Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:13:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_AlissonCampos_M.pdf: 1504948 bytes, checksum: 1996e50c40d74c7a53a5058831fb03ab (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Estudos anteriores demonstraram que em miócitos cardíacos submetidos a estímulos mecânicos ocorre pronta fosforilação e ativação da FAK. Resultados de estudos recentes, realizados em corações de ratos indicaram que em resposta a estímulos mecânicos, a FAK, além de ser ativada, localiza-se no núcleo dos miócitos cardíaco. Estudos conduzidos em corações de ratos Wistar adultos, utilizando a técnica de Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) com anticorpo anti- FAK, identificaram uma seqüência intrônica de 182pb do gene fosfolambam (plnil), contendo sítio para a ligação do fator de transcrição MEF2. Portanto, no presente estudo, investigamos se a região intrônica do gene que codifica o fosfolamban tem função regulatória transcricional. Utilizando técnicas de EMSA (Ensaio de retardamento da mobilidade eletroforética), ensaios de Precipitação e de gene reporter, avaliamos a interação entre a FAK e plnil além da função regulatória transcricional dessa seqüência. Como resultado, demonstramos que ocorre pronta ativação da FAK e seu acúmulo no núcleo de miócitos cardíacos de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a coarctação da aorta. Através de ensaios de EMSA, demonstramos que proteínas nucleares de ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecarga pressórica, apresentaram um aumento na interação com a sonda plni1 em relação aqueles de ratos controles. Também, ensaios de EMSA indicaram uma interação entre MEF2 e a sonda plnil, mas não entre a FAK ou seus domínios (FERM e Cterminal) com a sonda plnil. Ensaios de precipitação com fragmentos recombinantes da FAK (GST-FERM e GSTCterminal) com extratos nucleares de coração de ratos coarctados indicaram uma associação entre FAK e MEF2. Ensaios adicionais demonstraram que a interação entre FAK e MEF2 é dependente do domínio Cterminal e do estado fosforilado da FAK. Estudos de transfecção com gene reporter, utilizando plasmídeo contendo a seqüência plnil, em cultura de miócitos cardíacos submetidos ao estiramento, demonstraram que a região intrônica plnil possui função regulatória transcricional e esse papel é dependente da ligação do fator de transcrição MEF2 ao seu sítio específico no DNA. Portanto, esses dados indicam que FAK e MEF2 podem estar envolvidos na regulação da expressão do gene pln através de regulação mediado pela região intrônica plnil. / Abstract: Previous studies have shown that mechanical stress induces phosphorylation and activation of FAK in cardiac myocytes. Recent studies carried out in rat overloaded hearts indicated that FAK re-locates in the nucleus of the cardiac myocytes. By assays in the nuclei of overloaded cardiac myocytes with chromatin immunoprecipitation (ChIP) approach with anti-FAK antibody, we identified an intronic sequence of phospholamban gene (plnil), containing a MEF2 consensus site. In the present study, we investigated whether Plnil has any regulatory function in the pln. To accomplish this, we combinated techniques such as EMSA (Electrophoreses Mobility Shift Assay), reporter gene and pulldown assays. FAK was shown to be rapidly activated and to accumulate in the nuclei of cardiac myocytes taken from overloaded left ventricle. Using EMSA assays, we demonstrated that nuclear extracts of left ventricle rats overloaded, interacted with the plnil probe. EMSA assays, also indicated an interaction between MEF2 and the plnil probe, but no interaction was found between FAK or its domains (FERM and Cterminal) with the plni1. Pulldown assays with FAK recombinant fragments (GST-FERM and GST-Cterminal) and nuclear extracts from left ventricle overloaded indicated that FAK and MEF2 physically interact through FAK Cterminal domain. Reporter gene assays, using a construction of plnil coupled luciferase transfected to cardiac myocytes culture underwent stretching, had demonstrated that the intronic region has transcriptional regulatory function and this role is dependent of the transcription factor MEF2 binding site in the DNA. Therefore, these data indicate that FAK and MEF2 interact in the nuclei of cardiac myocytes and that FAK/MEF2 complex may regulate phospholamban gene expression through the plnil. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Renato Vicentini dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:28:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DelBem_LuizEduardoVieira_D.pdf: 43647659 bytes, checksum: cc24ef3c44baab981cbc66519b37ce4b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O sequenciamento de um número crescente de genomas completos tem transformado a biologia. Mais especificamente, no campo da biologia evolutiva, tem se tornado possível endereçar perguntas centrais sobre o funcionamento ultimato dos mecanismos de transformação genética, com potencial impacto em todos os campos da biologia, assim como na filosofia. Esta tese está dividida em dois aspectos importantes da evolução de genomas: o processo de duplicação e fixação de genes duplicados, que é a base do surgimento de famílias multigênicas, e a evolução de redes de regulação, que determinam as relações de causalidade nos processos celulares. Os dois aspectos se relacionam à evolução da complexidade, tanto no que tange o conteúdo gênico dos seres vivos quanto nas interações mecanistica entre os genes via seus produtos (RNAs e proteínas basicamente). No primeiro aspecto abordamos a evolução de dois mecanismos biológicos que depende da ação integrada entre proteínas de famílias distintas: o mecanismo de síntese e degradação do polissacarídeo de parede celular xiloglucano, e o ciclo das chaperonas calreticulina/calnexina envolvidas no controle de qualidade de proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático. Nossos trabalhos mostraram que uma forma primordial de xiloglucano, mais simples, surgiu antes da conquista do meio terrestre pela linhagem das plantas, ao contrário do que se imaginava, e que o ciclo calreticulina/calnexina é produto da subfuncionalização em eucariotos basais de uma chaperona ancestral, além do surgimento de funções específicas na família da calreticulina em plantas terrestres. O interesse em evolução de famílias multigênicas nos levou a desenvolver um método (Phylexpress) para análise de ortologia em larga escala, bem como permitir a integração de dados de expressão na tentativa de entender a dinâmica evolutiva da expressão gênica em famílias multigênicas. Utilizamos nosso método para revisitar o conteúdo gênico dos ESTs públicos de cana-de-açúcar, como prova de conceito, numa análise comparativa com o proteoma predito de sorgo. Nossos resultados mostram uma cobertura em termos de ortólogos para apenas ~58% do