Le coiffage pulpaire direct, dans des situations pathologiques critiques où la vitalité de la dent est menacée, vise à stimuler le potentiel de cicatrisation de la pulpe et induire une régénération dentinaire. Afin d'optimiser cette thérapeutique, le Laboratoire IMEB-ERT 30 a développé en partenariat avec la société SEPTODONT un nouveau matériau, le Biodentine™. Ce ciment, composé essentiellement de silicate tricalcique, possède des qualités physiques permettant son utilisation comme substitut dentinaire. Le premier objectif de notre travail a été d'évaluer les propriétés biologiques du Biodentine™ et ses interactions avec les cellules cibles en culture. La bioactivité du nouveau ciment a ensuite été étudiée à l'aide du modèle de culture de dents entières humaines ex vivo. Ce modèle expérimental original a été mis au point dans notre laboratoire et permet d'étudier les phases précoces de la régénération dentinaire lors du coiffage direct. Grâce à ce modèle, nous avons démontré l'activation, la prolifération et la migration de cellules progénitrices pulpaires périvasculaires en réponse à une lésion cavitaire profonde. Le coiffage direct avec les ciments de silicates tricalciques a induit la formation de foyers minéralisés à proximité de la lésion. La caractérisation moléculaire de ces foyers a montré qu'il s'agit d'une forme de dentine réparatrice synthétisée par des cellules odontoblast-like. Le deuxième objectif de notre travail a été d'étudier l'effet du nouveau biomatériau sur la sécrétion de certains facteurs de croissances, impliqués dans les phases précoces de la cicatrisation pulpaire, et de le comparer à celui d'autres matériaux de coiffage. / The objective of direct pulp capping is to stimulate the pulp healing potential and to induce dentin regeneration. This is of prime importance in critical pathologic situations compromising the tooth vitality. To improve the outcome of this treatment, the IMEB-ERT30 Laboratory, in collaboration with the SEPTODONT Company, has developed a new restorative material called Biodentine™. This cement, essentially composed of tricalcium silicates, has the required physical properties to be used as a dentin substitute. The first aim of this work was to evaluate the biological properties of Biodentine™ and its interactions with the target cells in cell culture. Then, the bioactivity of the new cement was studied using an entire human tooth culture model ex vivo. This original experimental model, developed in our Laboratory, is suitable in studying the early steps of dentin regeneration after direct pulp capping. With this model, we demonstrated the activation, proliferation, and migration of perivascular pulpal progenitor cells in response to pulp injury. The direct pulp capping with tricalcium silicate cements induced mineral foci formation in the vicinity of the pulp lesion. Molecular characterization of these foci confirmed it was of a reparative dentin type produced by odontoblast-like cells. The second objective of our work was to study the effect of the new cement on the secretion of some growth factors involved in the early steps of pulp wound healing, and compare it to that of other pulp capping materials. The results demonstrated an up-regulation of b-FGF, VEGF and PDGF-AB secretion in response to the target cells injuries, suggesting a stimulation of angiogenesis.

