La trans-différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) vers un phénotype migratoire, prolifératif et sécrétoire joue un rôle clé dans la progression des lésions athéromateuses et l’hyperplasie intimale qui sous-tend la resténose post-angioplastie. Nos travaux suggèrent que la transition phénotypique des CMLV implique, chez le rat, la souris et l’Homme, l’expression de novo de l’Adénylyl Cyclase 8 (AC8), une enzyme catalysant la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) (Clément et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; résultats non publiés). Ce travail de thèse avait pour objectif d’appréhender le rôle de l’AC8 dans la trans-différenciation des CMLV en évaluant son impact sur la signalisation AMPc. L’étude des dynamiques de production du second messager avec le biosenseur T-Epac-VV montre que l’AC8 inhibe les hausses d’AMPc dans les CMLV trans-différenciées à l’Interleukine-1β. Cette fonction non canonique est assurée par de nouvelles isoformes d’AC8 que nous avons identifiées et clonées, les AC8E1 à 4, qui partagent une délétion des cinq premiers domaines transmembranaires. Des dosages de l’accumulation d’AMPc couplés à des expériences de co-immunoprécipitation et d’immunocytochimie révèlent que les AC8E exprimées de façon hétérologue dans des cellules HEK s’hétéro-dimérisent avec les AC en transit dans le réticulum, suppriment leur activité enzymatique et préviennent leur adressage à la membrane plasmique. L’induction des AC8E dans les CMLV trans-différenciées pourrait prévenir les effets vasculoprotecteurs de l’AMPc (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010), favorisant ainsi l’acquisition et/ou le maintien du phénotype synthétique. / The phenotypic switch of vascular smooth muscle cells (VSMC) towards a migratory, proliferative and secretory state plays a key role in atherosclerotic plaque expansion and intimal hyperplasia leading to post-angioplasty restenosis. Our previous results suggest that the trans-differentiation of rat, mouse and human VSMC involves the de novo expression of the Adenylyl Cyclase 8 (AC8), an enzyme that catalyzes the synthesis of cyclic AMP (cAMP) (Clement et al., 2006; Gueguen et al., 2010; Keuylian et al., 2012; unpublished results). The main goal of my PhD was to decipher the impact of AC8 expression on cAMP signaling in trans-differentiated VSMC. Using the FRET-based biosensor T-Epac-VV, we showed that the de novo expression of AC8 limits increases in cellular cAMP. This non-canonical function relies on a new family of AC8 isoforms that we have identified and cloned: the AC8E1 to 4. They share a common deletion of the first five transmembrane domains. The biochemical characterization of AC8E over-expressed in HEK cells allowed us to elucidate their functioning. cAMP accumulation assays, co-immunoprecipitation experiments and immunocytochemistry revealed that AC8E hetero-dimerize with functional AC during their maturation in the reticulum, suppress their enzymatic activity and prevent their traffic to the plasma membrane. Numerous studies have shown that increases in cAMP concentration within trans-differentiated VSMC antagonize pathological vascular remodeling (Douglas et al., 2005; Katakami et al., 2010). Thus, the induction of AC8E in trans-differentiated VSMC could prevent the vasculoprotective effects of cAMP and promote the acquisition of a synthetic phenotype.

Rationnel : L’artérite à cellules géantes (ACG) est une vascularite primitive des gros vaisseaux dont le diagnostic repose sur la mise en évidence d’un infiltrat inflammatoire et de cellules géantes à la biopsie d’artère temporale (BAT). On note également un remodelage de la paroi vasculaire lié à une prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) pouvant aboutir à une occlusion artérielle. Objectif : Caractériser les auto-anticorps dirigés contre les cellules endothéliales (CE) et les CMLV au cours de l’ACG et préciser le rôle des CMLV dans le remodelage pariétal. Méthodes : La recherche d’auto-anticorps a reposé sur un immunoblot 2D couplé à la spectrométrie de masse. Les protéomes des CMLV d’artère ombilicale, d’artère pulmonaire et d’aorte humaines normales a été comparés par protéomique différentielle (2D-DIGE). Nous avons utilisé la 2D-DIGE et des puces d’expression pan-génomiques pour comparer les CMLV issues de BAT de patients suspects d’ACG (avec un diagnostic final d’ACG ou non), afin d’identifier les mécanismes contribuant à la prolifération des CMLV. Résultats : Chez 15 patients atteints d’ACG, nous avons notamment identifié la lamine, la vinculine et l’annexine A5 comme cible des auto-anticorps anti-CMLV. Les antigènes cibles identifiés sont liés à Grb2, une protéine adaptatrice impliquée dans la prolifération des CMLV. Nous avons mis en évidence des protéomes différents au sein des CMLV humaines normales selon leur origine vasculaire et avons principalement identifié des protéines du cytosquelette et du métabolisme énergétique.A partir des CMLV isolées