En transplantation d’organes, la réponse immunitaire de l’hôte contre son donneur reste une cause très importante de perte de greffons. Ainsi, un meilleur contrôle de la réponse par induction d’une tolérance spécifique reste une priorité en transplantation humaine. Dans ce travail, nous avons exploré les effets de l’acide mycophénolique (MPA, immunosuppresseur couramment utilisé en transplantation) sur les cellules dendritiques (DC) humaines. Nous avons mis en évidence que le MPA diminue la capacité des DC à activer des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques allogéniques en diminuant la synthèse d’interféron gamma dans les DC. Par ailleurs, les DC traitées par MPA sont capables d’induire des lymphocytes T CD4+ régulateurs antigène-spécifiques (iTreg) qui peuvent reprogrammer des DC matures en DC aux propriétés tolérogènes. Enfin, ces iTreg entraînent une réduction de la sécrétion d’IFN-γ par les cellules T CD8+ et une inhibition de leur fonction cytotoxique en réponse à une stimulation allogénique. L’ensemble de ces résultats obtenus in vitro suggèrent que les DC-MPA humaines pourraient être potentiellement utilisés en thérapie cellulaire afin de promouvoir une tolérance d’allogreffe. / In organ transplantation, host immune response against donor still remains a major cause of graft loss. A better control of allogeneic response through the induction of specific tolerance is a major goal in human transplantation. In this work, we explored the effects of mycophenolic acid (MPA, an immunosuppressive drug currently used in transplantation) on dendritic cell (DC) functions. We demonstrated that MPA inhibits DC ability to induce allogeneic cytotoxic CD8+ T cells through inhibition of interferon gamma synthesis in DC. Moreover, mycophenolic acid-treated dendritic cells (MPA-DC) are able to induce antigen-specific regulatory CD4+ T lymphocytes (iTreg) which can convert fully mature DC into tolerogenic DC. These iTreg decrease the expression of proteins associated with cytotoxic function (perforin and granzymes A and B), reduce IFN-γ production by CD8+ T cells and inhibit their cytotoxic function in response to allogeneic stimulation. These results taken together suggest that human MPA-DC could be use in cellular therapy in order to promote allograft tolerance.

Les cellules T folliculaires helper (Tfh) jouent un rôle central dans la mise en place de réponses humorales efficaces. En effet, les Tfh participent à la sélection des lymphocytes B permettant le développement de lymphocytes B mémoires et d’anticorps de haute affinité. Les Tfh représentent ainsi une cible prometteuse pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques, notamment pour augmenter l’efficacité de la vaccination. Ainsi, il apparaît crucial de mieux comprendre les étapes menant à leur développement, en particulier chez l’Homme. L’initiation de la polarisation Tfh se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires et met en jeu les cellules myéloïdes mononucléaires (MMC). Les MMC présentes dans les organes lymphoïdes comprennent les macrophages résidents et trois sous populations de DC résidentes : les cDC1 (CD141+), les cDC2 (CD1c+) et les pDC. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au rôle respectif des sous populations de MMC humaines dans l’induction de la polarisation Tfh. Ainsi, les travaux effectués au cours de ma thèse avaient pour objectifs dans un premier temps d’analyser la capacité des différentes populations de MMC à induire la polarisation Tfh, afin de mettre en évidence de potentielles spécialisations fonctionnelles. Dans un second temps, nous nous sommes concentrés sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l’induction par les MMC de la polarisation Tfh. Nous avons montré une spécialisation fonctionnelle des cDC2 et des macrophages des amygdales pour la polarisation Tfh. Toutefois, des différences ont été observées entre les cDC2 et macrophages, puisque les macrophages induisent la sécrétion par les lymphocytes T d’une grande quantité de CXCL13 par rapport au cDC2, qui sont plus efficaces pour induire la production d’IL21. Nous avons pu également montrer que les cDC2 et macrophages sécrétaient des cytokines précédemment identifiées comme ayant un rôle dans l’induction des Tfh telles que IL12p70, ActivinA et TGFβ. Afin de confirmer le rôle de ces cytokines dans la polarisation induite par les MMC d’amygdales, nous avons utilisé des anticorps bloquants dans nos expériences de polarisation T