Evidências sugerem que o transtorno bipolar esteja associado a uma toxicidade sistêmica, representada por alterações periféricas em marcadores de inflamação, estresse oxidativo e neurotrofinas, a qual parece estar associada aos episódios de humor e à progressão da doença levando a prejuízos sistêmicos e na neuroplasticidade. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo revisar estas alterações e explorar possíveis mecanismos responsáveis por estes achados, com enfoque em uma desregulação transcricional no transtorno bipolar. No primeiro capítulo, revisamos os biomarcadores periféricos associados aos episódios de humor, a relação destes com a toxicidade sistêmica e os possíveis mecanismos subjacentes a esta toxicidade. Seguimos ilustrando, no capítulo 2, um exemplo de alterações estruturais cerebrais em um paciente bipolar com experiência de múltiplos episódios, como um possível exemplo da neuroprogressão no transtorno bipolar. Em seguida, buscamos por vias de regulação transcricional disfuncionais no córtex pré-frontal de pacientes que poderiam estar associadas a essas alterações e neuroplasticidade prejudicada. A partir de abordagem inovadora de bioinformática, no capítulo 3, identificamos algumas unidades regulatórias (regulons) associadas com as duas assinaturas gênicas do transtorno bipolar avaliadas, obtidas a partir de bancos de dados de microarranjo de pré-frontal postmortem. Em uma análise mais rigorosa, identificamos apenas o regulon do gene early growth response 3 (EGR3) enriquecido nas duas assinaturas da doença em duas redes transcricionais do pré-frontal, estando reprimido no fenótipo bipolar. Nossos resultados sugerem o regulon do EGR3 como um alvo importante no transtorno bipolar. Considerando seu papel fundamental na resposta ao estresse e na translação de estímulos ambientas em mudanças na expressão gênica neuronal, propomos que uma disfunção em vias biológicas envolvendo EGR3 poderia levar a uma resposta prejudicada ao estresse e influenciar no risco para o transtorno bipolar. No quarto capítulo, então, caracterizamos o perfil de expressão gênica do modelo de células SH-SY5Y diferenciadas e avaliamos o comportamento do regulon do EGR3 de acordo com o protocolo de diferenciação. Além disso, identificamos moléculas com potencial de modular os regulons enriquecidos no transtorno bipolar visando testar o efeito destas drogas no referido modelo celular. Nossos resultados reforçam o fenótipo neuronal deste modelo in vitro e demonstram que o regulon do EGR3 está enriquecido nas células diferenciadas, sugerindo que ele é importante nesse processo e que este modelo experimental é adequado para estudar este regulon e as moléculas selecionadas pela análise de mapa de conectividade. Nós ainda avaliamos nas células SH-SY5Y o efeito do soro de pacientes bipolares, para investigar o papel da toxicidade sistêmica em células neuronais. O soro de pacientes, especialmente em estágio tardio da doença, causou toxicidade às células, reduzindo a densidade de neuritos e a viabilidade celular. Esses achados representam uma forma de desafio celular relacionado à toxicidade sistêmica do transtorno bipolar, propondo as células SH-SY5Y diferenciadas como um modelo in vitro para estudo desta doença. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a toxicidade sistêmica relacionada aos episódios recorrentes de humor pode influenciar nas alterações anatômicas cerebrais associadas com a progressão do transtorno bipolar, e a disfunção no regulon do EGR3 poderia estar envolvida com aspectos desta neuroprogressão considerando o papel de EGR3 na resposta ao estresse e na neuroplasticidade. Estas hipóteses, que também sugerem alvos interessantes para o desenvolvimento de novos tratamentos, devem ser apropriadamente validadas em modelos experimentais, como o modelo de células SH-SY5Y diferenciadas estudado neste trabalho. / Evidence suggests that bipolar disorder is associated with a systemic toxicity, represented by peripheral changes in markers of inflammation, oxidative stress and neurotrophins, which appears to be associated with mood episodes and illness progression leading to systemic damage and impaired neuroplasticity. The work presented in this thesis aimed to review these changes and explore possible mechanisms responsible for these findings, focusing on transcriptional regulation in bipolar disorder. In the first chapter, we review the peripheral biomarkers associated with mood episodes, their relationship with systemic toxicity and the possible mechanisms underlying this toxicity. We have shown, in Chapter 2, an example of structural brain changes in a bipolar patient with multiple episodes experience, as a possible example of ‘neuroprogression’ in bipolar disorder. Then we investigated dysfunctional transcriptional regulatory pathways in the prefrontal cortex of patients that could be associated with these changes and impaired neuroplasticity. Using innovative bioinformatics approaches, in Chapter 3, we identified some regulatory units (regulons) associated with the two gene signatures of bipolar disorder evaluated, obtained from microarray data sets from prefrontal postmortem studies. With a more rigorous analysis, we only identified the regulon of early growth response 3 gene (EGR3) enriched in the two bipolar signatures in the two transcriptional prefrontal networks evaluated, being EGR3 repressed in bipolar phenotype. Our results suggest the EGR3 regulon as an important target in bipolar disorder. Considering its key role in response to stress and translation of environmental stimuli into long-term changes in neuronal gene expression, we propose that a dysfunction in biological pathways involving EGR3 could lead to an impaired response to stress and influence on the risk for bipolar disorder. Then, in Chapter 4, we characterized the gene expression profile of differentiated SHSY5Y cells and evaluated the EGR3 regulon according to the differentiation protocol. Furthermore, we have identified molecules with potential to modulate the regulons enriched in bipolar disorder, using connectivity map analysis, in order to test the effect of these drugs on this cellular model in future studies. Our results consolidated the neuronal phenotype of this in vitro model and demonstrated that the EGR3 regulon is enriched in differentiated cells, suggesting that it is important in this process and that this experimental model is suitable for studying this regulon and molecules selected by connectivity map analysis. Moreover, in Chapter 5, we evaluated the effect of serum of bipolar patients on differentiated SH-SY5Y cells to investigate the role of systemic toxicity in neuronal cells. The serum of patients, especially at late stages of illness, caused toxicity to cells, reducing neurite density and cell viability. These findings represent a strategy of challenging cells related to the systemic toxicity of bipolar disorder, proposing differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model to study this disorder. Therefore, the results of this thesis suggest that systemic toxicity related to recurrent mood episodes may influence on the brain anatomical changes associated with the bipolar disorder progression, and dysfunction in EGR3 regulon could be involved with aspects of ‘neuroprogression’ considering the role of EGR3 in response to stress and neuroplasticity. These hypotheses, which also suggest interesting targets for the development of new treatments, should be further properly validated in experimental models such as the differentiated SH-SY5Y cells model studied in this work.