des BAT et à l’aide d’Ingenuity®, nous avons identifié l’endothéline 1 (ET-1) et la paxilline comme des molécules impliquées dans le remodelage vasculaire. En immunohistochimie et par qPCR, nous avons confirmé l’expression de l’ET-1 et de ses récepteurs ETAR et ETBR au sein des artères temporales de patients atteints d’ACG. Enfin, nous avons inhibé la prolifération des CMLV avec du macitentan, un inhibiteur d’ETAR et en particulier avec son métabolite actif, mais pas avec d’autres inhibiteurs des récepteurs de l’ET-1. Conclusion : Nous avons identifié chez les patients atteints d’ACG des anticorps anti-CMLV dont le rôle pathogéne potentiel reste à définir. Les différences protéiques observées à partir des CMLV humaines normales pourraient correspondre à des phénotypes différents. A partir d’un matériel biologique unique, nous avons pu montrer que la prolifération excessive des CMLV au cours de l’ACG pouvait être inhibée par le macitentan ce qui permet d’envisager un usage thérapeutique de cette molécule. / Background : Giant cell arteritis (GCA) is a large vessel vasculitis and its diagnosis usually relies on the identification of an inflammatory infiltrate made of mononuclear cells and giant cells upon temporal artery biopsy. There is also a remodeling process in the arterial wall due to an excessive proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) which can sometimes lead to arterial occlusion. Purpose: Identify auto-antibodies targeting either endothelial cells (EC) and/or VSMC during GCA and better understand the role of VSMC in the remodeling process. Methods : Auto-antibodies were detected by a 2-dimensionnal immunoblot and their target antigens were identified by mass spectrometry. Proteoms of umbilical artery, pulmonary artery and aorta VSMC were compared by 2 dimension differential in gel electrophoresis (2D-DIGE). In order to identify mechanisms involved in VSMC proliferation in GCA, we used both 2D-DIGE and pan genomic chips in order to compare VSMC isolated at the time of temporal artery biopsy (TAB) from patients with a final diagnosis of GCA or another diagnosis. Results : In 15 patients with GCA, we identified lamin, vinculin and Annexin A5 as target antigens of anti-VSMC antibodies. Target antigens were linked with Grb2, an adaptator protein involved in VSMC proliferation. Normal VSMC originating from different vascular beds have differ in protein contents with differential expression of cytoskeleton and energy metabolism proteins. We compared VSMC from TAB with Ingenuity software and identified endothelin-1 (ET-1) and paxillin as proteins involved in vessel remodeling. We confirmed by immunohistichemistry and qPCR that ET-1 and its receptor ETAR and ETBR were expressed in temporal arteries from patients with GCA. Last, we reduced VSMC proliferation with Macitentan, an ETAR and ETBR antagonist and significantly inhibited VSMC proliferation with its active metabolite whereas other ET-1 inhibitors had no effect. Conclusion : We identified anti-VSMC auto-antibodies in patients with GCA. Their pathogenic role remains to be determined. Normal VSMC from different vascular locations differ in protein conten which might reflect different phenotypes and different properties. The escessive proliferation of VSMC from patients with GCA was inhibited by Macitentan. This drug might constitute a future therapeutic option.

L’AMPc est un second messager exerçant un rôle vasculoprotecteur majeur, par ses effets relaxants et inhibiteurs de la prolifération et de la migration cellulaires. Les concentrations intracellulaires d’AMPc sont finement régulées par leur synthèse via les adénylates cyclases et leur dégradation par les phosphodiestérases (PDEs). Nous avons évalué l’impact de l’environnement cellulaire sur la voie de signalisation couplée au récepteur β-adrénergique (β-AR/AMPc/PDE) dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs), ainsi que les altérations potentielles de celle-ci en situation pathologique d’insuffisance cardiaque (IC).Notre première étude montre que dans les CMLs d’aorte de rat en culture, adoptant un phénotype synthétique, la voie de signalisation β-AR/AMPc/PDE est hautement modulée par la densité cellulaire Ainsi, une faible densité cellulaire est associée à une régulation négative de l’expression fonctionnelle du récepteur β1-AR, à une activité hydrolytique des PDEs-AMPc plus faible et à des concentrations d’AMPc intracellulaire plus élevées que celles observées dans des cellules confluentes.Notre deuxième étude montre que dans l’aorte de rat, l’IC est associée à une dysfonction endothéliale (DE), une hyperréactivité aux agents contractants et une altération de la fonction et de l’expression des PDEs-AMPc. Nos résultats suggèrent que l’altération de la voie du NO/GMPc suite à la DE conduit à une hyper-activation de la PDE3, qui masque la fonction de la PDE4 et altère la relaxation β-AR.L’ensemble de ce travail met en évidence le rôle critique de l'environnement cellulaire dans le contrôle