helper. Ainsi, nous avons confirmé le rôle de l’IL12p70, de l’Activin A et du TGFβ dans l’induction des Tfh humains. Nos résultats suggèrent également un rôle de l’Activin A et de TGFβ dans l’induction de la sécrétion de CXCL13, alors que l’IL12p70 serait impliqué dans l’induction de la sécrétion d’IL21. Nos résultats suggèrent aussi l’existence de deux sous populations de Tfh caractérisées soit par l’expression d’IL21 soit par l’expression de CXCL13. Les travaux réalisés au cours de ma thèse enrichissent ainsi les connaissances sur la spécialisation fonctionnelle des sous populations de DC et des macrophages humains, et apportent de nouveaux éléments pour la compréhension de la différenciation des Tfh humains. / T follicular helper cells (Tfh) play a key role in the establishment of efficient humoral responses. Indeed, Tfh are involved in B lymphocyte selection allowing the development of high affinity memory B cells and antibodies. Tfh are promising targets for new therapeutic strategies, especially to increase the effectiveness of vaccination. Thus, it is crucial to better understand the stages leading to their development, especially in human. Initiation of Tfh polarisation occurs in secondary lymphoid organs and involves mononuclear myeloid cells (MMC). MMC from secondary lymphoid organs include resident macrophages and three subsets of resident Dendritic Cells (DC): cDC1 (CD141+), cDC2 (CD1c+) and pDC. We were particularly interested in human MMC subsets respective roles in the induction of Tfh polarisation. Thus, the work carried out during my thesis aimed first at analysing the ability of different populations of MMC to induce Tfh polarisation, in order to highlight potential functional specialisations. In a second step, we focused on the molecular mechanisms involved in Tfh polarisation by MMC. We have shown a functional specialisation of cDC2 and tonsillar macrophages for Tfh polarisation. However, differences have been observed between cDC2 and macrophages, since macrophages induce secretion by T cells of a large amount of CXCL13 compared to cDC2, which are more effective in inducing IL21 production. We have also been able to show that cDC2 and macrophages secreted cytokines previously shown to play a role in Tfh induction such as IL12p70, ActivinA and TGFβ. In order to confirm the role of these cytokines in Tfh polarisation induced by tonsil MMCs, we used blocking antibodies in our T helper polarisation experiments. Thereby, we confirmed the role of IL12p70, Activin A and TGFβ in the induction of human Tfh. Our results also suggest a role for Activin A and TGFβ in inducing secretion of CXCL13, whereas IL12p70 would be involved in the induction of IL21 secretion. Besides, our results suggest the existence of two Tfh subsets characterised by expression of either IL21 or CXCL13. The work performed during my thesis broadens the knowledge on the functional specialisation of human DC subsets and macrophages, and provides new insight into the differentiation of human Tfh.

Le système immunitaire protège un organisme du développement de pathogènes et participe activement au maintien de la tolérance immunitaire. Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules spécialisées dans l’équilibre pro et anti-inflammatoire de la réponse immunitaire. Les DC jouent un rôle important dans de nombreux contextes pathologiques notamment la transplantation d’organes, en oncologie et dans les pathologies inflammatoires. Elles sont modulables grâce à divers facteurs, intrinsèques et extrinsèques. Parce qu’elles sont capables d’induire une réponse tolérogène, ces cellules représentent des cibles intéressantes pour moduler la réponse immunitaire dans le contexte de la transplantation d’organes et des pathologies inflammatoires. Certains agents pathogènes utilisent des mécanismes d’échappement au système immunitaire en favorisant l’induction d’une tolérance immunitaire. Cette modulation est réalisée par le ciblage des récepteurs de reconnaissance des pathogènes (PRR) sur la présence des DC, induisant la synthèse d’une cytokine antiinflammatoire IL-10, un des inducteurs de la tolérance immunitaire. Notre stratégie a été de construire un anticorps bispécifique ciblant deux PRR différents à partir d’une banque d’anticorps anti-PRR. Notre travail montre que cet anticorps bispécifique est capable d’orienter les DC vers d’un profil tolérogène. Cet anticorps bispécifique induit un phénotype de DC semi-mature avec un profil de sécrétion pro-tolérogène avec de l’IL-10 et peu de cytokines inflammatoires. Le profil de tolérance immunitaire induite par ces cellules reste à explorer. Nos travaux ouvrent de perspectives intéressantes sur l’association des PRR en vue d’obtenir la modulation des cellules de l’immunité. / The immune system protects an organism from the development of pathogens and actively participates in maintaining immune tolerance. Dendritic cells (DC) are specialized cells in the balance and anti-inflammatory immune response. DC play an important role in many pathological contexts, including organ transplantation, oncology and inflammatory diseases. Various factors, both intrinsic and extrinsic, can modulate. Because they are capable to inducing a tolerogenic response, these cells represent interesting targets for the immune response in the context of organ transplantation and in inflammatory pathologies. Some pathogens use mechanisms of escape to the immune system by promoting the induction of immune tolerance. This modulation is achieved by targeting the pathogen recognition receptors (PRRs) present on the surface of DC, inducing the synthesis of an anti-inflammatory cytokine IL-10, one of the main inducers of immune tolerance. Our strategy was to construct a bispecific antibody targeting two different PPRs from an anti-PRR antibody library. Our work shows that this bispecific antibody is able to direct the DC to a pro-tolerogenic profile. This bispecific antibody induces a semi-mature DC phenotype with a secretion profile of pro-tolerogenic cytokines such as IL-10 and few inflammatory cytokines. The immune tolerance profile of these DC remains to be explored. Our work opens interesting perspectives on the association of PRRs in order to obtain the modulation of the cells of the immunity.

En transplantation d’organes, la réponse immunitaire de l’hôte contre son donneur reste une cause très importante de perte de greffons. Ainsi, un meilleur contrôle de la réponse par induction d’une tolérance spécifique reste une priorité en transplantation humaine. Dans ce projet,nous avons donc étudié l’homéostasie calcique au cours des phénomènes précoces de la maturation des cellules dendritiques (DC) humaines. Nous avons mis en évidence la présence d’une ECC (Entrée Capacitive de Calcium), dans la DC humaine, lors d’une stimulation par des agonistes des TLR (LPS ou Zymosan) ou des cytokines inflammatoires (TNF-α). De plus, cette ECC est gouvernée par le complexe ORAI-1 / STIM-1. En effet, l’absence d’expression de ces protéines induit une diminution de la maturation des DC humaines (phénotype, synthèse de cytokines). Par ailleurs, le Calcium, entré par l’ECC, va induire l’activation de canaux potassiques, sensibles à la concentration intracellulaire en Calcium : les canaux KCa3.1. Ces canaux, outre leur rôle dans la facilitation de l’ECC par hyperpolarisation de la membrane,contrôlent la migration des DC humaines. En effet, leur activation permet une sorte d’état de quiescence où les DC restent dans les tissus périphériques. L’ensemble de ces résultats obtenus,in vitro, suggèrent que ces canaux ioniques pourraient être une cible privilégiée pour le développement de nouvelles thérapies pour l’induction de tolérance immune en transplantation. / In organ transplantation, host immune response against donor still remains a major causeof graft loss. A better control of allogeneic response through the induction of specific tolerance isa major goal in human transplantation. In this work, we studied the calcium homeostasis during the earlier events of the human dendritic cells (DC) maturation. We showed the presence of a CCE(Capacitative Calcium Entry), in the human DC, during the stimulation by TLR agonists (LPS andZymosan) or inflammatory cytokines (TNF-α). Moreover, this CCE was managed by the ORAI-1/ STIM-1 complexe. Indeed, an inhibition of these proteins expression induced a decrease in theDC maturation (phebnotype, cytokines production). Then, the Calcium, issued to CCE, could activate potassium channels, sensitive to intracellular Calcium concentration: KCa3.1 channels.These channels, excepted their role in the facilitation of CCE by membrane hyperpolarisation,control the capacity of human DC migration. Their activation induced a kind of steady state where the DC staied in peripheral tissues. These results taken together suggest that the ion channels seemto be a good target for the development of new therapies to in order to promote allograft tolerance.