Introdução. A enzima iodotironina desiodase tipo 2 (D2) converte o pró-hormônio T4 em sua forma ativa, T3, um passo essencial no metabolismo da tiróide. O polimorfismo Tre92Ala no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações. Interessantemente, um estudo recente relatou que o polimorfismo D2 Tre92Ala interage com o polimorfismo Pro12Ala, no gene que codifica o fator de transcrição PPARγ2, na modulação da síndrome metabólica em indivíduos nãodiabéticos, sendo que os portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentam os piores fenótipos de síndrome metabólica e pressão arterial sistólica e diastólica. Objetivos. Avaliar o efeito isolado ou combinado dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação da resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Material e Métodos. Os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala foram genotipados em 711 pacientes com DM2 brancos, utilizando-se a técnica de discriminação alélica por PCR em tempo real. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um exame físico completo e a exames laboratoriais padrões. A resistência à insulina foi avaliada através do cálculo do índice HOMA (Homeostasis Model Assessment) em um subgrupo de 215 pacientes sem uso de insulina e com creatinina sérica < 1,5mg/dL. Resultados. As frequências dos alelos D2 92Ala e PPARγ2 12Ala foram 0,32 e 0,076, respectivamente, e suas frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy- Weinberg (p > 0,05). Pacientes com o genótipo D2 Ala/Ala apresentaram níveis mais altos de insulina plasmática no jejum e índice HOMA quando comparados com pacientes portadores dos genótipos Tre/Ala ou Tre/Tre (p = 0,015 e p = 0,001; respectivamente). Além disso, um efeito sinérgico significativo foi observado entre os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação do índice HOMA: portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentaram valores mais elevados de HOMA (mediana 8,5 [valor máximo 28,2 - valor mínimo 1,3]) do que os pacientes portadores das outras combinações genotípicas destes polimorfismos (4,0 [17,6-0,3] no grupo de pacientes com os genótipos D2 Tre/Tre - PPARγ2 Pro/Pro, 5,8 [35,2-0,9] no grupo D2 Ala/Ala - PPARγ2 Pro/Pro e 3,5 [17,2-0,5] no grupo D2 Tre/Tre- PPARγ2 12Ala), após ajuste para sexo, idade e índice de massa corporal (p da interação = 0,010). Conclusões. Pacientes com DM2 portadores dos genótipos D2 Ala/Ala e PPARγ2 12Ala apresentam níveis mais severos de resistência à insulina quando comparados aos pacientes com outras combinações genotípicas dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala. Isso sugere que esses dois polimorfismos interagem na modulação da resistência à insulina em indivíduos brancos, o que pode constituir um alvo terapêutico potencial.

Evidências sugerem que o transtorno bipolar esteja associado a uma toxicidade sistêmica, representada por alterações periféricas em marcadores de inflamação, estresse oxidativo e neurotrofinas, a qual parece estar associada aos episódios de humor e à progressão da doença levando a prejuízos sistêmicos e na neuroplasticidade. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo revisar estas alterações e explorar possíveis mecanismos responsáveis por estes achados, com enfoque em uma desregulação transcricional no transtorno bipolar. No primeiro capítulo, revisamos os biomarcadores periféricos associados aos episódios de humor, a relação destes com a toxicidade sistêmica e os possíveis mecanismos subjacentes a esta toxicidade. Seguimos ilustrando, no capítulo 2, um exemplo de alterações estruturais cerebrais em um paciente bipolar com experiência de múltiplos episódios, como um possível exemplo da neuroprogressão no transtorno bipolar. Em seguida, buscamos por vias de regulação transcricional disfuncionais no córtex pré-frontal de pacientes que poderiam estar associadas a essas alterações e neuroplasticidade prejudicada. A partir de abordagem inovadora de bioinformática, no capítulo 3, identificamos algumas unidades regulatórias (regulons) associadas com as duas assinaturas gênicas do transtorno bipolar avaliadas, obtidas a partir de bancos de dados de microarranjo de pré-frontal postmortem. Em uma análise mais rigorosa, identificamos apenas o regulon do gene early growth response 3 (EGR3) enriquecido nas duas assinaturas da doença em duas redes transcricionais do pré-frontal, estando reprimido no fenótipo bipolar. Nossos resultados sugerem o regulon do EGR3 como um alvo importante no transtorno bipolar. Considerando seu papel fundamental na resposta ao estresse e na translação de estímulos ambientas em mudanças na expressão gênica neuronal, propomos que uma disfunção em vias biológicas envolvendo EGR3 poderia levar a uma resposta prejudicada ao estresse e influenciar no risco para o transtorno bipolar. No quarto capítulo, então, caracterizamos o perfil de expressão gênica do modelo de células SH-SY5Y diferenciadas e avaliamos o comportamento do regulon do EGR3 de acordo com o protocolo de diferenciação. Além disso, identificamos moléculas com potencial de modular os regulons enriquecidos no transtorno bipolar visando testar o efeito destas drogas no referido modelo celular. Nossos resultados reforçam o fenótipo neuronal deste modelo in vitro e demonstram que o regulon do EGR3 está enriquecido nas células diferenciadas, sugerindo que ele é importante nesse processo e que este modelo experimental é adequado para estudar este regulon e as moléculas selecionadas pela análise de mapa de conectividade. Nós ainda avaliamos nas células SH-SY5Y o efeito do soro de pacientes bipolares, para investigar o papel da toxicidade sistêmica em células neuronais. O soro de pacientes, especialmente em estágio tardio da doença, causou toxicidade às células, reduzindo a densidade de neuritos e a viabilidade celular. Esses achados representam uma forma de desafio celular relacionado à toxicidade sistêmica do transtorno bipolar, propondo as células SH-SY5Y diferenciadas como um modelo in vitro para estudo desta doença. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a toxicidade sistêmica relacionada aos episódios recorrentes de humor pode influenciar nas alterações anatômicas cerebrais associadas com a progressão do transtorno bipolar, e a disfunção no regulon do EGR3 poderia estar envolvida com aspectos desta neuroprogressão considerando o papel de EGR3 na resposta ao estresse e na neuroplasticidade. Estas hipóteses, que também sugerem alvos interessantes para o desenvolvimento de novos tratamentos, devem ser apropriadamente validadas em modelos experimentais, como o modelo de células SH-SY5Y diferenciadas estudado neste trabalho. / Evidence suggests that bipolar disorder is associated with a systemic toxicity, represented by peripheral changes in markers of inflammation, oxidative stress and neurotrophins, which appears to be associated with mood episodes and illness progression leading to systemic damage and impaired neuroplasticity. The work presented in this thesis aimed to review these changes and explore possible mechanisms responsible for these findings, focusing on transcriptional regulation in bipolar disorder. In the first chapter, we review the peripheral biomarkers associated with mood episodes, their relationship with systemic toxicity and the possible mechanisms underlying this toxicity. We have shown, in Chapter 2, an example of structural brain changes in a bipolar patient with multiple episodes experience, as a possible example of ‘neuroprogression’ in bipolar disorder. Then we investigated dysfunctional transcriptional regulatory pathways in the prefrontal cortex of patients that could be associated with these changes and impaired neuroplasticity. Using innovative bioinformatics approaches, in Chapter 3, we identified some regulatory units (regulons) associated with the two gene signatures of bipolar disorder evaluated, obtained from microarray data sets from prefrontal postmortem studies. With a more rigorous analysis, we only identified the regulon of early growth response 3 gene (EGR3) enriched in the two bipolar signatures in the two transcriptional prefrontal networks evaluated, being EGR3 repressed in bipolar phenotype. Our results suggest the EGR3 regulon as an important target in bipolar disorder. Considering its key role in response to stress and translation of environmental stimuli into long-term changes in neuronal gene expression, we propose that a dysfunction in biological pathways involving EGR3 could lead to an impaired response to stress and influence on the risk for bipolar disorder. Then, in Chapter 4, we characterized the gene expression profile of differentiated SHSY5Y cells and evaluated the EGR3 regulon according to the differentiation protocol. Furthermore, we have identified molecules with potential to modulate the regulons enriched in bipolar disorder, using connectivity map analysis, in order to test the effect of these drugs on this cellular model in future studies. Our results consolidated the neuronal phenotype of this in vitro model and demonstrated that the EGR3 regulon is enriched in differentiated cells, suggesting that it is important in this process and that this experimental model is suitable for studying this regulon and molecules selected by connectivity map analysis. Moreover, in Chapter 5, we evaluated the effect of serum of bipolar patients on differentiated SH-SY5Y cells to investigate the role of systemic toxicity in neuronal cells. The serum of patients, especially at late stages of illness, caused toxicity to cells, reducing neurite density and cell viability. These findings represent a strategy of challenging cells related to the systemic toxicity of bipolar disorder, proposing differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model to study this disorder. Therefore, the results of this thesis suggest that systemic toxicity related to recurrent mood episodes may influence on the brain anatomical changes associated with the bipolar disorder progression, and dysfunction in EGR3 regulon could be involved with aspects of ‘neuroprogression’ considering the role of EGR3 in response to stress and neuroplasticity. These hypotheses, which also suggest interesting targets for the development of new treatments, should be further properly validated in experimental models such as the differentiated SH-SY5Y cells model studied in this work.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-12T18:26:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477435 bytes, checksum: 54c26ccf8c22f331c25e937b81f9b585 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T18:26:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477435 bytes, checksum: 54c26ccf8c22f331c25e937b81f9b585 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Infecções que acometem o trato respiratório de suínos levam a significativas perdas econômicas na suinocultura mundial. Um dos principais patógenos respiratórios em suínos é a bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae, o principal agente causal da pleuropneumonia. Atualmente podem ser encontrados 16 sorotipos de A. pleuropneumoniae com virulência distinta e complexa, sendo os principais fatores de virulência: exotoxinas Apx, lipopolissacarídeo (LPS), cápsula e a capacidade de formação de biofilme. O controle da doença é baseado no uso de antibióticos e cuidados no manejo da granja. A profilaxia pela imunização passiva ainda é ineficiente devido à dificuldade na obtenção de uma vacina contra todos os sorotipos encontrados. Assim, novas abordagens experimentais na elaboração de uma vacina eficiente associada a uma resposta imune protetora são essenciais porque podem representar novas alternativas na estratégia de controle da doença. A proteína Hfq é um componente central de regulação global pós-transcricional e participa diretamente na regulação da expressão de genes por facilitar a interação de RNAs pequenos com mRNAs alvos, sendo esta uma abordagem atual e relacionada ao controle da virulência em diversas bactérias patogênicas. Neste sentido, o estudo da chaperona de RNA Hfq é de extrema importância, uma vez que já foi demonstrado seu efeito pleiotrópico e impacto na virulência, na resposta a diferentes tipos de estresse e no crescimento celular de vários patógenos, incluindo A. pleuropneumoniae. Portanto, esse trabalho teve como objetivos: caracterizar in silico a proteína Hfq em A. pleuropneumoniae e analisar a expressão e a fase de maior abundância desta proteína ao longo do crescimento de A. pleuropneumoniae. As análises filogenéticas realizadas foram baseadas em análises de comparação de sequências de aminoácidos da proteína Hfq de diferentes membros da classe Gammaproteobacteria, na qual A. pleuropneumoniae está inserida. As demais análises foram conduzidas utilizando os sorotipos 1, 8 e 15 de A. pleuropneumoniae, sendo utilizadas as linhagens do tipo selvagem (WT) e hfq::3XFLAG. O alinhamento de sequências da proteína Hfq revelou uma identidade de 98% entre as proteínas Hfq de A. pleuropneumoniae de diferentes sorotipos, além de demonstar que Hfq de espécies de uma mesma família possuem maior relação filogenética. A análise da estrutura tridimensional da proteína em A. pleuropneumoniae demonstrou a presença de estruturas características da proteína presente em outos patógenos Gram-negativos, como uma α-hélice e folhas β. A análise da velocidade específica de crescimento por ANOVA entre as linhagens WT e hfq::3XFLAG do mesmo sorotipo revelou que não há diferença de crescimento entre essas linhagens do mesmo sorotipo. Quanto à expressão de Hfq, foi detectado um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, no período de 6-8 horas, dependendo do sorotipo investigado, e que a expressão de Hfq foi diferencial entre os sorotipos analisados. Esses resultados revelaram que a proteína Hfq é conservada entre os sorotipos de A. pleuropneumoniae e possui estrutura tridimensional característica. Além disso, a inserção da etiqueta FLAG em Hfq não alterou o perfil de crescimento celular e hà um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, sendo que os sorotipos apresentaram distribuição das formas diferencial entre os sorotipos e dinâmica de acordo com a fase de crescimento. Essa diferença pode estar relacionada aos diferentes perfis de virulência e de resposta a diferentes condições investigadas previamente, uma vez que a abundância nestes sorotipos apresentou distribuição temporal distinta. / Infections that affect the respiratory tract of pigs lead to significant economic losses in the swine industry worldwide. One of the major respiratory pathogen in pigs is the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae, the main causal agent of the pleuropneumonia. Currently, 