de la voie β-AR/AMPc/PDE des CMLVsMots clés : Muscle lisse vasculaire, récepteur β-adrénergique, AMPc, phosphodiestérases, densité cellulaire, insuffisance cardiaque / CAMP is second messenger which plays a prominent vasculoprotective role by its relaxing effects and inhibition of cell proliferation and migration. Intracellular cAMP level is regulated by its synthesis by adenylate cyclase and its degradation by phosphodiesterases (PDEs). We evaluated the influence of cellular environment on signaling pathway coupled to β-adrenoceptors (β-AR/cAMP/PDE) on vascular smooth muscle cells (VSMCs), as well as potential alterations in heart failure (HF).The first study showed that in cultured rat aortic SMCs exhibiting synthetic phenotype, the β-AR/cAMP/PDE signaling pathway is highly modulated by the cellular density.Thus, the low density state being associated to a downregulation of the β1-AR, a lower cAMP-PDE activity and a higher basal [cAMP]i compared to confluent cells.Our second study showed that in rat aorta, HF is associated with endothelial dysfunction, hyper-reactivity to contractile agents and an alteration of function and expression of cAMP-PDEs. Our results suggest that NO/cGMP pathway alteration following the ED in HF leads to hyper-activation of PDE3 which masks PDE4 function and alters β-adrenoceptor relaxationThus, our works highlights the critical role of the cellular environment in controlling the vascular β-AR signaling.Keywords: Vascular smooth muscle, β-adrenoceptor, cAMP, phosphodiesterases, cellular density, heart failure.

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L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie orpheline, progressive, incurable, caractérisée par un remodelage intense de la paroi des artérioles pulmonaires résistives conduisant à l’augmentation des résistances vasculaires pulmonaires. Des anomalies génétiques associées à des mutations du gène codant pour le récepteur de type 2 de morphogenèse osseuse (BMPR2) ont été mises en évidence chez près de 70% des formes héréditaires d’HTAP. Dans le présent travail et ce à l’aide de cultures cellulaires primaires réalisées à partir de biopsies pulmonaires collectées chez des patients souffrant d’HTAP idiopathique et des sujets contrôles, nous nous sommes intéressés aux mécanismes responsables de l’hyperplasie des cellules musculaires lisses présente dans l’HTAP, plus particulièrement à l’implication de la voie angiopoîétine (Ang)/Tie2 dans la communication intercellulaire existant entre cellules endothéliales (CE) et cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires (CML-AP), ainsi qu’à la voie des BMP/BMPR2 chez des patients HTAP porteurs de mutations BMPR2. <p>Contrairement aux expressions inchangées des Ang1 et Ang2, l’expression du récepteur endothélial Tie2 est augmentée tant au niveau pulmonaire que cellulaire dans l’HTAP. Les CML-AP isolées à partir de patients souffrant d’HTAP présentent in vitro un phénotype prolifératif accru et ce d’autant plus en présence de surnageants de culture collectés à partir de CE pulmonaires (CE-P). Cet effet prolifératif est d’autant plus intense que les CE-P proviennent de patients HTAP et qu’elles ont été préalablement stimulées par l’Ang1. La fluoxétine, un inhibiteur du transporteur de la sérotonine (5-HT) inhibe ces effets prolifératifs, alors que le bosentan, un antagoniste non sélectif des récepteurs A et B à l’endothéline (ET) n’a pas d’effet. De plus, l’activation du récepteur Tie2 induit la synthèse et la libération de 5-HT et d’ET1 par les CE-P isolées à partir de patients souffrant d’HTAP. La voie angiopoïétine/Tie2 joue donc un rôle central dans le dialogue croisé existant entre l’endothélium et le muscle lisse vasculaire pulmonaire et son activation contribue à la prolifération accrue des CML-AP responsable du remodelage vasculaire pulmonaire chez les patients souffrant d’HTAP idiopathique. <p>L’expression du BMPR2 est diminuée tant au niveau pulmonaire, que cellulaire chez les patients souffrant d’HTAP et porteurs de mutations BMPR2. Dans ces CML-AP mutées, le BMP4 ne freine pas la prolifération et n’induit pas l’apoptose, normalement induites dans les cellules isolées à partir de contrôles et de patients souffrant d’HTAP non porteurs de mutations BMPR2. Ces particularités fonctionnelles sont associées à une activation de la voie p38MAPK et un défaut d’activation de la voie Smad. Parmi les 9 mutations BMPR2 étudiées, seule la mutation par délétion de 22 paires de bases dans le domaine transmembranaire ne présente pas ces particularités fonctionnelles. Des anomalies génétiques, telles les mutations BMPR2 concourent donc à une perte du contrôle de la prolifération cellulaire associé à l’activation de la voie p38MAPK, présentant les mutations BMPR2 étudiées, comme des facteurs de risque supplémentaires au développement de l’hyperplasie médiale dans l’HTAP. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

No abstract / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished