal. Este é o primeiro relato de modulação por fontes de nitrogênio primárias do gene PbGP43. / The present work shows the involvement of NIT2-like binding motifs in transcription modulation of the PbGP43 gene, which encodes an important antigen from the human pathogen Paracoccidioides brasiliensis. This investigation was motivated by the finding of a high number of GATA (or TATC)-like motifs within the first 2,047 nucleotides of the PbGP43 5’ intergenic region from Pb339 isolate, which has been presently cloned and sequenced. This fragment contains 23 NIT2- like sites, which form 4 putative clusters, two of them identical. Our analysis was based on electrophoretic mobility shift assay (EMSA) with selected probes and real time reverse transcription (RT)-PCR of PbGP43 from P. brasiliensis cultures exposed to, or depleted of, ammonium sulfate and glutamine. The results suggested that at least some NIT2-like motifs may be functional and that PbGP43 is modulated by nitrogen primary sources. We have mapped 4 oligonucleotides containing TATC motifs that formed DNA-protein complexes possibly involving a NIT2-like factor. This suggestion is based on the following observations: i) they formed more intense EMSA bands with extracts from ammonium sulfate-depleted cells; ii) a point mutation in the TATC core (to GATC) decreased shifted band intensity; iii) all the complexes migrated similarly. Both ammonium sulfate and glutamine provoked rapid decrease in PbGP43 mRNA accumulation, but this effect could be reversed upon salt depletion. This kind of modulation was observed not only in Pb339, but also in Pb3 and Pb18. The oligonucleotides that prime amplification of a 2,047-bp PbGP43 intergenic fragment using Pb339 DNA elongated a fragment of similar size with template from Pb18 and six other isolates, while for Pb2, Pb3, Pb4 and Pb5 the amplicon was ~1,500 bp and for Pb9 and Pb17 it was ~3,000 bp. The Pb18 genome sequence of this amplicon is 98% identical to that of Pb339. In Pb3, the number of NIT2-like motifs and clusters is lower. Gene reporter assays conducted in Aspergillus nidulans WG355 showed that the first -480 bp of the PbGP43 5´intergenic region are responsible for promoter activation and contains the minimal elements responsable for down regulation of gene when tested in minimal medium containing sodium nitrate as the only nitrogen source. Besides nitrogen sources, alterations in the concentration of glucose and addition of fetal serum bovine (FSB) in the medium were tested. In our conditions, when glucose concentration increased from 0,18 to 1,5%, mRNA accumulation decreased. The opposite was seen when concentration raised from 1,5 to 3%. FSB, on the other hand, did not alter PbGP43 expression. When the proximal promoter region was mapped by DNAse I footprinting and EMSA, we identified three protected regions localized between – 216 and –260 bp far from the initial codon (ATG). This is the first report on PbGP43 transcription modulation with primary nitrogen sources. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. / Made available in DSpace on 2017-06-27T04:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 346415.pdf: 1490832 bytes, checksum: 7cfa2ebb03527d549295fed4e02c78de (MD5) Previous issue date: 2017 / Exossoma de RNA é um complexo multiproteico composto por 12 subunidades, que possui atividade catalítica no sentido 3 ? 5 e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs. As subunidades RRP6 (Ribossomal RNA Processing 6) e RRP44 (Ribossomal RNA Processing 44) são responsáveis pela atividade catalítica e as demais subunidades envolvidas no direcionamento e seleção de transcritos para processamento ou degradação. O Trypanosoma rangeli, juntamente com outros tripanosomatídeos, apresentam deficiência no sistema de regulação de fatores de transcrição, portanto o mecanismo de regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre predominantemente a níveis pós-transcricionais através da regulação dos níveis de RNA, sendo esses níveis regulados a partir da degradação dos transcritos. No presente estudo realizamos a caracterização de três subunidades do complexo exossoma de T. rangeli. A subunidade RRP6 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 2.133 pares de base que codifica para um polipeptídio de 710 aminoácidos (± 78,7 kDa). Foram identificados os domínios conservados PMC2NT, DEDD-Y e HRDC, que também se encontram presentes em outros organismos em que o complexo exossoma de RNA está caracterizado. Foi realizado teste de expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém sem sucesso de isolamento. A subunidade RRP44 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 3012 