16 serotypes can be found of A. pleuropneumoniae with distinct and complex virulence, with the main factors of virulence: exotoxin Apx, lipopolysaccharide (LPS), capsule and the biofilm formation capacity. Control of the disease is based on the use of antibiotics and care in the management of the farm. Prophylaxis by passive immunization is still inefficient because of the difficulty in getting a vaccine against all serotypes found. Thus, new experimental approaches in the development of an effective vaccine associated with a protective immune response are essential because they can represent new alternatives in the disease control strategy. The Hfq protein is a key component of the global post-transcriptional regulation and directly participates in the regulation of gene expression to facilitate the interaction of small RNAs with target mRNAs, which is a current approach and it relates to the control of virulence in many pathogenic bacteria. In this sense, the study of Hfq RNA chaperone is of extreme importance, since it has already demonstrated its pleiotropic effect and impact on virulence in response to different types of stress and cellular growth of various pathogens, including A. pleuropneumoniae. Therefore, this study aimed: to characterize in silico the Hfq protein in A. pleuropneumoniae and to analyze the expression and phase greater abundance of this protein throughout the growth of A. pleuropneumoniae. The phylogenetic analyzes were based on comparative analysis of amino acid sequences of protein Hfq of different members of the class Gammaproteobacteria, which A. pleuropneumoniae is inserted. The other analyzes were conducted using the serotypes 1, 8 and 15 of A. pleuropneumoniae, being used strains of wild-type (WT) and hfq::3XFLAG. The sequence alignment of Hfq protein sequences showed an identity of 98% between Hfq proteins of A. pleuropneumoniae of different serotypes, also demonstrating that Hfq species of the same family have a greater phylogenetic relationship. The analysis of the three-dimensional structure of the protein in A. pleuropneumoniae demonstrated the presence of specific structures of protein present in other Gram-negative pathogens, how one α-helix and β-strands. The analysis of the specific growth rate by ANOVA between strains WT and hfq::3XFLAG of the same serotype showed that there is no difference in growth between the strains. As the expression of Hfq, a greater accumulation of protein in the stationary growth phase was detected in the period of 6-8 hours, depending on the serotype investigated, and the expression of Hfq was differential between serotypes analyzed. These results demonstrate that Hfq is conserved among serotypes of A. pleuropneumoniae and has a three-dimensional structure conserved. Moreover, the insertion of the FLAG tag on Hfq did not affect the cell growth profile and there is a greater accumulation of the protein in the stationary phase of growth, whereas serotypes showed the distribution of forms differential between serotypes and dynamically according to the growth stage. This difference may be related to different profiles of virulence and response to different conditions previously investigated, since these abundant serotypes showed distinct temporal distribution.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-01-20T08:05:24Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 603500 bytes, checksum: 433189cac3305d7e763e298611ad0d96 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-20T08:05:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 603500 bytes, checksum: 433189cac3305d7e763e298611ad0d96 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um dos principais desafios da biologia molecular é medir e avaliar os perfis de expressão gênica em diferentes tecidos biológicos com o objetivo de entender os mecanismos de transformação molecular. O método RNA-Seq usa transcriptoma a partir de tecnologias de sequenciamentos de nova geração (SNG), utilizados para sequenciar cDNA que é derivado de uma amostra de RNA, e, assim, produzir milhões de sequenciamentos de leitura. Porém, apesar do custo dessas tecnologias vir diminuindo, é comum realizar experimentos com pouca ou nenhuma repetição. Assim, torna-se necessária a descoberta e o aprimoramento de metodologias estatísticas eficientes para a otimização das análises de dados gerados em plataformas de sequenciamento de genomas. O objetivo geral desse trabalho consistiu na comparação de metodologias estatísticas a fim de estudar o padrão de expressão gênica relacionado à quantificação desses genes conforme determinadas condições/tratamentos, em experimentos de RNA-Seq. Para a realização das análises utilizou-se um conjunto de dados simulados através do pacote TCC do R, com diferentes cenários, para comparar os métodos estatísticos DESeq e baySeq. Foram exploradas tecnologias de RNA-Seq do perfil de expressão gênica de um banco de dados contendo 1000 genes em duas condições, nos cenários com cinco repetições, três repetições, 2 repetições e sem repetição. Em um primeiro momento, tais dados foram analisados pelos dois métodos separadamente, comparando-se o efeito do número de repetições dentro de cada um. Em seguida, foi realizada a comparação entre os métodos, levando em conta também o número de repetições em cada cenário. De acordo com os resultados gerados nas análises não podemos afirmar que um método, entre os avaliados, é ótimo em todas as circunstâncias, pois o método de escolha para uma situação em particular depende das condições experimentais. No entanto, sob as condições utilizadas no desenvolver do experimento, o método abordado pelo baySeq foi o que apresentou um bom desempenho, nas combinações ocorridas entre os métodos e os tipos de genes analisados, ou seja, esse foi o método que obteve uma maior capacidade de identificação dos genes diferencialmente expressos. / One of the main challenges of molecular biology is to measure and assess the gene expression profiles in different biological tissues in order to understand the molecular mechanisms of transformation. The method uses RNA Seq transcriptome from Young generation sequencing technologies (NGS), used to sequence the cDNA which is derived from an RNA sample, and thus produce millions of reading sequencing. However, despite the cost of these technologies come decreasing, it is common experiment with little or no repetition. Thus, it becomes necessary discovery and improvement of efficient statistical methods to optimize the data analysis generated genome sequencing platforms. The aim of this study was to compare statistical methodologies to study the pattern of gene expression related to the quantification of these genes as certain conditions / treatments in RNA-Seq experiments. To carry out the analysis used a set of simulated data via the R TCC package with different scenarios to compare the statistical methods DESeq and baySeq. RNA-Seq technology of gene expression profile of a database containing 1000 genes were explored in two groups, in scenarios with five repetitions, three replicates, 2 repetitions and without repetition. At first, these data were analyzed by two methods separately, comparing the effect of the number of repetitions within each. Then, the comparison between the methods was carried out, taking into account also the number of repetitions in each scenario. According to the results generated in the analyzes can not be said that a method, among the evaluated, is great in all circumstances, as the method of choice for a particular situation depends on the experimental conditions. However, under the conditions used in developing the experiment, the method was approached by baySeq which performed well, in combinations that occurred between the methods and the types of genes analyzed, that is, that was the method that obtained a greater capacity Identification of differentially expressed genes.