Le lumicanne est un petit protéoglycanne riche en leucine de la matrice extracellulaire impliqué, entre autre, dans le contrôle de l'angiogenèse, en particulier l'angiogenèse tumorale. Nous avons déjà démontré que le lumicanne inhibe la progression du mélanome in vivo. Le mécanisme d'action anti-tumoral du lumicanne a été partiellement décrit dans notre laboratoire. L'intégrine alpha2beta1 a été caractérisée comme un récepteur direct du lumicanne. Dans l'étude que nous présentons, nous avons décrit le rôle du lumicanne dans le contrôle de la transition des cellules souche mésenchymateuse (CSM) en cellules progénitrices endothéliales, pouvant contribuer à l'angiogenèse tumorale. Nous avons montré que le lumicanne inhibe spécifiquement la migration et l'invasion des CSM par une diminution de l'expression et de l'activité de la MMP-14. De plus, nous avons démontré que le lumicanne est un inhibiteur compétitif de la MMP-14. Il se lie directement au domaine catalytique de l'enzyme avec une affinité modérée (KD=275,4±16.12nM). De plus, nous avons démontré que le lumicanne diminue la phosphorylation de récepteurs (EGFR, Mer, EphB2, EphB6, ROR) et de protéines kinases (AKT, GSK3 beta et p130CAS). Une diminution de l'expression de la beta-caténine a également été détectée.Notre équipe a précédemment identifié une séquence de 17aa dans la protéine de cœur du lumicanne, la lumcorine, qui est capable de reproduire l'effet anti-migratoire du lumicanne. Nous proposons ici deux mécanismes d'action de la lumcorine: une inhibition de la phosphorylation de FAK et une diminution de l'activité de la MMP-14. De plus, nous avons identifié, au sein de la séquence de la lumcorine, un peptide court de 10aa (L9M) qui est capable de reproduire l'effet anti-tumoral de la lumcorine. Nous montrons que le peptide cyclique L9M diminue la croissance tumorale in vivo.Nos travaux permettent donc de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'effet anti-tumoral du lumicanne et mettent en évidence de nouveaux peptides prometteurs pour des applications anticancéreuses. / Lumican is a small leucine-rich proteoglycan of the extracellular matrix involved in the control of angiogenesis, particularly tumor angiogenesis. We have previously demonstrated that lumican inhibits melanoma progression in vivo. The anti-tumor mechanism of action of lumican was partially described in our laboratory. The alpha2beta1 integrin was characterized as a direct receptor of lumican. In the present studies, we first described the role of lumican in the control of Mesenchymal Stem Cells (MSC) transition to functional Endothelial Progenitor Cells (EPC), which can contribute to tumor angiogenesis. We showed that lumican inhibits specifically the migration and invasion of MSC by decreasing the expression and activity of MMP-14. Moreover, we demonstrated that lumican reduces the activity of MMP-14 in melanoma cells. We next showed that lumican directly inhibits MMP-14 activity as a competitive inhibitor which binds to the catalytic domain of the enzyme with moderate affinity (KD=275.4±16.12nM). Moreover, we demonstrated that lumican decreases the phosphorylation of some cell surface receptors (EGFR, Mer, EphB2, EphB6, ROR), some kinases (AKT, GSK3 beta and p130CAS) and alters the expression of beta-catenin.Previous works from our laboratory identified a sequence of 17aa within the leucine-rich repeat 9, named lumcorin, which was able to reproduce the anti-migratory effect of lumican. Here, we propose two mechanisms of action of lumcorin: inhibition of phosphorylation of FAK and a decrease of the MMP-14 activity. We also identified in the sequence of lumcorin a short 10aa peptide (L9M) which was capable to reproduce the anti-tumor effect of lumcorin. In addition, the cyclic peptide L9M was demonstrated to reduce tumor growth in vivo.Altogether, our results help to better understand the mechanisms involved in the anti-tumor effect of lumican and identify lumican-derived peptides which could have potential anti-cancer applications.