pares de base que codifica para um polipeptídio de 1003 aminoácidos (± 113,2 kDa). Os domínios conservados presentes nesta proteína são PIN, Exoribonuclease R e RNB. Foi realizada a expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém não tivemos sucesso do rendimento da proteína para o posterior etapa de purificação. A subunidade EAP3 (Exosome Associated Protein 3) possui uma janela aberta de leitura de 547 pares de base que codifica para um polipeptídio de 181 aminoácidos (± 20 kDa) e está descrita como uma proteína associada ao exossoma de RNA formando um heterodímero com a subunidade RRP6. Em ensaios de Western blot utilizando o antissoro produzido essa interação in vivo foi comprovada, uma vez que a ligação do anticorpo ocorreu na banda de ±150 kDa. As sequências do complexo exossoma de RNA apresentam porcentagens de identidade altas, demonstrando ser uma maquinaria conservada entre os tripanosomatídeos, porém com sua funcionalidade ainda desconhecida.<br> / Abstract : RNA exosome complex is a multiprotein complex composed of 12 subunits, which has 3 '? 5' catalytic activity and is involved in the processing and degradation of several types of RNAs. The subunits RRP6 (Ribosomal RNA Processing 6) and RRP44 (Ribosomal RNA Processing 44) are responsible for the catalytic activity, and the other subunits are involved in the targeting and selection of transcripts for processing or degradation. Trypanosoma rangeli, together with other trypanosomatids, are deficient in the regulation system of transcription factors, so the regulation mechanism of gene expression in these organisms occurs exclusively at post-transcriptional levels through of RNA levels regulation, these levels being regulated from the degradation of the transcripts. In the present study we performed the characterization of subunits of the T. rangeli exosome complex. The RRP6 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 2,133 base pairs coding for a polypeptide of 710 amino acids (± 78.7 kDa). The conserved domains identified was PMC2NT, DEDD-Y and HRDC, which are also present in other organisms in which the RNA exosome complex is characterized, have been identified. A heterologous expression test of this protein was performed in E. coli BL21 CodonPlus, but with no success of isolation. The RRP44 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 3012 base pairs encoding a polypeptide of 1003 amino acids (± 113.2 kDa). The conserved domains present in this protein are PIN, Exoribonuclease R and RNB. The heterologous expression of this protein was performed in E. coli BL21 Codon Plus, but we did not have a success of protein yield for the subsequent protein purification process. The EAP3 (Exosome Associated Protein 3) subunit has an open reading frame of 547 base pairs encoding a polypeptide of 181 amino acid (± 20 kDa) and is described as a protein associated with the RNA exosome forming a heterodimer with the subunit RRP6. In Western Blotting assays using the antiserum produced from purified protein this in vivo interaction was proven, since antibody binding occurred in the ~ 150 kDa band, which corresponds to the sum of the proteins. The sequences of the RNA exosome complex have high identity percentages, demonstrating that it is a conserved machinery among the trypanosomatids, but with its still unknown functionality.

Submitted by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-04-24T17:32:02Z No. of bitstreams: 1 TESE Larissa Melo do Nascimento.pdf: 4960362 bytes, checksum: 493832b0899c2f0c2bbe63199de0769e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-24T17:32:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE Larissa Melo do Nascimento.pdf: 4960362 bytes, checksum: 493832b0899c2f0c2bbe63199de0769e (MD5) Previous issue date: 2016-09-06 / CAPES / As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania da família Trypanosomatidae. Tais enfermidades atingem populações pobres de países subdesenvolvidos e sua incidência está associada, em parte, à ausência de quimioterápicos efetivos, o que enfatiza a importância de estudos focados na biologia desses patógenos. Nos tripanossomatídeos o controle da expressão gênica ocorre, predominantemente, a nível pós-transcricional, envolvendo a regulação da síntese proteica através dos fatores de iniciação da tradução eucarióticos (eIFs). Em mamíferos, a regulação global da tradução ocorre majoritariamente através do complexo heterotrimérico eIF2 (constituído de eIF2α, eIF2β e eIF2γ), o qual é responsável pela interação com o tRNA iniciador, GTP e a subunidade ribossomal 40S. No presente trabalho, objetivou-se contribuir na caracterização do complexo eIF2 em L infantum. Inicialmente, confirmou-se a expressão constitutiva da subunidade eIF2α durante o crescimento e diferenciação do parasito, bem como, sua associação funcional com a subunidade menor ribossomal. Mais ainda, demonstrou-se sua associação com as subunidades eIF2β e eIF2γ e com os parceiros diretos eIF2B e eIF5, nesse momento confirmando a identificação do complexo eIF2B em Leishmania. Nos tripanossomatídeos, a subunidade eIF2α apresenta uma extensão N-terminal característica, a qual se mostrou importante nas interações com eIF2B, eIF5 e ribonucleoproteínas. Interessantemente, identificou-se um novo parálogo da subunidade eIF2γ, sendo denominado aqui eIF2γ-2. Evolutivamente, o eIF2γ-2 surgiu após provável evento de duplicação exclusivo na família Trypanosomatidae e derivou acumulando características singulares em sua sequência gênica. O eIF2γ-2 é capaz de interagir com eIF2α, eIF2β, na formação de um segundo complexo eIF2 exclusivo de tripanossomatídeos, assim como, com o eIF2B e eIF5. Através de ensaios de deleção e complementação gênica, confirmou-se a essencialidade de eIF2γ e se demonstrou a incapacidade de substituição deste pelo seu parálogo eIF2γ-2. Estes resultados demonstram novos aspectos inéditos na identificação e função do eIF2 dos tripanossomatídeos, não observados em outros organismos. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by protozoa from the genus Leishmania of the Trypanosomatidae family. These diseases affect poor people in developing countries and its incidence is associated, in part, to the absence of effective chemotherapy, which emphasizes the importance of studies focused on the biology of these pathogens. In trypanosomatids the control of gene expression occurs predominantly at post-transcriptional level involving the regulation of protein synthesis through the eukaryotic initiation factors (eIFs). In mammals, the global translation regulation is mostly controlled by the heterotrimeric complex eIF2 (formed by eIF2α, eIF2β and eIF2γ), which is responsible for the interaction with the initiator tRNA, GTP and 40S ribosomal subunit. In the present study, by characterizing the eIF2 complex in L infantum, we confirmed the constitutive expression of the eIF2α subunit during the growth and differentiation of the parasite, as well as, their functional association with the minor ribosomal subunit. Furthermore, while demonstrating the association of eIF2α with eIF2β and eIF2γ subunits and with the direct partners eIF2B and eIF5, we confirmed the identification of Leishmania eIF2B complex. Herein, we also showed that eIF2α subunit in trypanosomatids has a unique N-terminal extension that is important for interaction with eIF2B, eIF5 and ribonucleoproteins. Interestingly, a paralog of eIF2γ subunit, named here eIF2γ-2, was identified for the first time. Evolutionarily, the eIF2γ-2 gene arose most likely after a duplication event in the Trypanosomatidae family and further accumulated singular characteristics in its coding sequence. The eIF2γ-2 is able to interact with eIF2α and eIF2β, acting during the formation of a second eIF2 complex exclusive to trypanosomatids, as well as with eIF2B and eIF5. By gene deletion and complementation assays, we confirmed the essentiality of eIF2γ and demonstrated the inability to replace it by eIF2γ-2. Altogether, our data demonstrate novel features of eIF2 function of trypanosomes, not seen in other organisms.

Entre as modificações sofridas pelo transcrito primário de RNA de eucariontes, o splicing é responsável pela colocação lado a lado das sequências expressas alinhando a região codificadora no RNAm. Este mecanismo, descrito na década de 1970, como o responsável pela remoção dos íntrons e junção dos éxons consecutivos, é efetuado por um complexo ribonucleoprotéico conhecido como spliceossomo. O reconhecimento por este complexo dos segmentos definidos como éxons e íntrons depende de diversas sequências presentes no RNA e reconhecidas por ligantes protéicos. A modulação desta interação resulta na geração de diferentes transcritos maduros a partir de um mesmo gene, evento conhecido como splicing alternativo, comum a maioria dos genes humanos e um dos grandes responsáveis pela geração de variabilidade proteômica dos eucariotos e sua complexidade morfo-fisiológica. O splicing alternativo é um importante gerador de diversidade funcional no sistema nervoso central, onde participa da geração de variantes para mais de 80% dos genes. Entre estes está o gene do Retardo Mental do X Frágil (FMR1), cujo transcrito primário pode sofrer splicing alternativo de quatro éxons, produzindo até vinte isoformas diferentes da FMRP. Os objetivos gerais deste projeto foram (i) a análise