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-17T16:54:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1269695 bytes, checksum: f49b118e7b1dac5dc18d7437830e5087 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-17T16:54:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1269695 bytes, checksum: f49b118e7b1dac5dc18d7437830e5087 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este estudo foi dividido em 3 experimentos objetivando-se: 1) investigar os efeitos da supernutrição materna sobre o desenvolvimento gonadal e expressão gênica hipofisário- gonadal em fetos bovinos no terço final da gestação. Vinte e sete vacas secas multíparas foram alimentados ad libitum (E) ou em nível de mantença (M) de mesma dieta. Doze vacas de H (n = 6) e M (n = 6) gestantes de fetos do sexo feminino foram submetidos à eutanásia aos 199 e 268 dias de gestação (DG; n = 3 para H ou M em cada DG). Quinze vacas de H (n = 6) e M (n = 9) gestantes de fetos masculinos foram sacrificados aos 139, 199 e 241 DG (n = 2 para H e n = 3 para M em cada DG). 2) Avaliar os efeitos de diferentes planos nutricionais no desenvolvimento do parênquima mamário (PAR), na expressão de marcadores lipogênicos (CD36, ACCA, FASN, ADIPOR1), nas concentrações de hormônios no sangue e expressão hepática dos genes GHR, IGF1, IGFBP2 e IGFBP3 em novilhas pre-púberes. Dezoito novilhas foram alimentadas 1 de 3 planos nutricionais (n = 6 / tratamento) para sustentar um ganho médio diário (GMD), como segue: alto ganho (AG-1 kg/d), baixo ganho (BG- 0,5 kg/d) ou mantença (MA). 3) Elucidar se os padrões de expressão dos genes ESR1, GDF9, FSHR, LHR, BMPR2, TGFB1, TGFB2, BMP15, BMP6, BMP7, CYP19A1, HSD3B1, IGFR, IGF1 e IGF2 poderiam estar envolvido na modulação do início da puberdade em novilhas da raça Brahman. No primeiro experimento, os números de folículos primordiais e totais foram menores nos ovários dos fetos oriundos de vacas alimentadas E do que das vacas M. Estes resultados foram opostos para folículos pré-antrais e antrais. As proporções volumétricas e os diâmetros dos cordões seminíferos foram menores nos testículos dos fetos oriundos das vacas alimentadas E em comparação as vacas M. A expressão pituitária do gene FSH foi maior nos fetos fêmeas de vacas alimentadas E do que das vacas M, independentemente do DG, ao passo que a expressão do gene LHB não diferiu. As expressão ovarianas fetais dos genes P450 aromatase, StAR, BMPR2, TGFB1, GDF9, FSHR, Bax e CASP3 foram maiores dos fetos oriundos das vacas alimentadas E do que 5 das vacas M, independentemente do DG. As expressões testiculares fetais dos genes StAR, HSD17B3, IGF1, IGF2 e IGF1R foram maiores dos fetos oriundos das vacas alimentadas M do que das vacas E. De modo geral, a ingestão materna ad libitum parece afetar o crescimento folicular ovariano fetal e números de folículos, o qual pode influenciar o tamanho da reserva ovariana em sua prole. Nos fetos machos, a ingestão materna ad libitum parece perturbar o desenvolvimento testicular e pode ter implicações na produção de esperma. No segundo experimento, os pesos dos PAR mamário e relação PAR/GM foram menores nas novilhas de AG do que novilhas de MA e BG, visto que a gordura extraparenquimal mamária foi maior nas novilhas de AG do que em outros grupos. Novilhas alimentadas para AG apresentaram maior fração de lipídica e menor fração proteica no PAR. No entanto, o número de adipócitos intraparenquimais foi semelhante entre os grupos. Novilhas alimentadas para AG tiveram maior concentração sérica de IGF1 do que outros, e a concentração sérica de insulina foi menor nas novilhas de AG em comparação as novilhas de MA e BG. Os genes GHR, IGF1 e IGFBP3 foram up-regulados enquanto o gene IGFBP2 foi down-regulado no fígado das novilhas de HG relação aos outros grupos. Os genes CD36, ACCA, FASN e ADIPOR1 foram-se up- regulados pelo nível de ingestão de nutrientes. No geral, estes resultados demonstram que a elevada ingestão de nutrientes favoreceu ao acúmulo de gordura corporal e na glândula mamária. Estes resultados poderiam servir como preditores do comprometimento do desenvolvimento mamário. Finalmente, os dados qRT-PCR obtidos no terceiro experimento revelaram maior expressão dos genes FSHR, BMP7, CYP19A1, IGF1 e IGF1R em novilhas pre-púberes em comparação as novilhas pós- púberes. Além disso, a expressão do gene IGF1 foi positivamente correlacionada com a expressão do gene BMP7 (P = 0.07; r = 0.84) e a expressão do HSD3B1 foi negativamente correlacionada com a expressão do gene CY19A1 (P = 0.3; r = -0.90). Estes resultados sugerem que a expressão diferencial dos genes ovarianos pode estar associado com as alterações na dinâmica folicular e diferentes tipos de populações celulares, os quais surgiram como consequência da puberdade e a fase lútea. A hipótese que emerge é que dois reguladores-chave da atividade do ovário pré-puberdade, BMP7 e IGF1 modulam a expressão de FSHR, LHR, IGFR1 e CYP19A1. BMP7 parece regular LHR e up-regular FSHR e CYP19A1, que medeiam a dinâmica folicular ovariana dessas 6 novilhas. Portanto, BMP7 e IGF1 parecem desempenhar papéis reguladores sinérgicos e foram previstos interagir entre si. / This study was divided in three experiments that aimed to: 1) investigate effects of maternal overnutrition on gonadal development and pituitary-gonadal gene expression in cattle fetuses at mid and late gestation. Twenty-seven multiparous dry cows were fed either high (ad libitum, H) or moderate (M) intake of the same diet. Twelve cows from H (n=6) and M (n=6) intake carrying females fetuses were euthanized at 199 and 268 days of gestation (DG; n=3 for H or M on each DG). Fifteen cows from H (n=6) and M intake (n=9) carrying male fetuses were euthanized at 139, 199 and 241 DG (n=2 for H and n=3 for M on each DG). 2) To evaluate effects of different planes of nutrition on mammary parenchyma (PAR) development, expression of lipogenic marks (CD36, ACCA, FASN, ADIPOR1), concentrations of blood hormones and liver GHR, IGF1, IGFPB-2 and -3 mRNA expression in prepubertal heifers. Eighteen heifers were fed 1 of 3 nutrient intake levels (n = 6/treatment) designed to sustain an average daily gain (ADG), as follows: high gain (HG-1 kg/d), low gain (LG- 0.5 kg/d) or maintenance (MA). 3) To elucidated if the expression pattern of ESR1, GDF9, FSHR, LHR, BMPR2, TGFB1, TGFB2, BMP15, BMP6, BMP7, CYP19A1, HSD3B1, IGF1, IGFR1 and IGF2 genes could be involved in modulate the timing of puberty in Brahman heifers. In the first experiment, primordial and total follicle numbers were lower in fetal ovaries from H than in M intake cows. These results were reverse for preantral and antral follicles. Volumetric proportion and diameter of seminiferous cord were lower in fetal testis of H than M intake cows. The expression level of FSHB was greater in pituitary gland of female fetus from H compared to M intake cows, irrespective of DG, whereas LHB gene expression did not differ. In males, FSHB and LHB gene expression levels were similar between maternal intake groups. Fetal ovarian expression of P450 aromatase, StAR, BMPR2, TGFBR1, GDF9, FSHR, Bax and CASP3 genes were higher in H than in M intake cows, irrespective of DG. Fetal testicular expression of StAR, HSD17B3, IGF1, IGF2 and IGF1R genes were higher in M than in H intake cows. Overall, maternal H intake seems to affect fetal ovarian follicular growth and number of follicles, which may 8 affect size of ovarian reserve in their offspring. In male fetus, maternal H intake seems to disturb testicular development and may have implications on sperm production. In the second experiment, mammary PAR weight and MA to MG ratio was lower in HG than MA and LG heifers, whereas mammary extraparenchymal fat was greater in HG heifers than other groups. Heifers fed the HG had a greatest fraction of lipids in their PAR, and smallest fraction of protein in their PAR. However, the number of intraparenchymal adipocytes was similar between the groups. Heifers fed the HG had greater serum IGF1 than others, and serum insulin was lower in MA than HG and LG heifers. The liver GHR, IGF1 and IGFBP3 mRNA was higher whereas IGFBP2 mRNA was lower in HG heifers compared to others. The expression of CD36, ACCA, FASN and ADIPOR1 were up regulated by nutrient intake level. Overall, these results demonstrated that enhancing nutrient intake favored to fat accumulation on body and mammary gland, also resulted adipocyte hypertrophy in the PAR of HG heifers, which could be a predictor of impaired mammary development. Finally, qRT-PCR data from the third experiment revealed the expression of FSHR, BMP7, CYP19A1, IGF1 and IGFR1 mRNA was greater in PRE heifers, when contrasted to POST heifers. In addition, the expression of IGF1 mRNA was positively correlated with BMP7 mRNA (P = 0.07, r = 0.84) and the expression of HSD3B1 mRNA was negatively correlated with expression of CY19A1 mRNA (P = 0.03, r = -0.90). Taken together, these results suggest that the differential expression of ovarian genes could be associated with changes in follicular dynamics and different cell populations that have emerged as consequence of puberty and the luteal phase. The emerging hypothesis is that two key regulators of ovarian activity pre-puberty, BMP7 and IGF1 modulate the expression of FSHR, LHR, IGFR1 and CYP19A1. BMP7 seems to down-regulate LHR and up-regulate FSHR and CYP19A1, which mediates the follicular dynamics in heifer ovaries. Thus, BMP7 and IGF1 seem to play synergic regulatory roles and were predicted to interact.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-08-18T17:41:14Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 741942 bytes, checksum: 3fc8028ea0af6835834db6dfbdde4a16 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-18T17:41:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 741942 bytes, checksum: 3fc8028ea0af6835834db6dfbdde4a16 (MD5) Previous issue date: 2015-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Diversos mecanismos foram aprimorados durante a evolução das plantas de modo a se obter uma resposta adequada às variações ambientais, principalmente no que respeita os mecanismos relacionados ao controle dos movimentos estomáticos. Nesse contexto, o vacúolo parece exercer um papel preponderante na tolerância a vários estresses em função da sua plasticidade em acumular solutos para manutenção do turgor e integridade celular ou mesmo para estabilizar compostos tóxicos. Dada a relevância dos estômatos para a fixação de CO2, adicionada à atuação dos ácidos orgânicos no controle dos movimentos estomáticos e o papel do vacúolo como acumulador de solutos, este trabalho buscou investigar como a perda funcional do transportador vacuolar de malato (AttDT) impacta Arabidopsis thaliana, de modo a caracterizá-las e entender como o transportador, em conjunto com ácidos orgânicos, afetam o metabolismo primário e os movimentos estomáticos. Reduções nas taxas fotossintéticas associadas com menores condutâncias estomática e mesofílica foram observadas em mutantes attdt. Entretanto, incrementos nas taxas respiratórias, sem alteração nos níveis totais de clorofilas, açúcares, proteínas e aminoácidos foram observados. De modo a suprir a demanda energética e assim garantiar a manutenção do crescimento, como observado em plantas attdt, substratos alternativos parecem estar sendo utilizados, culminando com um funcionamento não cíclico do ciclo dos ácidos tricarboxilicos (TCA), visto que succinato, fumarato e malato foram reduzidos ao passo que incrementos nos níveis de citrato, simultaneamente à alterações no perfil de aminoácidos, especialmente aspartato e glutamina, foram evidentes. Embora o crescimento não tenha sido drasticamente afetado, cumpre mencionar que plantas com perda do transportador AttDT apresentam fenótipo metabólico que se assemelham grandemente ao de plantas sob estresse, principalmente por seca. Coletivamente, os resultados obtidos indicam que AttDT é um transportador de fundamental importância para manutenção dos níveis adequados de ácidos orgânicos entre os compartimentos celulares, e que a sua perda funcional ocasiona uma reprogramação metabólica e afeta diretamente o metabolismo primário, especialmente a respiração e o catabolismo de aminoácidos. / Several mechanisms were improved during the course of plant evolution to obtain an adequate response to environmental variations, particularly mechanisms related to the control of stomatal movements. Accordingly, the vacuole seems to play an important role in plant stress tolerance, due to its plasticity to accumulate solutes maintaining both cell integrity and turgor or further stabilizing toxic compounds. Given the pivotal importance of stomata to CO2 fixation, in addition to the role of organic acids in controlling stomatal movements coupled with the key role of vacuole in the accumulation of solutes, this study investigated the functional role of the vacuolar malate transporter, AttDT, in order to characterize and understand how the absence of this carrier, together with organic acids, affect both the primary metabolism and stomatal movements. Reductions of photosynthesis rates coupled with decrease on both mesophilic and stomatal conductance were observed in mutant attdt. However, enhanced respiratory rates without impacting the total levels of chlorophyll, sugars, proteins and amino acids were observed. In order to supply the energy demand to maintain growth that was not altered in attdt plants, it seems that alternative substrates are used. This is likely leading to a non-cyclic function of the TCA cycle, as succinate, malate and fumarate were reduced whereas increase of citrate levels was observed, simultaneously to changes in the amino acid profile, especially aspartate and glutamine. Interestingly, plants lacking AttDT display a metabolic phenotype that resembles that of plants under stress, mainly drought, although growth has not been affected. Taken together, the results obtained here indicates that AttDT is an important carrier allowing the maintainance of suitable levels of organic acids between cellular compartments, directly affecting the primary metabolism, especially respiration and amino acids.