Les anévrysmes de l'aorte abdominale (AAAs) sont des dilatations artérielles qui exposent le patient au décès par rupture. Ils sont caractérisés notamment par la perte de la monocouche de cellules endothéliales et son remplacement par un épais thrombus mural. Cependant, le lienentre l'accroissement du diamètre anévrysmal, la présence d'un thrombus et la perte en cellules endothéliales reste inexploré. Notre hypothèse est que la perte de l'endothélium contribue au développement des AAAs et que sa restauration par thérapie cellulaire permettrait de stabiliser les AAAs. In vivo, la réparation endothéliale implique le recrutement des cellules endothéliales adjacentes mais également des cellules progénitrices endothéliales (EPCs). Chez l'homme, le nombre et l’activité fonctionnelle des EPCs sont inversement corrélés aux facteurs de risque cardiovasculaire, et très peu de données sont disponibles sur l’activité fonctionnelle des EPCs issues de patients porteurs d'AAA. La présence du thrombus pourrait ainsi diminuer le nombre et les propriétés cicatricielles des EPCs issues de patients porteurs d'AAA. / Summary not transmitted

Les traitements actuels de la leucémie myéloïde chronique (LMC) ne permettent pas d’éliminer la totalité des cellules leucémiques. Dans le but de développer un traitement curatif, il est donc nécessaire de parvenir à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents des réponses partielles aux traitements, Dans ce travail, nous avons postulé qu’il existe des mécanismes de contrôle extrinsèques de la LMC pouvant influencer l’efficacité des différents traitements. Nous avons choisi d’étudier le rôle potentiel dans la LMC des lymphocytes iNKT, cellules T de type « inné » auxquelles la littérature attribue de nombreuses fonctions antitumorales et des facteurs moléculaires, la cytokine/alarmine IL-33, produite dans la niche hématopoïétique, et son récepteur ST2 à la surface des cellules hématopoïétiques comme cibles de l’IL-33.La première partie de notre travail a ainsi permis de mettre en évidence de profondes altérations fonctionnelles des lymphocytes iNKT chez les patients atteints de LMC ainsi qu’une correction partielle de ces défauts après traitement par l’Imatinib (IM) ou l’IFN-. L’ensemble de ces résultats permet de proposer que l’altération des fonctions des cellules iNKT au cours du développement de la LMC pourrait participer aux mécanismes d’échappement de la tumeur au contrôle par le système immunitaire. La deuxième partie de notre travail a permis de mettre en évidence une expression de la molécule ST2, chaîne spécifique du récepteur à l’IL-33, à la surface des cellules CD34+ de patients atteints de LMC, expression non décelée chez les sujets sains et les patients en rémission après traitement par l’IM. De plus, contrairement aux cellules CD34+ de sujets sains, les cellules progénititrices de patients en phase chronique prolifèrent en réponse à l’IL-33. Enfin, nous avons montré que l’IL-33 est capable de contrecarrer in vitro les effets antiprolifératifs de l’IM. Ainsi nous pouvons émettre l’hypothèse selon laquelle l’IL-33, une cytokine/alarmine, puisse participer aux phénomènes conduisant à la persistance de progéniteurs hématopoïétiques leucémiques chez les patients sous traitement par IM. / To date, treatment of Chronic Myeloid Leukaemia (CML) is not sufficient to completely eradicate leukaemia cells. Hence, in order to develop a curative treatment, it is necessary to have a better understanding of the underlying mechanisms explaining why response to treatment is only partial..We therefore addressed the question whether the extrinsic mechanisms of CML control can affect the effectiveness of different treatments. We first provided evidence of profound functional impairments of iNKT cells in patients with CML. Interestingly these impairments were partially corrected after treatment with Imatinib (IM) or IFN-. Consequently our results suggest that altered functions of iNKT cells during the development of CML could facilitate tumour escape from immune destruction. . The second part of our work revealed that CD34+ progenitors from CML patients upregulate their cell surface expression of the IL-33-specific receptor chain ST2, proliferate and produce cytokines in response to IL-33, conversely to CD34+ cells from healthy individuals. Moreover, ST2 overexpression is normalized following IM therapy, while IL-33 counteracts in vitro IM-induced growth arrest in CML CD34+ progenitors. From these findings, it can be surmised that IL-33, a cytokine/alarmin likely expressed in the hematopoietic niche, facilitates the development of CML and IM resistance.

Objectif : à partir d'un sujet de DEA, avec le soutien de toute l'équipe INSERM U633, élaborer une stratégie de recherche et progresser sur un thème pour permettre le développement de la thérapie cellulaire. Ce travail de recherche fondamentale permettant l'écriture et l'application d'un protocole de recherche chez l'homme. Quatre protocoles différents ont été réalisés : 1) Améliorer la résistance du greffon cellulaire en appliquant un choc thermique ; 2) Améliorer la survie des myoblastes squelettiques à l'aide d'un gène de survie cellulaire ; 3) Etudier la survie et l'efficacité des cellules progénitrices adultes multipotentes dérivées de la moelle osseuse en greffon myocardique ; 4) Améliorer les résultats de la transplantation de myoblastes squelettiques par l'apport d'érythropoïétine. Un PHRC local sur la thérapie cellulaire par des cellules mononuclées médullaires autologues lors de la revascularisation myocardique a été élaboré et accepté. Actuellement un tiers de l'effectif a été inclus. Une modification des critères d'inclusion permet actuellement un recrutement plus important de patients.

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques. / When atherosclerotic vascular obstructions are so extensive that direct revascularization techniques cannot be undertaken successfully, the severity of residual tissue ischemia will depend in large part on the ability of the organism to spontaneously develop new blood vessels (neovascularization). The mechanisms involved in neovascularization depend on the oxidative stress balance. Increased oxidative stress is a common feature of all cardiovascular risk factors and particularly aging. In the vascular wall, CuZnSOD is the predominant antioxidant enzyme. Nevertheless, its specific role in vascular aging and new blood vessels formation is currently unknown. Accordingly, we hypotheze that 1) CuZnSOD deficiency reduces neovascularization in response to ischemia 2) this reduction is partly due to vascular aging affecting mature endothelial cells and endothelial progenitor cells. We have demonstrated that CuZnSOD deficiency significantly reduces neovascularization in response to ischemia. This reduction is associated with increased oxidative stress and reduced NO bioavailability. CuZnSOD deficiency significantly decreases EPCs number (bone marrow, spleen). Moreover, these EPCs present significant increased oxidative stress levels, reduced NO production and decreased migration and incorporation into tubular-like structures capacities. Importantly, neovascularization in CuZnSOD deficient-mice can be rescued by an EPCs supplementation from control mice. vii We have also demonstrated that the blood flow recovery following ischemia was significantly reduced with aging. Both in old and young mice, CuZnSOD deficiency led to a further reduction of neovascularization. Interestingly, the resulting neovascularization potential in young CuZnSOD-deficient mouse was similar to that of an older wild type mouse. Oxidative stress levels were also increased to similar levels in these two groups. Both aging and CuZnSOD deficiency were associated with reduced number of bone marrow and peripheral EPCs. The effect of moderate aging alone on specific functional activities of EPCs was modest. However, CuZnSOD deficiency was associated with severe age-dependent defect in EPC fucntional activities. In summary, our resultats suggest that CuZnSOD protection against oxidative stress is essential for EPC functional activities and neovascularization in response to ischemia. The defective neovascularization observed in CuZnSODdeficient mice is associated with accelerated vascular aging. Our results suggest that in aging context, CuZnSOD has a critical role limiting increased oxidative stress and protecting both EPC functional activities and ischemic tissues integrity.