da expressão do éxon 12 do Fmr1 em córtex cerebral frontal, hipocampo e cerebelo de ratos em E19 e P2; e (ii) a busca por elementos em cis reguladores do splicing do éxon 12 do Fmr1 de rato. Para averiguar os níveis da expressão do éxon 12 do Fmr1, no final do período embrionário e início do pós-natal de rato, foi realizada RT-PCR em tempo real com os tecidos citados acima, em E19 e P2. Observamos significativa inclusão do éxon 12 nos transcritos do Fmr1 no córtex frontal em P2 quando comparado a E19, o que não se relacionou ao aumento geral da expressão do Fmr1. No hipocampo, houve aumento da expressão do conjunto de mensagens do Fmr1 e tendência à exclusão do éxon 12 em P2, quando comparado a E19. Estes dados revelam o córtex cerebral como fonte de proteínas ativadoras do splicing do éxon 12 do Fmr1 e onde se deve buscar pela relevância funcional das isoformas da FMRP expressando este éxon. A busca por elementos reguladores do splicing do éxon 12 se baseiou na avaliação da expressão por RT-PCR de mini-gene de segmento genômico do gene Fmr1 usado para transfectar células C6 (glioma de rato). Estas células demonstraram inclusão preferencial do éxon 12 em seus transcritos superexpressos. Um segundo clone foi gerado com uma deleção a partir do clone original, na região 5 do íntron 12, na qual observamos in silico, elementos ricos em U e C, candidatos a acentuadores da inclusão do éxon 12. A superexpressão deste clone em C6 revelou exclusão preferencial do éxon 12, um padrão invertido em relação ao anteriormente observado. Estes dados indicam o elemento rico em U e C como um forte candidato a acentuar a inclusão do éxon 12 no RNAm do Fmr1. / Splicing is an important hnRNA processing mechanism in eukaryotes, aligning exons in the mRNA. First described in the 1970s, it is performed by a molecular complex named spliceosome, which recognizes RNA sequences in the boundaries between exons and introns. Interaction modulation in the spliceosome results in mature transcripts with varying sizes, a process known as alternative splicing, common to most human genes and the major mechanism leading to proteomic diversity and morphological and functional complexity in eukaryotes. Alternative splicing is very important in generating functional diversity in the central nervous system (CNS), where it takes part in more than 80% of primary transcript processing. Among these is the Fragile Mental Retardation 1 gene (FMR1), which undergoes alternative splicing of four exons creating the possibility of 20 non-redundant FMRP isoforms. The aims of this project were (i) to analyze the expression of rat Fmr1 exon 12 in frontal cerebral cortex, hippocampus, and cerebellum at E19 and P2 days; and (ii) to search for cis-acting elements regulating exon 12 splicing. We performed real-time RT-PCR to examine Fmr1 exon 12 expression, in the above-mentioned CNS structures, between the end of embryonic period and the second postnatal day. We observed significant inclusion of exon 12 in Fmr1 mRNA in frontal cortex at P2 as compared to E19, which was unrelated to general Fmr1 expression increase. At P2 hippocampus there was a significant increase at the expression levels of Fmr1, and a trend to exclude exon 12 from the primary transcript. This data indicates that cerebral cortex is an important source of proteins activating exon 12 splicing, and also a tissue where the functional relevance of FMRP isoforms expressing exon 12 should be regarded. We adopted the mini-gene approach to search for cis elements regulating Fmr1 exon 12 splicing. RTPCR was performed to evaluate C6 (rat glioma) cells overexpressing a clone containing a genomic Fmr1 segment. Transfected cells revealed preferential inclusion of Fmr1 exon 12. A deletion construct lacking the initial bases of intron 12 was generated. The deleted segment harbor U- and C-rich sequences that had been identified in silico in a search for intronic splicing enhancers. Overexpression of the deletion construct in C6 yielded to preferential exclusion of exon 12, as opposed to the expression pattern previously observed in the original clone. Therefore, the U- and C-rich elements at Fmr1 intron 12 are strong candidates to enhance Fmr1 exon 12 splicing.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2013-01-24T16:40:43Z No. of bitstreams: 1 lysangela_r_alves_ioc_bcm_0005_2010.pdf: 12423469 bytes, checksum: 674a41c28ac9c8cf38b2ee15fb9b891b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-24T16:40:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lysangela_r_alves_ioc_bcm_0005_2010.pdf: 12423469 bytes, checksum: 674a41c28ac9c8cf38b2ee15fb9b891b (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Em tripanossomatídeos a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. Acredita-se que a estabilidade do mRNA e o acesso aos polissomos sejam fortemente regulados, permitindo ao Trypanosoma cruzi uma rápida adaptação à diferentes condições ambientais as quais está exposto durante seu ciclo de vida. A regulação pós-transcricional requer uma associação entre mRNAs e determinadas proteínas formando complexos ribonucleoprotéicos (mRNPs). Nosso objetivo foi investigar a dinâmica de associação entre os mRNAs e proteínas, isolando e caracterizando proteínas e complexos protéicos ligados a mRNAs poliA+ das frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas em fase exponencial de crescimento e epimastigotas sujeitos a estresse nutricional. As amostras obtidas foram analisadas por espectrometria de massas (LC-MS/MS) e posteriormente comparadas. Nós identificamos 542 proteínas e dentre essas 24 estavam presentes em todas as frações analisadas, enquanto que outras eram exclusivas de uma fração específica: epimastigota frações polissomal (0,37%) e pós-polissomal (2,95%); estresse frações polissomal (13,8%) e pós-polissomal (40,78%). Proteínas sabidamente envolvidas com metabolismo de mRNA foram identificadas, sendo que esse resultado é importante para confirmar a confiabilidade da nossa técnica de isolamento das mRNPs. Essa abordagem em larga escala possibilitou uma análise mais completa da composição dos mRNPs e a dinâmica durante o estresse nutricional em T. cruzi. A partir dos dados obtidos nós selecionamos 6 proteínas para caracterização: fator de elongação 1-alfa (EF1-), proteína de ligação a RNA com domínio dedo de zinco (ZF-211.70), proteína de ligação a RNA com domínio cold shock (CD-33.60), prostaglandina F 2 alfa sintase (PF2 S), prostaglandina F sintase (PFS) e uma proteína hipotética com domínio de fator de replicação A (Hip -11.150). Os anticorpos contra as proteínas EF1-, ZF-211.70, PF2S e PFS apresentaram reatividade específica com uma proteína única de tamanho esperado, já as proteínas CD-33.60 e Hip-11.150 apresentaram um reatividade baixa ou inexistente em extratos de epimastigotas e por isso não foram utilizadas para os ensaios posteriores. Ensaios de imunofluorescência, sedimentação de polissomos em gradiente de sacarose e expressão ao longo do ciclo de vida nos permitiu uma caracterização inicial das proteínas selecionadas, etapas importantes para aprofundarmos o estudo na regulação de expressão gênica em T. cruzi. / Gene regulation is mainly posttranscriptional in trypanosomatids. The stability of mRNA and access to polysomes are thought to be tightly regulated, allowing Trypanosoma cruzi to adapt to the different environmental conditions during its life cycle. Posttranscriptional regulation requires the association between mRNAs and some proteins to form mRNP complexes. We investigated the dynamic association between proteins and mRNAs, using poli(T) beads to isolate and characterize proteins and protein complexes bound to poli -A+ mRNAs. The protein content of these fractions was analyzed by mass spectrometry (LC -MS/MS). We identified 542 protein component of the mRNP complexes associated with mRNAs. Twenty-four of the proteins obtained were present in all fractions, whereas some other proteins were exclusive to a particular fraction: epimastigote polysomal (0.37%) and postpolysomal (2.95%) fractions; stress polysomal (13.8%) and postpolysomal (40.78% ) fractions. Several proteins known to be involved in mRNA metabolism were identified, and this was considered important as it made it possible to confirm the reliability of our mRNP isolation approach. This procedure allowed us to have a first insight into the composition and dynamics of mRNPs in T. cruzi. From the results obtained we selected six proteins for characterization: elongation factor 1-alpha (EF1-), zinc finger RNA binding protein (ZF-211.70), RNA binding protein with a cold-shock domain (CD-33.60), prostaglandin F 2 alfa synthase (PF2S), prostaglandin F synthase (PFS) and a hypothetical protein with a replication factor domain (Hip-11.150). The antibodies produced against EF1-, ZF-211.70, PF2S and PFS recognized a specific protein of expected size in epimastigote protein extracts; however, the CD-33.60 and Hip-11.150 antibodies did not recognized a specific protein and they were not used for further experiments. Immunofluorescence assays, polysome profile in sucrose density gradient and the expression pattern through the parasite life cyle with the selected proteins allowed us a preliminary characterization and further studies will help to elucidate the posttranscriptional regulation and the formation of RNA regulons in T. cruzi.

Submitted by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-26T11:59:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Sharon Martins_versão biblioteca.pdf: 5639087 bytes, checksum: d97ea2343abfd37c4cdfe4960a4df639 (MD5) / Approved for entry into archive by Karin Goebel (karing@fiocruz.br) on 2014-11-26T11:59:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_Sharon Martins_versão biblioteca.pdf: 5639087 bytes, checksum: d97ea2343abfd37c4cdfe4960a4df639 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-26T11:59:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_Sharon Martins_versão biblioteca.pdf: 5639087 bytes, checksum: d97ea2343abfd37c4cdfe4960a4df639 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil / Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, é um organismoamplamente estudado devido a sua importância médica e também por possuircaracterísticas peculiares que o tornam um bom modelo de estudo para questõesbiológicas básicas. A repressão de RNAs mensageiros em grânulos citoplasmáticoscompostos de complexos mRNA-proteína (mRNPs) é uma importante via de regulaçãopós transcricional em eucariotos e, recentemente, foi demonstrado que grânulos deRNA estão presentes em T. cruzi. Alguns ortólogos de proteínas humanas envolvidasem mecanismos de regulação foram encontrados nestas estruturas e caracterizados,mas a função e composição de grânulos de mRNA neste modelo experimentalpermanecem desconhecidas. Em humanos e outros eucariotos, condições de estressecomo calor, radiação UV, presença de agentes citotóxicos ou deficiência de glucosepodem induzir a formação de grânulos de estresse, um tipo de estrutura citoplasmáticaenvolvida em repressão, separação e armazenamento de mRNA durante condiçõesadversas. Foram encontradas, em banco de dados de T. cruzi, três sequências deproteínas que possuem certa similaridade estrutural com as proteínas humanas TIA1 eTIAR. Os genes correspondentes foram clonados utilizando-se a tecnologia Gateway®,para a obtenção de proteínas recombinantes. As proteínas purificadas foram utilizadaspara produzir anticorpos policlonais em camundongos, os quais puderam elucidar alocalização celular e padrões de expressão destas proteínas durante o ciclo de vida doparasita. A caracterização destas proteínas pode ajudar a elucidar melhor osmecanismos de regulação pós transcricional em T. cruzi. / Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, is an organism widely studied due to its medical importance and particular features that make it an alternative model for basic biological studies. Repression of messenger RNAs in cytoplasmic granules composed of mRNA-protein (mRNP) complexes is an important pathway of posttranscriptional regulation in eukaryotes, and recently was shown that mRNA granules are present in T. cruzi. A few orthologs of human proteins involved in mRNA metabolism were found and characterized on these structures, but the function and composition of mRNA granules in this organism remain unknown. In humans and other eukaryotes, stress conditions such as heat, UV radiation, presence of cytotoxic agents or glucose starvation can induce the formation of stress granules, cytoplasmic structures involved in mRNA repression, sorting and storage during adverse conditions. Three protein sequences that have a certain structural similarity with the human TIA1/TIAR proteins were found in the T. cruzi data bank. The genes encoding these three proteins were cloned using the Gateway® technology and the recombinant proteins were obtained. The purified proteins were used to produce polyclonal antibodies in mice and the cellular localization and expression patterns of these proteins during the parasite’s life cycle were performed. The characterization of these proteins can help to elucidate the mechanisms of posttranscriptional regulation in T. cruzi.

GARANTIZADO, F. E. A. Caracterização da família multigênica da proteína desacopladora de plantas (pUCP) e regulação da expressão gênica sob diferentes condições de estresses abióticos em Vigna unguiculata (L.) Walp. 2012. 152 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-22T20:36:03Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_feagarantizado.pdf: 1868479 bytes, checksum: bd2f77d349cdf7e3f758d725ec4fc1fa (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-12T15:58:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_feagarantizado.pdf: 1868479 bytes, checksum: bd2f77d349cdf7e3f758d725ec4fc1fa (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-12T15:58:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_feagarantizado.pdf: 1868479 bytes, checksum: bd2f77d349cdf7e3f758d725ec4fc1fa (MD5) Previous issue date: 2012 / The plant uncoupling proteins (pUCP) are located in the inner mitochondrial membrane and facilitate the proton translocation across the intermembrane space into the mitochondrial matrix, deflecting the passage of H + by F1-ATPase activity, thus affecting the efficiency of oxidative phosphorylation, i.e decreasing the synthesis of ATP coupled to the operation of the electron transport chain. Therefore, these proteins are responsible for dissipating the electrochemical gradient of H+, generated by respiration, releasing heat to the environment. These proteins belong to family of carriers Mitochondrial Anion (FCAM) and are encoded by multigene families. Their function is not yet fully elucidated, but the literature suggests involvement in adapting to biotic and abiotic stresses and cell protection by avoiding the production of reactive oxygen species (ROS). Their participation in adaptive thermogenesis is unclear. The aim of this work was to characterize the multigene family of pUCP in Vigna unguiculata (L.) Walp and your regulation through gene expression in response to different abiotic stresses. Vigna unguiculata seeds were germinated on paper imbibed water in the dark. Three days after germination the seedlings were transferred to Hoagland solution for 3 days before application of stress. Roots and leaves were collected at 0, 6, 12 and 24 hours after addition of the respective 100 mM NaCl, 200.67 g / L PEG, 10 mM H2O2 and 5 mM salicylic acid to characterize the profile of multigene family expression of genes for pUCP by semiquantitative RT-PCR and real-time PCR (qPCR). Specific primers were designed based on the sequences of cDNA / gene identified in pUCPs Vigna unguiculata using the PerlPrimer tool. Amplification of cDNA of actin was used to normalize the data for RT-PCR semi-quantitative and three constitutive genes were used to normalize the data of qPCR: 2 to actin gene (actin 4 and 5) and a gene for factor alogament 1-α (EF1α). In silico analysis revealed that in Fabales order pUCP is encoded by at least six pUCPs genes presenting a duplication of the gene type 1 (1a, 1b) and a pUCP6 gene deletion. The multigene family of pUCP, consisting of six genes was then identified in Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 and VuUCP5). The alignment of amino acid and nucleotide sequences of the species of Fabales order including Vigna unguiculata, revealed three xv. conserved sequences called signal Energy Transfer Protein (SPTE), and four domains (or regions or sites) existence of specific true pUCPs in Vigna unguiculata. VuUCP1a gene was constitutively expressed in leaves and roots, contrasting with VuUCP1b, whose expression was modulated in a stress and tissue-dependent manner. The VuUCP1b expression increased in response to all treatments (PEG, NaCl, H2O2 and salicylic acid) in roots, whereas the expression in leaves did not increase in response to NaCl. VuUCP2 expression was inhibited in response to PEG in leaves. VuUCP4 showed constitutive expression in response to stresses in both tissues, while VuUCP3 and VuUCP5 showed induction of expression by various stresses depending on the tissue type. The identification of the multigene family of pUCPs in Vigna unguiculata and its gene expression profile in different tissues and stress conditions highlights a possible role of this protein in the adjustment of plants to environmental stresses. / As proteínas desacopladoras de planta (pUCP) estão localizadas na membrana mitocondrial interna e facilitam o transporte de prótons do espaço intermembranar para a matriz mitocondrial, desviando a passagem de H+ através da F1-ATPase, afetando assim a eficiência da fosforilação oxidativa, isto é, diminuindo a síntese de ATP acoplada ao funcionamento da cadeia transportadora de elétrons. Portanto, essas proteínas são responsáveis pela dissipação do gradiente eletroquímico de H+, gerado pela respiração, liberando calor para o ambiente. Tais proteínas pertencem a Família de Carreadores de Ânions Mitocondriais (FCAM) e são codificadas por famílias multigênicas. Sua função ainda não está completamente elucidada, mas a literatura sugere participação na adaptação a situações de estresses bióticos e abióticos e na proteção da célula evitando a produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Sua participação na termogênese adaptativa é questionável. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a família multigênica da pUCP em Vigna unguiculata (L.) Walp bem como sua regulação através da expressão gênica em resposta a diferentes estresses abióticos. Sementes de Vigna unguiculata foram germinadas em papel umedecido com água, no escuro e após 3 dias as plântulas foram transferidas para solução de Hoagland durante 3 dias antes da aplicação dos estresses. As raizes e as folhas foram coletadas com 0, 6, 12 e 24 horas, após respectivas adições de NaCl 100 mM, PEG 200,67 g/L, H2O2 10 mM e ácido salicílico 5 mM, para caracterizar a família multigênica e o perfil de expressão dos genes da pUCP por RT- PCR semiquantitativa e por PCR em tempo real (qPCR). Primers específicos foram desenhados com base nas sequências de cDNAs/genes de pUCPs identificadas em Vigna unguiculata usando a ferramenta PerlPrimer. A amplificação do cDNA da actina foi usada para a normalização dos dados de RT-PCR semi-quantitativa e três genes constitutivos foram usados na normalização dos dados da qPCR: 2 genes para actina (actinas 4 e 5) e 1 gene para o fator de alogamento 1-α (EF1α). Análise in silico revelou que a pUCP na ordem Fabales é codificada por pelo menos seis genes com duplicação do gene pUCP do tipo 1 (1a e 1b) e deleção do gene pUCP6. A família multigênica da pUCP, constituída de 6 genes, então foi identificada em Vigna unguiculata (VuUCP1a, VuUCP1b, VuUCP2, VuUCP3, VuUCP4 e VuUCP5 ). O alinhamento de sequências nucleotídicas e de aminoácidos das xiii. espécies da ordem Fabales incluindo as de Vigna unguiculata, revelou 3 sequências conservadas denominadas Sinal Protéico de Transferência de Energia (SPTE), além de 4 domínios específicos que caracterizam existência de pUCPs verdadeiras em Vigna unguiculata. O gene VuUCP1a foi expresso constitutivamente em folhas e raízes, contrastando com VuUCP1b, cuja expressão foi modulada em função dos estresses e de tecidos. Em raízes a expressão do VuUCP1b aumentou em resposta a todos os tratamentos (PEG, NaCl, H2O2 e ácido salicílico) enquanto que em folhas a expressão não aumentou em reposta ao NaCl. VuUCP2 teve a expressão inibida em resposta ao PEG em folhas. VuUCP4 apresentou expressão constitutiva em resposta aos estresses em ambos os tecidos, enquanto que VuUCP3 e VuUCP5 apresentaram indução de expressão por vários estresses dependente do tecido. A identificação da família multigênica das pUCPs em Vigna unguiculata e seu perfil de expressão gênica diferencial, em função do estresse aplicado e do tecido estudado, põe em evidência um possível papel dessa proteína nos mecanismos de ajustamento das plantas aos estresses ambientais.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Automação e Sistemas, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:55:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 340506.pdf: 7060014 bytes, checksum: 5def456b81bf4cf51a73e82062478cdd (MD5) Previous issue date: 2015 / Nesta dissertação, propomos um estudo comparativo da dinâmica e da robustez entre redes de regulação gênica capazes de gerar e manter oscilações com o período próximo de 24 horas - razão pela qual são chamadas de ciclos circadianos.O objetivo é investigar quais mecanismos biológicos estão associados a comportamentos oscilatórios mais robustos e que outras dinâmicas tais redes exibem quando sofrem alterações em seus parâmetros.Existentes na maior parte dos organismos - desde arquebactérias até nós, seres humanos - os ciclos circadianos têm a função de um relógio interno à célula, que os utiliza para antever as mudanças em seu ambiente externo decorrentes dos ciclos de noite e dia e controlar seu comportamento de acordo. Apesar de poder ser reprogramado por meio de informações provenientes do meio externo - como a luz, por exemplo - esse relógio opera de forma autônoma, graças a duas características essenciais: um laço de realimentação negativa em seu controle e um atraso nele embutido. Selecionamos redes estruturalmente diferentes que apresentam ambas essas particularidades e construímos seus modelos de simulação estocástica. De forma concomitante, definimos um modelo booleano para representar com um nível maior de abstração o comportamento esperado, i.e., os ciclos circadianos.Por meio de análise numérica dos modelos estocásticos, buscamos configurações paramétricas para as quais seu comportamento é próximo daquele esperado. Para os casos em que fomos bem sucedidos nesse processo de busca, guiado pelos métodos aqui propostos, utilizamos os valores encontrados como referência e, em torno deles, variamos cada parâmetro individualmente. As variações para as quais os modelos apresentaram dinâmicas não oscilatórias - dinâmicas estas que também podem ser capturadas por modelos booleanos - fornecem um indício de como interferir no funcionamento normal dos relógios circadianos.Por fim, da análise como um todo, observamos que os modelos das redes constituídas por um par de genes ativador-repressor apresentam um comportamento mais próximo de um relógio circadiano e que suas oscilações são mais robustas às variações impostas, se comparadas àquelas formadas por um único gene que se autorreprime; ademais, a presença de um laço de realimentação que requer a formação de complexos entre as proteínas reguladas também contribui neste sentido.<br> / Abstract: In this thesis, we propose a comparative study of the dynamics and robustness among gene regulatory networks that are capable of generating and maintaining oscillations with a period close to 24 hours - hence them being called circadian cycles.The objective is to investigate which biological mechanisms are associated with more robust oscillatory behaviors, and which other dynamics such networks exhibit in face of parametric variations. Present in most organisms - from archaebacteria to us, human beings - circadian cycles have the role of a clock within the cell, which uses them to anticipate changes in its external environment due to day and night cycles and to control its behavior accordingly. Although it can be reprogrammed by means of information coming from the environment - as light, for instance -this clock operates autonomously, driven by two main characteristics: a negative feedback loop in its control, and a delay incorporated to it. We select networks that possess both of these characteristics but are structurally different, and build their stochastic simulation models. Concomitantly, we define a boolean model to represent in a higher abstraction level the expected behavior, i.e., the circadian cycles. Through a numerical analysis of the stochastic models, we seek parametric configurations for which their behavior is close to the expected one. For those cases in which we are successful in this search - guided by the methods proposed here - we utilize the obtained values as references and, in their vicinity, vary each parameter individually. The variations for which the models present non-oscillatory dynamics - also suitable to be represented by boolean models - indicate how to interfere in the normal operation of circadian clocks.Finally, from the overall analysis, we observe that the models of networks comprised of a pair of activating-repressing genes present a behavior closer to a circadian clock, and that their oscillations are more robust to the imposed variations, when compared to those formed by a single self-repressing gene; furthermore, the presence of a feedback loop that requires the formation of complexes among the regulated proteins also contributes in that direction.