Introdução. A enzima iodotironina desiodase tipo 2 (D2) converte o pró-hormônio T4 em sua forma ativa, T3, um passo essencial no metabolismo da tiróide. O polimorfismo Tre92Ala no gene que codifica a D2 foi associado com resistência à insulina em algumas populações. Interessantemente, um estudo recente relatou que o polimorfismo D2 Tre92Ala interage com o polimorfismo Pro12Ala, no gene que codifica o fator de transcrição PPARγ2, na modulação da síndrome metabólica em indivíduos nãodiabéticos, sendo que os portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentam os piores fenótipos de síndrome metabólica e pressão arterial sistólica e diastólica. Objetivos. Avaliar o efeito isolado ou combinado dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação da resistência à insulina em pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Material e Métodos. Os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala foram genotipados em 711 pacientes com DM2 brancos, utilizando-se a técnica de discriminação alélica por PCR em tempo real. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um exame físico completo e a exames laboratoriais padrões. A resistência à insulina foi avaliada através do cálculo do índice HOMA (Homeostasis Model Assessment) em um subgrupo de 215 pacientes sem uso de insulina e com creatinina sérica < 1,5mg/dL. Resultados. As frequências dos alelos D2 92Ala e PPARγ2 12Ala foram 0,32 e 0,076, respectivamente, e suas frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy- Weinberg (p > 0,05). Pacientes com o genótipo D2 Ala/Ala apresentaram níveis mais altos de insulina plasmática no jejum e índice HOMA quando comparados com pacientes portadores dos genótipos Tre/Ala ou Tre/Tre (p = 0,015 e p = 0,001; respectivamente). Além disso, um efeito sinérgico significativo foi observado entre os polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala na modulação do índice HOMA: portadores do genótipo D2 Ala/Ala e do alelo PPARγ2 12Ala apresentaram valores mais elevados de HOMA (mediana 8,5 [valor máximo 28,2 - valor mínimo 1,3]) do que os pacientes portadores das outras combinações genotípicas destes polimorfismos (4,0 [17,6-0,3] no grupo de pacientes com os genótipos D2 Tre/Tre - PPARγ2 Pro/Pro, 5,8 [35,2-0,9] no grupo D2 Ala/Ala - PPARγ2 Pro/Pro e 3,5 [17,2-0,5] no grupo D2 Tre/Tre- PPARγ2 12Ala), após ajuste para sexo, idade e índice de massa corporal (p da interação = 0,010). Conclusões. Pacientes com DM2 portadores dos genótipos D2 Ala/Ala e PPARγ2 12Ala apresentam níveis mais severos de resistência à insulina quando comparados aos pacientes com outras combinações genotípicas dos polimorfismos D2 Tre92Ala e PPARγ2 Pro12Ala. Isso sugere que esses dois polimorfismos interagem na modulação da resistência à insulina em indivíduos brancos, o que pode constituir um alvo terapêutico potencial.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-25T15:26:20Z No. of bitstreams: 1 Armando_de_Menezes_Neto.pdf: 3814357 bytes, checksum: 6fdde9d3852e34ff90fb510ffa3e7cc3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-25T15:26:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Armando_de_Menezes_Neto.pdf: 3814357 bytes, checksum: 6fdde9d3852e34ff90fb510ffa3e7cc3 (MD5) Previous issue date: 2008 / Durante o ciclo de vida dos parasitos causadores da malária, uma das fases cruciais é o desenvolvimento sexual e a conseqüente invasão do epitélio intestinal do hospedeiro invertebrado. Proteínas dos estágios do ciclo esporogônico podem ser alvos para vacinas Bloqueadoras de Transmissão (TBVs). Uma das proteínas micronemais que já demonstrou ser um alvo promissor para a inibição do desenvolvimento de oocistos e, portanto, da transmissão, é a WARP (von Willebrand Factor A Domain Related Protein), uma proteína secretada, aparentemente envolvida com a adesão e locomoção dos parasitos. Estudos recentes demonstraram que WARP é sujeita à repressão traducional em macrogametócitos de P. berghei, com o seu mRNA sendo silenciado pela proteína DOZI através da formação de uma ribonucleoproteína. Os objetivos deste estudo foram i) Analisar o perfil de expressão da proteína WARP nos estágios sexuais de P. gallinaceum, ii) Comparar o perfil de transcrição de WARP, durante o desenvolvimento sexual, com perfis de alguns genes relacionados à regulação da expressão ou à invasão epitelial, e iii) Avaliar o potencial da proteína WARP como um candidato à vacina através da análise do seu padrão de expressão. O domínio vWA de PfWARP foi produzido como uma proteína recombinante que foi usada para a produção de anticorpos policlonais. Foram realizados experimentos de microscopia confocal usando estes anticorpos para se detectar WARP em estágios sexuais cultivados de P. gallinaceum. RT-PCR foi usada para detectar WARP e os outros genes estudados a partir de amostras de sangue contendo gametócitos e a partir de intestinos de Aedes fluviatilis infectados, coletados até 24 horas após a alimentação. A proteína WARP pode ser detectada desde os estágios iniciais do desenvolvimento de oocinetos, em zigotos recém-fertilizados, até as formas maduras alongadas. Em zigotos, sua expressão parece ser intra-vesicular e localizada na periferia citoplasmática, próxima à membrana celular, e em oocinetos maduros, WARP apresenta uma distribuição granular com concentração focal na região apical, corroborando sua localização micronemal. Seu transcrito foi detectado, por RT-PCR, em gametócitos de P. gallinaceum. Ainda, o transcrito para a proteína PgDOZI também foi detectado em gametócitos, indicando que a repressão traducional possa ser um mecanismo de regulação gênica também nesta espécie, e que WARP seja, provavelmente, um de seus alvos de regulação. Esta é a primeira vez que a proteína WARP é detectada tão prematuramente durante o desenvolvimento de oocinetos e a primeira evidência de expressão dos genes DOZI, α-Tubulina e MAOP em P. gallinaceum. / During the life cycle of malaria parasites, one of the most crucial phases is the sexual development and the consequential midgut invasion of the invertebrate host. Proteins from stages of sporogonic cycle could be target for Transmission Blocking Vaccines (TBVs). One of the micronemal proteins that has already been shown as a promising target for inhibiting oocysts development, and therefore transmission, is the von Willebrand Factor A Related Protein (WARP), a secreted ookinete protein thought to be involved in parasite adhesion and locomotion. Recent studies have demonstrated that WARP is subjected to repressed translation in macrogametocytes of P. berghei, with its mRNA being silenced by the DOZI protein through the formation of a ribonucleoprotein. The goals of this study were i) to analyze the expression profile of the WARP protein during sexual stages of P. gallinaceum, ii) to compare WARP’s transcription profile, during sexual development, with other genes involved in regulation of expression or midgut invasion, and iii) to evaluate the potential deployment of the WARP protein as a vaccine candidate based on its expression pattern. The vWA domain from PfWARP was produced as a recombinant protein that was used to raise polyclonal antibodies. Confocal microscopy was carried out using these antibodies to detect WARP in cultured Plasmodium gallinaceum sexual stages. RT-PCR was used to detect WARP and the other studied genes from samples of blood containing gametocytes and from infected midguts of Aedes fluviatilis mosquitoes up to 24 hours post feeding. The WARP protein can be detected since the early stages of ookinete development, in newly fertilized zygotes, up to the mature palmate-shaped forms. In zygotes it appears to have an intra-vesicular expression and to be located in the cytoplasm’s periphery in close proximity to the cellular membrane, and in the mature ookinetes, WARP presents an intracellular granular distribution with focal concentration towards the apical end, corroborating its micronemal localization. Its transcript was detected in P. gallinaceum gametocytes by using RT-PCR. Also, the transcript for the PgDOZI protein was detected in gametocytes, indicating that repressed translation might be a gene expression regulating mechanism for this species also, and that WARP might be one of the targets. This is the first time that the protein WARP is detected so early in ookinete development, and it is the first evidence for the expression of DOZI, α-Tubulin and MAOP in P. gallinaceum.

Evidências sugerem que o transtorno bipolar esteja associado a uma toxicidade sistêmica, representada por alterações periféricas em marcadores de inflamação, estresse oxidativo e neurotrofinas, a qual parece estar associada aos episódios de humor e à progressão da doença levando a prejuízos sistêmicos e na neuroplasticidade. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo revisar estas alterações e explorar possíveis mecanismos responsáveis por estes achados, com enfoque em uma desregulação transcricional no transtorno bipolar. No primeiro capítulo, revisamos os biomarcadores periféricos associados aos episódios de humor, a relação destes com a toxicidade sistêmica e os possíveis mecanismos subjacentes a esta toxicidade. Seguimos ilustrando, no capítulo 2, um exemplo de alterações estruturais cerebrais em um paciente bipolar com experiência de múltiplos episódios, como um possível exemplo da neuroprogressão no transtorno bipolar. Em seguida, buscamos por vias de regulação transcricional disfuncionais no córtex pré-frontal de pacientes que poderiam estar associadas a essas alterações e neuroplasticidade prejudicada. A partir de abordagem inovadora de bioinformática, no capítulo 3, identificamos algumas unidades regulatórias (regulons) associadas com as duas assinaturas gênicas do transtorno bipolar avaliadas, obtidas a partir de bancos de dados de microarranjo de pré-frontal postmortem. Em uma análise mais rigorosa, identificamos apenas o regulon do gene early growth response 3 (EGR3) enriquecido nas duas assinaturas da doença em duas redes transcricionais do pré-frontal, estando reprimido no fenótipo bipolar. Nossos resultados sugerem o regulon do EGR3 como um alvo importante no transtorno bipolar. Considerando seu papel fundamental na resposta ao estresse e na translação de estímulos ambientas em mudanças na expressão gênica neuronal, propomos que uma disfunção em vias biológicas envolvendo EGR3 poderia levar a uma resposta prejudicada ao estresse e influenciar no risco para o transtorno bipolar. No quarto capítulo, então, caracterizamos o perfil de expressão gênica do modelo de células SH-SY5Y diferenciadas e avaliamos o comportamento do regulon do EGR3 de acordo com o protocolo de diferenciação. Além disso, identificamos moléculas com potencial de modular os regulons enriquecidos no transtorno bipolar visando testar o efeito destas drogas no referido modelo celular. Nossos resultados reforçam o fenótipo neuronal deste modelo in vitro e demonstram que o regulon do EGR3 está enriquecido nas células diferenciadas, sugerindo que ele é importante nesse processo e que este modelo experimental é adequado para estudar este regulon e as moléculas selecionadas pela análise de mapa de conectividade. Nós ainda avaliamos nas células SH-SY5Y o efeito do soro de pacientes bipolares, para investigar o papel da toxicidade sistêmica em células neuronais. O soro de pacientes, especialmente em estágio tardio da doença, causou toxicidade às células, reduzindo a densidade de neuritos e a viabilidade celular. Esses achados representam uma forma de desafio celular relacionado à toxicidade sistêmica do transtorno bipolar, propondo as células SH-SY5Y diferenciadas como um modelo in vitro para estudo desta doença. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a toxicidade sistêmica relacionada aos episódios recorrentes de humor pode influenciar nas alterações anatômicas cerebrais associadas com a progressão do transtorno bipolar, e a disfunção no regulon do EGR3 poderia estar envolvida com aspectos desta neuroprogressão considerando o papel de EGR3 na resposta ao estresse e na neuroplasticidade. Estas hipóteses, que também sugerem alvos interessantes para o desenvolvimento de novos tratamentos, devem ser apropriadamente validadas em modelos experimentais, como o modelo de células SH-SY5Y diferenciadas estudado neste trabalho. / Evidence suggests that bipolar disorder is associated with a systemic toxicity, represented by peripheral changes in markers of inflammation, oxidative stress and neurotrophins, which appears to be associated with mood episodes and illness progression leading to systemic damage and impaired neuroplasticity. The work presented in this thesis aimed to review these changes and explore possible mechanisms responsible for these findings, focusing on transcriptional regulation in bipolar disorder. In the first chapter, we review the peripheral biomarkers associated with mood episodes, their relationship with systemic toxicity and the possible mechanisms underlying this toxicity. We have shown, in Chapter 2, an example of structural brain changes in a bipolar patient with multiple episodes experience, as a possible example of ‘neuroprogression’ in bipolar disorder. Then we investigated dysfunctional transcriptional regulatory pathways in the prefrontal cortex of patients that could be associated with these changes and impaired neuroplasticity. Using innovative bioinformatics approaches, in Chapter 3, we identified some regulatory units (regulons) associated with the two gene signatures of bipolar disorder evaluated, obtained from microarray data sets from prefrontal postmortem studies. With a more rigorous analysis, we only identified the regulon of early growth response 3 gene (EGR3) enriched in the two bipolar signatures in the two transcriptional prefrontal networks evaluated, being EGR3 repressed in bipolar phenotype. Our results suggest the EGR3 regulon as an important target in bipolar disorder. Considering its key role in response to stress and translation of environmental stimuli into long-term changes in neuronal gene expression, we propose that a dysfunction in biological pathways involving EGR3 could lead to an impaired response to stress and influence on the risk for bipolar disorder. Then, in Chapter 4, we characterized the gene expression profile of differentiated SHSY5Y cells and evaluated the EGR3 regulon according to the differentiation protocol. Furthermore, we have identified molecules with potential to modulate the regulons enriched in bipolar disorder, using connectivity map analysis, in order to test the effect of these drugs on this cellular model in future studies. Our results consolidated the neuronal phenotype of this in vitro model and demonstrated that the EGR3 regulon is enriched in differentiated cells, suggesting that it is important in this process and that this experimental model is suitable for studying this regulon and molecules selected by connectivity map analysis. Moreover, in Chapter 5, we evaluated the effect of serum of bipolar patients on differentiated SH-SY5Y cells to investigate the role of systemic toxicity in neuronal cells. The serum of patients, especially at late stages of illness, caused toxicity to cells, reducing neurite density and cell viability. These findings represent a strategy of challenging cells related to the systemic toxicity of bipolar disorder, proposing differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model to study this disorder. Therefore, the results of this thesis suggest that systemic toxicity related to recurrent mood episodes may influence on the brain anatomical changes associated with the bipolar disorder progression, and dysfunction in EGR3 regulon could be involved with aspects of ‘neuroprogression’ considering the role of EGR3 in response to stress and neuroplasticity. These hypotheses, which also suggest interesting targets for the development of new treatments, should be further properly validated in experimental models such as the differentiated SH-SY5Y cells model studied in this work.