proteoma predito de sorgo em contrates com estimativas anteriores, com métodos mais simples, que chegaram a 90% do proteoma hipotético de cana. Para abordar a dinâmica evolutiva de redes de regulação, realizamos medições, em escala genômica, das alterações nos níveis de mRNAs de plântulas de sorgo e arroz em resposta a tratamentos de curta duração (2hrs) com sinais exógenos de ABA (hormônio vegetal) e dos açúcares glicose e sacarose. Utilizamos dados públicos e experimentalmente comparáveis de Arabidopsis thaliana em resposta aos mesmos sinais para realizar comparações que revelassem respostas conservadas ou divergentes entre ortólogos. Além disso, buscamos entender a dinâmica evolutiva das respostas transcricionais num contexto de duplicação gênica em famílias multigênicas, onde há diversos genes potencialmente redundantes do ponto de vista bioquímico/estrutural. Nossa abordagem sugere que redes de regulação gênica em eucariotos complexos evoluem majoritariamente de forma neutra, pois parecem apresentar uma taxa de divergência constante, que independe da rede (disparada por cada um dos diferentes sinais) e das espécies envolvidas. Nossos dados são complementares e potencialmente confirmadores de modelos recentes de evolução não-adaptativa em redes de regulação gênica. Concluímos que a evolução da complexidade em sistemas biológicos está parcialmente ligada à diminuição da eficiência da seleção, causada majoritariamente por números populacionais efetivos restritivos presentes nas linhagens de eucariotos complexos (vertebrados e plantas terrestres) / Abstract: The availability of complete sequences of a growing number of genomes is transforming biology. More specifically, in the field of evolutionary biology, it became possible to address central questions on the ultimate mechanisms underlying genetic changes. It has a broad impact on biology and philosophy as well. This thesis deals with two important aspects of genome evolution: the process of gene duplication and fixation of duplicated genes, which is the basis of the origins of multigenic families, and the evolution of genetic regulatory networks that determines the causality of the cellular processes. Both aspects are related to the evolution of complexity regarding the gene content of living forms and the mechanistic interaction between the gene products (mainly RNAs and proteins). In the first aspect we studied the evolution of two biological mechanisms depending on the integrated function of proteins from distinct families. The mechanism of synthesis and remobilization of xyloglucan, a plant cell wall polysaccharide, and the calreticulin/calnexin cycle of protein folding that takes place in the endoplasmic reticulum. Our work showed that a primordial form of xyloglucan already existed before the land conquest by plants. We propose that the calreticulin/calnexin cycle is the product of subfuncionalization of an ancestral eukaryotic chaperone, and plants evolved specific calreticulin functions due to gene duplication. Our interest in the evolution of multigenic families impelled the development of Phylexpress, a method dedicated to large-scale orthology analyses. It can integrate expression data in the context of multigenic families with the goal of understand the evolutionary dynamics of gene expression. We used Phylexpress to revisit the gene content of the publicly available sugarcane ESTs as a proof of concept. Our results showed that the ESTs sampled orthologs for just ~58% of the predict sorghum proteome, in contrast with previous estimations acconting for 90% of the hypotethical sugarcane proteome. In order to approach the evolutionary dynamics of regulatory networks, we measured global changes in gene expression of sorghum and rice plantlets in response to short-term treatments (2hrs) with exogenous ABA (plant hormone) and the sugars glucose and sucrose. We took public data from comparable experiments using Arabidopsis thaliana in order to unravel conserved and divergent responses across orthologs. Furthermore, we analyzed the evolutionary change in transcriptional responses in a context of gene duplications in multigenic families, leading to a set of potentially redundant genes in terms of biochemical/structural properties. Our approach suggests that gene regulatory networks in complex eukaryotes evolve mainly neutrally, in a constant rate that is independent of the analyzed network (triggered by each one of the signals) and the species. Our data is complementary and potentially confirmatory of recent models of nonadaptive evolution in regulatory networks. We concluded that the evolution of the complexity in biological systems is partially connected to the attenuation of the efficiency, mainly due to low effective population sizes present in the lineages that gave rise to complex eukaryotes (vertebrates and land plants) / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T04:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franzin_FernandaMaria_D.pdf: 6490379 bytes, checksum: facd90d2115a20d8eccb498865503103 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) faz parte de um grupo de patógenos capazes de formar um tipo de lesão em células epiteliais denominada Attaching and Effacing (A/E). Os genes requeridos para a formação da lesão A/E estão localizados em uma ilha de patogenicidade denominada Locus of Enterocyte Effacement (LEE). A regulação da expressão dos genes de LEE é um processo complexo e envolve inúmeros fatores e vias regulatórias, incluindo o sistema de quorum sensing AI- 3/Epinefrina/Norepinefrina. O sensor histidina-quinase QseC é responsável por detectar AI-3 produzido por outras bactérias e epinefrina/norepinefrina produzidas pelo hospedeiro e iniciar uma cascata regulatória que induz a expressão de genes de virulência. Para avaliar o papel desse sistema na regulação de fatores de virulência de aEPEC, um mutante para o gene qseC foi gerado e analisado a nível transcricional e fenotípico quanto a sua motilidade, capacidade de secretar proteínas e induzir lesão A/E, na presença e/ou ausência do sinal epinefrina. Ensaios de qRT-PCR demonstraram níveis transcricionais diminuídos para LEE e para os genes flhD, fliC e nleA no mutante, sugerindo que QseC regula a expressão desses fatores de virulência. Ensaios de motilidade, proteínas secretadas e FAS evidenciaram que a motilidade, a secreção de proteínas e a formação da lesão A/E estavam diminuídas no mutante, comprovando a participação de QseC na regulação desses fenótipos em aEPEC. Os mesmos ensaios realizados na presença de epinefrina demonstraram que esse sinal tem papel importante na regulação dos genes de LEE de aEPEC e que essa regulação não ocorre exclusivamente via QseC, mas envolve outro receptor para esse hormônio. Epinefrina regula a expressão dos genes de LEE, porém, parece não ser um sinal importante na regulação da expressão de NleA e flagelo/motilidade. A análise do transcriptoma da linhagem mutante demonstrou que, além de ter uma importância central na regulação da virulência de aEPEC, QseC age também como um importante regulador global da expressão gênica nessa linhagem, regulando, direta ou indiretamente, a expressão de, aproximadamente, 1505 genes, entre eles genes relacionados ao metabolismo, transporte, quimiotaxia, captação de íons, resistência à stress, formação de biofilme, regulação transcricional, etc. Um modelo geral simplificado da regulação gênica da virulência de aEPEC através do sistema AI-3/Epi/NE e seu sensor QseC foi proposto. Esse trabalho descreve pela primeira vez a regulação do tipo quorum sensing na modulação da expressão da virulência em uma EPEC atípica / Abstract: Atypical enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is part of a group of pathogens capable of forming a characteristic lesion in epithelial cells called Attaching and Effacing (A/E). Genes required for A/E lesion formation are located on a pathogenicity island called Locus of Enterocyte Effacement (LEE). The regulation of LEE gene expression is a complex process and involves several factors and regulatory pathways, including the quorum sensing system AI-3/Epinephrine/Norepinephrine. The histidine kinase sensor QseC is responsible for detecting AI-3 produced by other bacteria and epinephrine/norepinephrine produced by the host, starting a regulatory cascade that induces the expression of virulence genes. In order to evaluate the influence of this system in the regulation of virulence factors of aEPEC, a qseC mutant has been generated, and transcriptional and phenotypical analyses were performed. Motility, ability to secrete proteins and induce A/E lesion, in the presence and/or absence of the epinephrine signal were analysed. qRT-PCR assays demonstrated reduced transcriptional levels of the LEE operons, and flhD, fliC and nleA genes in the mutant strain, suggesting that QseC regulates the expression of these virulence factors. Motility assays, secreted proteins and FAS have shown that motility, protein secretion and A/E lesion formation were decreased in the mutant, confirming the participation of QseC regulating these phenotypes in aEPEC. The same tests were performed in the presence of epinephrine, and demonstrated that this signal plays an important role in LEE gene regulation of aEPEC and this regulation does not occur exclusively via QseC, but involves other receptor for this hormone. Epinephrine regulates the expression of LEE genes, however, does not seem to be an important signal in the regulation of NleA and flagella/motility gene expression. Transcriptome analysis of the mutant strain has shown that, besides having a central role in the regulation of aEPEC virulence, QseC also acts as an important global regulator of gene expression in this strain, regulating, directly or indirectly, the expression of approximately 1505 genes, including genes related to metabolism, transport, chemotaxis, ion uptake, resistance to stress, biofilm formation, transcriptional regulation, and other. We proposed a simplified general model of virulence gene regulation of aEPEC through the AI-3/Epi/NE system and its sensor QseC. This is the first work describing the quorum sensing gene regulation modulating the virulence expression in atypical EPEC / Doutorado / Microbiologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Lucia Elvira Alvares / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T08:30:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mantovani_CarolinaStefano_M.pdf: 7530088 bytes, checksum: 5c8cf5e001032d6962337caaccfcbcd8 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A Miostatina (MSTN) é uma proteína que regula negativamente a formação de musculatura esquelética, e sua estrutura e função são conservadas em diversas espécies, incluindo humanos. O nocaute de seu gene causa hiperplasia e hipertrofia das fibras musculares, o que despertou grande interesse médico e agropecuário desde a descoberta deste gene. Trabalhos anteriores descrevem a função da proteína, mas ainda faltam dados sobre a regulação da sua expressão gênica. Recentemente, o promotor do gene da Mstn foi identificado e caracterizado pelo nosso grupo de pesquisa, a partir de uma abordagem filogenética. Entretanto, além do promotor, também existem outros elementos cis-reguladores que podem atuar como estimuladores ou silenciadores do processo de transcrição gênica. Em conjunto com o promotor gênico, esses elementos controlam a taxa de transcrição e conferem especificidade espacial e temporal para sua expressão. Sendo assim, a proposta deste trabalho foi identificar e caracterizar possíveis elementos cis-reguladores da Mstn a fim de ampliar o conhecimento sobre a sua regulação transcricional. Para tal, análises de genômica comparativa, semelhantes àquelas empregadas na identificação do promotor gênico da Mstn, foram realizadas para localizar regiões evolutivamente conservadas (ECRs) adjacentes ao lócus da Mstn de humano, camundongo e galinha, bem como para identificar potenciais sítios de ligação para fatores transcricionais conservados nessas regiões. Além disso, foi realizada uma análise da evolução desses possíveis elementos cis-reguladores, a fim de identificar polimorfismos que tenham o potencial de afetar a atividade transcricional da Mstn. Nossos resultados revelaram a existência de um arcabouço regulatório ancestral composto por sítios de ligação conservados em várias das ECRs analisadas, o qual tem sido mantido entre 310 e 430 milhões de anos. Além disto, foram identificados polimorfismos, bem como sítios de ligação grupo-específicos, os quais podem estar envolvidos na regulação diferencial da atividade da Mstn e, portanto, na geração de diferentes fenótipos musculares entre os animais. Dentre as oito ECRs estudadas, duas possuem maior potencial de estarem envolvidas na miogênese, uma vez que nelas foram identificados sítios de ligação para importantes fatores relacionados a este processo. Análises funcionais das ECRs 2 e 5/6 em células C2C12 em diferenciação confirmaram o potencial dessas ECRs de humano e camundongo de atuarem como elementos cis-reguladores, uma vez que mostraram que eles são capazes de modificar a expressão do gene repórter EGFP em comparação ao controle. As ECRs de galinha, por outro lado, não geraram resultados significativos, reforçando a hipótese de que as diferenças nos TFBS encontradas no grupo das aves geram alterações funcionais nas ECRs. O desenrolar de novos estudos a partir dos resultados obtidos neste trabalho permitirão estabelecer o papel específico das ECRs identificadas, bem como determinar a importância das variações de sequências destes elementos reguladores em diferentes animais. No longo prazo, nossas pesquisas poderão subsidiar o desenvolvimento de estratégias que possibilitem a modulação da atividade da Mstn em patologias humanas que afetam a musculatura esquelética / Abstract: The Myostatin protein (MSTN) is an important regulator of skeletal muscle deposition in vertebrates, and its structure and function are conserved in several species, including humans. The knockout of this gene causes hyperplasia and hypertrophy of muscle fibers, which has aroused great medical and agricultural interest since its discovery. Previous studies have described the function of this protein, but data on the regulation of Mstn gene expression are still scarce. Recently, the Mstn gene promoter has been identified and characterized by our research group from a phylogenetic approach. However, in addition to the promoter, there are also other cis-regulatory elements that can act as enhancers or silencers of gene transcription process. Along with the gene promoter, these elements control the transcription rate and provide spatial and temporal specificity for its expression. Thus, the purpose of this study was to identify and characterize potential Mstn cis-regulatory elements in order to increase knowledge of the transcriptional regulation of this gene. For this purpose, comparative genomic analysis similar to those employed in the identification of the Mstn promoter were performed to locate evolutionary conserved regions (ECRs) adjacent to the locus of the Mstn gene in human, mouse and chicken, as well as to identify potential transcription factors binding sites (TFBS) conserved in these regions. Furthermore, an evolutionary analysis of the putative cis-regulatory elements has been performed in order to identify polymorphisms that have the potential to affect the transcriptional activity of Mstn. Our results indicate the existence of an ancestral regulatory framework that comprises conserved TFBS in almost all of the ECRs analyzed, which has been maintained between 310 and 430 million years. Furthermore, polymorphisms were identified, as well as group-specific binding sites, which may be involved in the differential regulation of Mstn activity and, therefore, in the generation of different muscle phenotypes in animals. Among the eight ECRs studied, two of them have great potential to be involved in myogenesis, given that binding sites for important factors related to this processes were identified. Functional analyses of ECRs 2 and 5/6 in differentiating C2C12 cells confirmed the potential of the human and mouse ECRs as cis-regulatory elements, once they have shown that they are able to enhance the expression of the EGFP reporter gene, when compared to the control. The chicken ECRs, on the other hand, did not generate significant results, supporting the hypothesis that the differences found in the TFBS pattern in birds generate functional modifications in the ECRs. The development of new studies from the results obtained here may help to establish the specific role of the ECRs identified, as well as determine the importance of the variation in the sequence of these regulatory elements in different animals. In the long run, our research may lay the foundation to the development of strategies that allow the modulation of Mstn activity in human pathologies affecting skeletal muscle / Mestrado / Biologia Tecidual / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

O ferro (Fe) é um oligoelemento capaz de aceitar e doar elétrons. Tal propriedade o torna extremamente útil em diversos componentes importantes ao bom funcionamento do organismo e da célula. O Fe está associado a algumas proteínas, está presente em citocromos, em moléculas que se ligam ao oxigênio (hemoglobina e mioglobina) e em uma grande variedade de enzimas. O aumento e a diminuição da sua oferta levam a alterações na expressão de RNAs mensageiros e proteínas responsáveis pela sua própria homeostase. Sabe-se que a expressão de vários genes envolvidos no metabolismo do Fe é regulada pós-transcricionalmente, por meio de mecanismo que é desencadeado por sua ligação em regiões não traduzíveis presentes em mRNAs específicos, o que interfere no seu grau de poliadenilação, e por conseguinte, na estabilidade e na tradução do transcrito. A Mb é uma heme-proteína de 18,8 kDa, altamente expressa no tecido muscular esquelético e cardíaco, e que pertence a mesma família da hemoglobina. Sabendo-se que cerca de 15% do Fe existente no organismo está presente nos músculos, no presente trabalho avaliamos se a suplementação e restrição de Fe, a curto e longo prazo, alteram a expressão gênica da Mb no músculo oxidativo Soleus (S), glicolítico Extensor Digital Longo (EDL) e no cardíaco. Observamos que a restrição de Fe, a longo prazo, provocou um aumento na expressão gênica e protéica da Mb, apenas no músculo Soleus, sem alterar o grau de poliadenilação do transcrito, enquanto a suplementação não alterou os parâmetros avaliados em nenhum dos tecidos. A administração aguda de Fe não alterou a expressão gênica e protéica da Mb, nem o grau de poliadenilação do transcrito em nenhum dos tecidos estudados. Estes resultados sugerem que a regulação da expressão da Mb pelo Fe se dá apenas transcricionalmente, e de maneira tecido específica. / Iron is a trace element that can accept and donate electrons. This property makes iron extremely important to several components involved with the proper functioning of the organism and cells. Iron is associated with some proteins, is present in cytochromes, molecules that bind to oxygen (hemoglobin and myoglobin) and a variety of enzymes. The increase and decrease of its offer lead to changes in the expression of mRNAs and proteins responsible for their own homeostasis. It is known that the expression of several genes involved in the metabolism of iron is regulated post-transcriptionally through a mechanism that is triggered by its binding in non-translatable regions of specific mRNAs, which interferes with their polyadenylation, and as a consequence, with the stability and translation of the transcripts. Mb is a heme-protein with 18,8 kDa, highly expressed in skeletal and cardiac muscle, and it belongs to the same family of hemoglobin. About 15% of iron in the body is present in muscle tissue. Thus, this study aimed to investigate if long- and short-term Fe supplementation and restriction affect Mb gene expression in the oxidative Soleus (S), glycolitic Extensorum Digitalis Longus (EDL), and cardiac muscles. It was shown that long- term Fe restriction increased Mb mRNA and protein expression only in S muscle, without interfering in the transcript polyadenylation, whereas Fe supplementation did not alter any parameter evaluated in the three tissues. The short-term iron administration did not change the Mb mRNA, polyadenylation and protein expression in any of the tissues studied. The present results indicate that the regulation of Mb gene expression by iron occurs only at transcriptional level and in a tissue specific manner.

No final do século passado, avanços ocorridos no campo da Biologia Molecular levantaram questionamentos sobre como organismos complexos, com poucos genes a mais que organismos relativamente mais simples, regulariam seu desenvolvimento e funções celulares tão mais intrincadas. A descoberta dos RNAs não codificadores de proteínas e suas funções lançou nova luz ao entendimento da regulação da expressão gênica em organismos superiores. Apesar do conhecimento adquirido nos últimos anos, pouco ainda é sabido sobre a regulação destes RNAs. MicroRNAs, por outro lado, são uma espécie bem estudada de pequenos RNAs preditos como possíveis reguladores de mais de 60 % dos genes codificadores de proteínas no genoma humano, considerados importantes reguladores da expressão gênica em nível pós-transcricional. O presente projeto estudou a possível regulação do gene não codificador de proteínas TUG1, envolvido em proliferação celular e apoptose, por miRNAs e o papel desta regulação em processos tumorigênicos. Para isto foram utilizadas técnicas que superexpressaram e silenciaram miRNAs e técnicas de PCR quantitativo em tempo real para medir o nível de TUG1 nas amostras tratadas. Verificou-se a possibilidade de regulação do TUG1 por microRNAs em diferentes linhagens celulares sendo que, no entanto, esta regulação não parece ser importante em nível fisiológico / At the end of the last century, advances occurred in the Molecular Biology field raised questions about how complexes organisms, with few more genes than relatively simpler organisms, regulate it so intricate development and cellular functions. The discovery of long non-protein coding RNAs and it functions gave light to the understanding of gene expression regulation in superior organisms. Despite the knowledge acquired in the last years, few is yet known about the regulation of these RNAs. MicroRNAs, other way, are a well-studied tiny RNAs specie. They are predicted as possible regulators of more than 60 % of protein-coding genes in the human genome and considered important regulators of gene expression regulation at post-transcriptional level. This project studied the possible regulation of the non protein-coding gene TUG1, involved in cell proliferation and apoptosis, by microRNAs and the role of this regulation in tumorigenic processes. In order to do this we used techniques that superexpressed and silenced miRNAs and techniques of real time quantitative PCR to measure the TUG1 levels in the treated samples. We find the possibility of regulation of TUG1 by microRNAs in different cell lineages but this regulation does not seems to be important in a physiologic context.

INTRODUÇÃO: O aracnídeo Phoneutria nigriventer, também conhecido por aranha-armadeira, possui um veneno complexo, contendo vários peptídeos que ativam canais iônicos nas células. Dentre estes, só dois neuropeptídeos, Tx2-5 e Tx2-6, destacam-se por relaxar o músculo liso trabecular do corpo cavernoso, induzindo ereção peniana em camundongos e ratos. Este efeito tem sido associado à produção de oxido nítrico pela ativação de óxido nítrico sintases. No entanto, faltam estudos mais amplos para determinar o papel de Tx2-6 na indução da ereção. OBJETIVOS: Identificar os genes diferencialmente expressos no tecido erétil de camundongos após indução da ereção pela Tx2-6 utilizando microarranjos de oligonucleotídeos. Validação dos resultados obtidos nos microarranjos por PCR quantitativa e imuno-histoquímica. MATERIAIS E MÉTODOS: Camundongos machos e adultos da linhagem Swiss foram divididos em dois grupos: controle (n=10), inoculados pela via intracavernosa com 20 l de solução salina; e tratado (n=10), os quais receberam 0,006gg/animal do peptídeo Tx2-6 diluído em 20 l de salina pela via intracavernosa. Uma hora após o início da ereção no grupo tratado todos os animais foram sacrificados e retirou-se o pênis. Este último foi dividido em dois fragmentos, uma parte do material foi congelada em nitrogênio líquido e mantida a 80°C até a extração do RNA para os experimentos de microarranjos e PCR quantitativa; outra parte foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica. RESULTADOS: No grupo tratado a ereção foi observada 30-45 minutos após aplicação de Tx2-6 e mantida durante 120 minutos. Os camundongos de grupo controle não apresentaram nenhum indício de ereção. Nos experimentos de microarranjos, onde foram analisados 34.000 genes representando o genoma total do camundongo, identificou-se 3.803 (12,3%) genes com expressão diferencial de pelo menos ±1,5 vez entre os grupos (1.823 genes superexpressos e 1.980 genes subexpressos no grupo tratado comparado ao controle). Os genes ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr foram selecionados para validação dos microarranjos por PCR quantitativa e confirmaram a superexpressão em relação aos controles. As proteínas Fn1, Sstr2 e Pdgfr resultaram aumentadas no grupo tratado após avaliação imuno-histoquímica. CONCLUSÕES: A inoculação de Tx2-6 pela via intracavernosa alterou o perfil de expressão gênica no tecido erétil de camundongos. O número de genes superexpressos foi similar ao de genes subexpressos. Serão necessários outros estudos para entender melhor as vias moleculares que Tx2-6 afeta na indução da ereção peniana. / INTRODUCTION: The Phoneutria nigriventer arachnid, also known as armed-spider, has a complex venom, composed by several peptides that affect cellular ionic channels. Among these, only two neuropeptides, Tx2-5 and Tx2-6 induce penile erection in mice and rats and this effect has been associated with the production of nitric oxide by the activation of nitric oxide synthases. Moreover, there is a scarcity of studies focusing on the role of Tx2-6 in the induction of erection. OBJECTIVES: To identify the differently expressed genes in the erectile tissue of mice after erection induction by Tx2-6 using oligonucleotide microarrays. To validate microarray results by quantitative PCR and immunohistochemistry. MATERIALS AND METHODS: Swiss adult male mice were divided in two groups: control (n=10) were injected intracavernously with 20 gl of saline solution; and treated (n=10) were injected intracavernously with 0.006gg/mouse of the Tx2-6 peptide diluted in 20 gl of saline solution. After checking the penile erection in the treated group, all mice were sacrificed one hour after the beginning of erection for the removal of the penis. Penile organ was divided into two fragments, one piece was immediately frozen in liquid-nitrogen and stored at -80°C until RNA extraction to make the microarray and quantitative PCR experiments; the other was reserved for immunohistochemistry analysis. RESULTS: In the treated group, erection was noticed 30-45 minutes after Tx2-6 inoculation and lasted for 120 minutes. Control mice did not present any sign of erection. Considering as differentially expressed genes with a ±1.5 fold expression difference, of the 34,000 genes on the microarray we identified 3,803 (12.3%) genes differentially expressed between the groups (1,823 genes up-regulated and 1,980 genes down-regulated in the treated group compared to controls). The ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr genes were selected for validation of microarray results by using quantitative PCR and confirmed the up-regulation when compared to controls. After immunohistochemistry analysis the Fn1, Sstr2 and Pdgfr proteins were found increased in the treated group. CONCLUSIONS: The intracavernous inoculation of Tx2-6 modified the gene expression profile of erectile tissue of mice. The number of upregulated and down-regulated genes was similar. Further studies are needed to understand the molecular pathways that Tx2-6 affect to induce penile erection.

Em bactérias, os fatores sigma alternativos permitem a rápida adaptação da célula a alterações no ambiente. Dentre estes, os fatores sigma ECF (função extra-itoplasmática) caracterizam-se pelo envolvimento na resposta a sinais da região extra-citoplasmática da célula. O sequenciamento do genoma de Caulobacter crescentus indicou a presença de 13 ORFs codificando fatores ECF. Este trabalho descreve a caracterização de cepas mutantes em cinco genes que codificam fatores sigma ECF de C. crescentus, sendo eles sigL, sigM, sigN, sigU e sigF. A regulação da expressão destes genes em respostas a diferentes estresses foi também analisada, pelo uso de fusões de transcrição de suas regiões promotoras ao gene reporter lacZ. Todos os mutantes mostraram-se viáveis, sendo também tão resistentes quanto a cepa parental a uma série de estresses ambientais testados, indicando que estes genes não são essenciais. Verificou-se, porém, que os mutantes nos genes sigL e sigM são mais sensíveis ao choque térmico extremo (48°C). A caracterização da cepa mutante em sigF mostrou que este gene é essencial para a resistência da célula a estresse oxidativo durante a fase estacionária. A análise da expressão de sigF indicou um controle pós-transcricional, com o acúmulo da proteína SigF durante esta fase do crescimento, sem um aumento na transcrição do gene. Oito genes regulados por &#963;F durante a fase estacionária foram identificados em experimentos de \"microarray\", incluindo os genes de resposta a estresse oxidativo, sodA e msrA. A análise da atividade do promotor de sigU mostrou sua indução na entrada na fase estacionária e após estresse salino e osmótico. No entanto, o mutante nulo em sigU não se apresentou mais sensível que a cepa parental a esses estresses. Os resultados aqui descritos permitiram identificar a importância de alguns dos fatores ECF de C. crescentus na resposta a estresses nesta bactéria. / Alternative sigma factors permit the rapid adaptation to environmental changes in bacteria. Among them, members of the ECF subfamily (extrac</i<ytoplasmic function) are characterized by their involvement in responses to changes in the extracytoplasmic compartment of the cell. Analysis of the complete genome sequence of Caulobacter crescentus has led to the identification of 13 ORFs encoding putative sigma factors of the ECF subclass. The present work describes the characterization of mutant strains in five genes encoding ECF sigma factors from C. crescentus, named sigL, sigM, sigN, sigU and sigF. The expression of these genes in response to distinct stress conditions was also investigated, using transcriptional fusions of their promoter regions to the lacZ reporter gene. The five mutants strains obtained were viable and did not show increased sensitivity, when compared to the parental strain, to a series of environmental stress conditions, indicating that these genes are not essential. However, the sigL and sigM mutant strains were shown to be more sensitive to extreme heat shock (48°C). Furthermore, the characterization of the sigF mutant strain demonstrated that this gene is essential for oxidative stress survival during stationary phase. Analysis of sigF expression indicated a post-transcriptional control, with an increase in the levels of SigF protein during this growth phase, without changes in the transcription rate of the gene. Eight genes regulated by &#963;F during stationary phase were identified in microarray experiments, including the oxidative stress response genes sodA and msrA. Analysis of sigU promoter activity in response to distinct stress conditions showed induction upon entry into stationary phase and during saline and osmotic stress. Nevertheless, the sigU null mutant did not show increased sensitivity to these stresses. The results described here identified the importance of some of the C. crescentus ECF sigma factors in the response to stresses in this bacterium.

P. aeruginosa PA14 é uma linhagem isolada de queimadura que apresenta vários fatores de patogenicidade comuns no quadro de infecção de hospedeiros filogeneticamente distintos (plantas, mamíferos ou invertebrados). O gene kerV foi revelado numa busca por mutantes atenuados em virulência em uma biblioteca de mutantes por transposons da linhagem PA14 (Rahme et al., 1997). A caracterização da linhagem D12, mutante em kerV, confirmou sua virulência atenuada (Apidianakis et al., 2005 e An et al., 2009) e resultados do transcriptoma mostraram alteração na expressão de mais de 500 genes, sendo alguns relacionados com o sistema de \"quorum sensing\" (Rahme et al, dados não publicados). O gene kerV está próximo à montante ao gene gloB, envolvido em detoxificação de metilglioxal, e à jusante aos genes rnhA e dnaQ, que codificam proteínas envolvidas na replicação e reparo do DNA. Este trabalho teve como objetivo estudar a função molecular do produto de kerV e a expressão dos genes do lócus kerV-rnhA-dnaQ. Análises de bioinformática indicam que a proteína KerV é uma metiltransferase dependente de S-adenosil-metionina (SAM), apresentando um domínio conservado de ligação a SAM e uma arquitetura de domínio compatível com a organização em fitas-beta e hélices-alfa alternadas descritas para a família das metiltransferases dependentes de SAM. Ela não apresenta outros domínios conservados que indiquem seu substrato de metilação. A expressão heteróloga desta proteína em E. coli, mostrou que ela é expressa de maneira parcialmente solúvel quando co-expressa com as chaperoninas GroEL/GroES em baixas temperaturas ou quando fusionada a MBP ou GST. A purificação desta proteína mostra que ela é co-eluída com a chaperonina GroEL sugerindo que para atingir sua conformação nativa ela necessita dessas proteínas acessórias. MBP-KerV purificado foi usado para ensaios \"in vitro\" de atividade de metiltransferase e ligação a SAM, que não foram conclusivos, pois não há certeza do seu correto estado de enovelamento. Ensaios de duplo-híbrido mostraram que KerV não interage com os produtos de rnhA e dnaQ, sugerindo que KerV não está diretamente relacionado com suas funções. A freqüência de mutação na linhagem D12 está levemente aumentada (aproximadamente quatro vezes), o que sugere que KerV não está diretamente envolvida no reparo de DNA do tipo ´mismatch repair`. Os ensaios usados para detectar metilação do DNA, proteínas e rRNAs não revelaram que KerV estaria envolvido com a metilação destes substratos. Os inícios de transcrição dos genes kerV, rnhA e dnaQ foram determinados. A deleção de kerV causa um efeito polar na transcrição do gene rnhA, que não se reflete nos níveis da proteína. A deleção também afeta a expressão de dnaQ, sugerindo que KerV seja importante para sua regulação. Os ensaios de complementação da virulência em modelos invertebrados e de células epiteliais de pulmão mostram que apenas a presença dos três genes e seus produtos em níveis normais são capazes de reverter a maioria dos fenótipos atenuados. KerV se mostrou essencial para a inibição da translocação de NF-kB para o núcleo das células, comprovando que esta proteína é relevante para a virulência de PA14, contribuindo com o silenciamento da resposta imune do hospedeiro. O conjunto dos resultados indicam uma complexa inter-relação entre a expressão dos genes kerV, rnhA e dnaQ e seu papel na biologia de P. aeruginosa. / P. aeruginosa PA14 is a burn isolate multi-host pathogen strain. The screening for virulence attenuated mutants in a PA14 transposon mutant library revealed the kerV gene (Rahme et al., 1997). The characterization of D12 strain, a kerV mutant, confirmed the attenuated virulence phenotype (Apidianakis et al., 2005 and An et al., 2009) and transcriptome analysis showed the expression of more than 500 genes are affected in D12, some of these genes are related with quorum sensing (Rahme et al, unpublished data). kerV is upstream of the gloB gene, related with methylglioxal detoxification and downstream of the rnhA and dnaQ genes, both related with DNA replication and repair. The purpose of this work was to study the molecular function of KerV product and the expression of kerV-rnhA-dnaQ locus. Bioinformatics analysis indicated that KerV is a SAM dependent methyltransferase that have a conserved SAM binding domain with architecture compatible with classic alternating &#946;-stranded and &#945;-helical regions. KerV does not show any other conserved motif that could indicate its methylation substrate. Heterologous expression in E. coli showed that KerV is partially soluble only when co-expressed with GroeL/GroES chaperones at low temperatures or when KerV is in fusion with MBP or GST tag. During the purification process KerV was copurified with GroEL chaperone suggesting that this association may be required for the correct folding of KerV. Methyltransferase activity and SAM binding assays were done with purified MBPKerV and the results were not conclusive since the proper conformation of MBP-KerV cannot be verified. Yeast two-hybrid assays indicated that RNaseH and DnaQ are not interaction partners of KerV, suggesting that their functions are not directly related. The mutation frequency of D12 strain increased only about four times in relation to PA14, suggesting that KerV is not directly involved with DNA mismatch repair. The assays to detect methylation in DNA, RNAs and proteins do not show that KerV is involved with methylation of these substrates. The transcription start sites of kerV, rnhA and dnaQ genes were mapped through 5\'-RACE- and primer extension experiments. The kerV deletion causes a polar effect on the transcription of rnhA gene, which is not reflected on RNaseH protein levels. The kerV deletion also affects dnaQ expression, suggesting that KerV is important for its regulation.The virulence complementation assays in flies and lung epithelial cells showed that the fully rescue of the wild type phenotype was achieved only when the entire locus is present. KerV was essential to inhibit the NF-kB nucleus translocation, demonstrating that KerV is relevant to PA14 virulence, contributing for the silencing of host immune system. Altogether, these data showed a complex inter-relation among kerV, rnhA and dnaQ genes and its role in P. aeruginosa biology