Notre système immunitaire a pour fonction de nous protéger des infections mais également des allergies, des cancers ou des maladies inflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont au coeur de ce système en orientant les réponses immunitaires vers une voie effectrice ou tolérogène. A l’état immature, elles sont présentes, entre autres, aux interfaces avec le milieu extérieur. Elles permettent ainsi la reconnaissance des antigènes, notamment ceux présents dans le tube digestif, comme les aliments ou la flore commensale. Certaines bactéries dites probiotiques sécrètent des métabolites au cours de la fermentation définissant les produits de fermentation. Notre travail montre qu’un produit de fermentation de la souche bactérienne BbC50 (BbC50sn) activent les DC humaines grâce à sa fixation sur le récepteur TLR2 et modulent de nombreux récepteurs à leurs surfaces. Les DC ainsi maturées peuvent activer des lymphocytes T CD4+ et CD8+ et également induire des lymphocytes T régulateurs CD4+ et CD8+. / The immune system protects an organism from infections, allergy, cancer and inflammatory diseases. Dendritic cells (DC) present antigens to T cells and polarize lymphocytes toward either an effector or a tolerogenic response. In an immature state, DC are localized in mucosas at interfaces with the external environment, after receiving signals they acquire the ability to activate T cells. Thus, DC allow the recognition of antigens, present in the digestive tract, such as food or commensal flora. Some probiotic bacteria produce metabolites during fermentation defined as the fermentation products. Our work has shown that a fermentation product of the bacterial strain BbC50 (BbC50sn) activate human DC through TLR2 ligation on DC and modulate numerous receptors on their surfaces. DC activated with this fermentation product activate CD4+ and CD8+ T cells and also induce CD4+ and CD8+ regulatory T lymphocytes.

Le rôle de l'interleukine 2 (IL-2) dans les cellules dendritiques (DC) humaines n’est pas bien défini. Dans ce travail, nous avons exploré les effets de l'IL-2 sur des DC dérivées de monocytes. Nous démontrons une expression constitutive des chaines des β et γ du récepteur de l’IL-2 sur les DC ainsi qu’une une expression inductible de la chaîne α en réponse à des agents ‘maturants’ tels le LPS et le TNFα. L’IL-2 induit la phosphorylation du facteur de transcription STAT5 provoquant l’augmentation de la synthèse d'IFN-γ par les DC sans modifier leur phénotype ou leur survie. En revanche, nous n'avons pas mis en évidence d’activation des autres voies de signalisation du récepteur de l’IL-2. Nous avons également démontré que l'IL-2 augmente les capacités des DC à activer les lymphocytes T CD4+ allogéniques et les lymphocytes T CD8+ indépendamment des lymphocytes T auxilliaires. Nous n’avons pas pu mettre en évidence la sécrétion endogène d'IL-2 par les DC cependant les anticorps anti-CD25 diminuent les capacités allostimulatrices de DC en absence d’IL-2 exogène. Ainsi nos travaux indiquent que l’expression de CD25 par les DC matures est un événement clé menant la DC à un nouvel état d’activation. / Human dendritic cells (DC) express interleukin 2 (IL-2) receptor α-chain (CD25), but the role of IL-2 in DC is poorly understood. In this work, we explored the effects of IL-2 on monocyte-derived DC. First, we demonstrated the constitutional expression of β and γ chain of IL-2R on DC, while the α-chain was inducible by LPS and TNFα. Then we found that IL-2 does not affect DC phenotype and apoptosis but increases IFN-γ synthesis in DC through activation of transcription factor STAT5. Moreover we reported that IL-2 increases the ability of DC to activate allogeneic CD4+ T cells and helpless CD8+ T lymphocytes, most likely because of IL-2–triggered IFN-γ synthesis. We have not been able to demonstrate the endogenous secretion of IL-2 by DC, however anti-CD25 decreased allostimulatory capacity of DC in the absence of exogenous IL-2.In summary, we disclose that IL-2 induces DC functional maturation and activation. Interestingly, our study suggests a direct effect of anti-CD25 monoclonal antibodies on DC and that CD25 expression regulation on human DC could be used to control immune response in vivo.