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-14T16:15:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3336095 bytes, checksum: 95e091fc2de36640318c4cb1a88e5114 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T16:15:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3336095 bytes, checksum: 95e091fc2de36640318c4cb1a88e5114 (MD5) Previous issue date: 2012-08-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A utilização de métodos de melhoramento genético pode levar à obtenção de genótipos de soja com características de interesse econômico e composição ideal de ácidos graxos na fração óleo. Para isso, é necessário o maior entendimento dos mecanismos que levam à alteração do conteúdo de ácidos graxos frente a diferentes condições de cultivo e a avaliação das substituições dos alelos dos genes que controlam essas características. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da temperatura no conteúdo de óleo, composição de ácidos graxos e expressão gênica das ω-6 e ω-3 dessaturases em genótipos contrastantes para o conteúdo de ácido oléico e linolênico e avaliar o efeito da substituição alélica das ω-3-dessaturases de ácidos graxos insaturados em soja, com base em marcadores SNPs. Para os experimentos do efeito da temperatura na via de biossíntese de ácidos graxos, foram utilizados os genótipos: CD219, variedade comercial com concentrações normais de ácido oléico (~19%) e ácido linolênico (~8%); A29, com baixa concentração de ácido linolênico (~1%) e FA22, com elevada concentração de ácido oléico (~50%). O experimento foi conduzido em duas casas de vegetação: i) com aquecimento, que permitiu a obtenção de temperaturas médias (máxima e mínima) de 32/27°C; ii) sem aquecimento, que permitiu a obtenção de temperaturas médias de 26/14°C. As sementes em desenvolvimento foram subdivididas em dez estádios de acordo com o seu peso úmido, tendo o valor de incremento entre estádios de 50 mg. O conteúdo de óleo foi determinado no extrator soxhlet e composição de ácidos graxos por cromatografia gasosa. Os possíveis genes das dessaturases foram identificados no banco de dados Phytozome e a partir dessas sequências foram desenhados primers para experimentos de expressão gênica nas sementes dos 5° e 8° estádios de desenvolvimento. Não foi observado efeito significativo da temperatura de cultivo no teor de óleo bruto em sementes maduras dos genótipos CD219, A29 e FA22. Os perfis do acúmulo de ácidos graxos insaturados durante a ontogenia das sementes variaram em função do genótipo. FA22 apresentou maior conteúdo de ácido oléico e menor conteúdo de ácido linolênico em sementes cultivadas em alta temperatura em todos os estádios de desenvolvimento. Enquanto que em CD219 esse efeito foi observado apenas nos estádios finais. Quinze genes foram identificados como potenciais constituintes da família das dessaturases: 8 referentes às ω-6-dessaturases e 7 referentes às ω-3-dessaturases. Dentre os genes das ω-6- dessaturases Glyma10g42470 e Glyma20g24530 apresentaram maior expressão relativa em sementes de soja em desenvolvimento. Dentre os genes das ω-3-dessaturases genes Glyma02g39230; Glyma14g37350 e Glyma18g06950 apresentaram os maiores valores de expressão relativa em sementes de soja em desenvolvimento. Contrariamente ao esperado, os genes das ω-6-dessaturases Glyma10g42470, Glyma15g23200 e Glyma20g24530 apresentaram maior acúmulo de transcritos na maior temperatura (32/27°C) de cultivo. O gene da ω-3-dessaturases Glyma18g06950 apresentou perfil de expressão compatível com as alterações no conteúdo de ácido linoléico/linolênico nos genótipos FA22 e CD219 em função da temperatura em sementes em desenvolvimento. Para o experimento de avaliação do efeito da substituição alélica das ω-3-dessaturases de ácidos graxos insaturados em soja com base em marcadores SNPs, foram genotipadas 185 progênies F2 derivadas do cruzamento entre A29 (mutante para três genes FAD3, 1% de 18:3∆3,6,9) e Tucunaré (genótipo normal, 11% de 18:3∆3,6,9). Os resultados demonstram que os marcadores moleculares para os genes FAD3A, FAD3B e FAD3C foram eficientes no monitoramento do conteúdo de ácido linolênico nas populações segregantes F2 e F2:3. Além disso, as substituições dos alelos no loco FAD3A proporcionam maiores variações no conteúdo de ácido linolênico que as substituições nos outros dois locos. A partir desses dados, espera-se que seja possível introduzir os alelos recessivos dos genes FAD3A, FAD3B e FAD3C da linhagem A29 em genótipos elites do Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja (PMQS) do BIOAGRO/UFV e desenvolver linhagens de soja especiais para a agroindústria apresentando baixos teores do ácido linolênico. / The use of genetic breeding may lead to the development of soybean genotypes with traits of economic interest and improved composition of fatty acids in the oil fraction. To achieve this goal, a better understanding of the mechanisms that lead to changes in fatty acid contents under different growing conditions and evaluation of allelic substitutions of genes that control these traits are needed. In this context, the aim of this study was to evaluate the effect of temperature on oil content, fatty acid composition and gene expression of ω-6 and ω-3 desaturases in genotypes contrasting for oleic and linolenic acid contents. In addition, the effect of allelic substitutions of fatty acid ω-3-desaturases genes was also evaluated. For the experiments on the effect of temperature on fatty acid biosynthesis the following genotypes were used: CD219, commercial variety with normal concentrations of oleic acid (~ 19%) and linolenic acid (~ 8%); A29, with low concentration of linolenic acid (~ 1%) and FA22, with a high concentration of oleic acid (~ 50%). The experiment was conducted in two greenhouses: one with heating, with average temperatures (maximum and minimum) of 32/27 °C, and the other with no heating, with average temperatures of 26/14 °C. The developing seeds were divided into ten stages according to the fresh weight, and the increment value between stages of 50 mg. The oil content was determined by soxhlet extractor and the fatty acid composition by gas chromatography. Possible desaturase genes were identified in the Phytozome database and from these sequences primers were designed for gene expression experiments. There was no significant effect of temperature on oil content in mature seeds of genotypes CD219, A29 and FA22. The accumulation profiles of the unsaturated fatty acids during seed ontogeny varied according the genotype. FA22 showed higher oleic and low linolenic acid contents in plants grown under high temperature at all stages of development. While in CD219 this effect was observed only in the later stages. Fifteen genes were identified as potential components of the desaturase family: 8 for ω-6-desaturases and 7 for ω-3 desaturases. Among the ω-6- desaturase genes, Glyma10g42470 and Glyma20g24530 showed higher relative expression in developing soybean seeds. Among the genes of ω-3-desaturase genes, Glyma02g39230, Glyma14g37350 and Glyma18g06950 showed higher relative expression during seed development. Contrary to expectation, ω-6-desaturases genes Glyma10g42470, Glyma15g23200 and Glyma20g24530 showed higher accumulation of transcripts under higher temperatures (32/27 °C). The ω-3-desaturase gene Glyma18g06950 showed expression profile compatible with the changes in the linoleic/ linolenic acid contents of genotypes FA22 and CD219 as a function of temperature during seed development. To evaluate the effect of allelic substitution of ω-3 desaturases genes SNP markers were genotyped in 185 F2 and F2:3 progenies derived from a cross between A29 (mutant for the three FAD3 genes, 1% 18:3∆3,6,9) and Tucunaré (normal genotype, 11% 18:3∆3,6,9). The results demonstrate that the molecular markers for genes FAD3A, FAD3B and FAD3C were efficient in monitoring the linolenic acid content in segregating populations F2 and F2:3. In addition, substitutions at the FAD3A locus provided greater variations in the linolenic acid content than substitutions in the other two loci. From these data, it is expected that it is possible to introduce the recessive alleles of genes FAD3A, FAD3B and FAD3C of A29 in elite genotypes of the Breeding Program for Soybean Quality of BIOAGRO/UFV and to develop special soybean lines for the agroindustry with low linolenic acid content.