Le développement du rein est un exemple intriguant d’un équilibre délicat entre la prolifération des cellules progénitrices, la différentiation et l’apoptose. Le gène Wt1 est indispensable pour la survie des cellules progénitrices. Le but de cette thèse a été de définir les voies de signalisation activées par Wt1 pendant le développement du rein. En utilisant les souris Wt1 KO, nous avons démontré que WT1 coordonne l’action de deux voies de signalisation opposées : Fgf et Bmp/Smad intervenant dans la survie des cellules progénitrices rénales. Dans une deuxième étude, nous avons analysé le rôle du modificateur épigénétique, le gène Phf19 pendant le développement du rein. Nous avons démontré que l’expression de ce gène est Wt1-dependant et il est exclusivement exprimé dans les cellules progénitrices rénales au cours du développement et que son inactivation dans le rein embryonnaire en culture, conduit à l’apoptose des cellules progénitrices. Nous avons généré des souris knockout de Phf19 par l’approche de CRISPR/Cas9. Dans le cas d’une létalité précoce des embryons homozygotes, nous opterons pour la production du model animal knockout conditionnel et procéderons à la caractérisation de leur profile épigénétique. Cette thèse a permis d’une part, de découvrir deux voies de signalisation antagonistes, régulées par le Wt1et impliquées dans le contrôle de la survie des cellules progénitrices rénales et d’autre part de nous orienter vers le contrôle de la survie et la prolifération de ces cellules par modifications épigénétiques. Ceci nous permettra de contribuer à la connaissance de l’étiologie d’une grande proportion des malformations rénales restant à ce jour inconnues. / Kidney organogenesis requires the tight control of proliferation, differentiation and apoptosis of renal progenitor cells. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is required for renal progenitor survival. The aim of this thesis was to elucidate the molecular cause for renal agenesis in Wt1 mutant mouse. Here we demonstrate that lack of Wt1 abolishes FGF and induces BMP/pSMAD signaling within the metanephric mesenchyme. We further show that recombinant BMP4, but not BMP7, induces an apoptotic response within the early kidney that can be suppressed by simultaneous addition of FGFs. These data reveal an unknown sensitivity of early renal progenitors to pSMAD signalling, establishes FGF and pSMAD signalling as antagonistic forces in early kidney development and places WT1 as a key regulator of pro-survival FGF signalling pathway genes. In a second study, we demonstrated, that Phf19, an epigenetic modifier, is essential both for maintaining Wt1 expression in renal progenitor cells and their survival in an ex-vivo culture. We further generated a Phf19 knockout mouse by CRISPR/Cas9. The homozygous embryos will be analyzed to further decipher the contribution of Phf19 to potential kidney malformations and the epigenetic profile of renal progenitor cells will be characterized. Overall, the new insights into the molecular mechanisms controlling the survival of renal progenitor cells, reported in this thesis, provide one more step in our understanding of renal malformations. In addition, our results conducted us toward the epigenetique modifications that could open up promising new avenue of understanding the etiology of an important proportion of renal malformation that remains unknown.

[...]Mon projet de Doctorat a donc visé à : 1. déterminer le rôle de la voie de signalisation PKR1 in vivo ; 2. la perte de la voie de signalisation PKR1 provenant de l’épicarde induit des dysfonctions cardiaques et rénales ; 3. mettre en évidence le rôle de PKR1 dans l’activation et la différentiation des cellules progénitrices.[...] / [...]My specific aim are the following : 1. To determine the role of PKR1 signaling pathways in vivo ; 2. To show that the inactivation of PKR1 specifically in epicardium can induce cardiac and renal disorders ; 3. To determine the role of PKR1 in activation and differentiation of progenitor cells.[...]

Le virus de la maladie de Borna (BDV) est un virus persistant dans le système nerveux central responsable de troubles du comportement chez l’animal et possiblement chez l’homme. En utilisant des cellules progénitrices neurales humaines, des travaux antérieurs à mon arrivée au laboratoire ont montré que BDV altère la neurogenèse humaine. Les objectifs de ma thèse étaient d’identifier les déterminants viraux responsables de cette altération et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avons montré que la phosphoprotéine (P) et la nucléoprotéine (N), mais pas la protéine X, induisent une inhibition spécifique de la neurogenèse humaine, la genèse des astrocytes n’étant pas altérée. Ensuite, focalisant notre étude sur P, nous avons montré qu’elle affectait particulièrement la genèse des neurones GABAergiques. La caractérisation moléculaire a ensuite révélé une diminution de l’expression de gènes impliqués dans la spécification (ApoE et Noggin) et dans la maturation (SCG10/Stathmin2 et TH) neuronale. En conclusion, nos résultats démontrent, pour la première fois, qu’une protéine virale perturbe la neurogenèse GABAergique humaine, un processus connu pour être dérégulé dans certaines maladies psychiatriques. Ils améliorent ainsi notre compréhension de la pathogenèse de ce virus persistant et de son rôle possible dans les maladies psychiatriques chez l’homme. / Borna disease virus (BDV) is a persistent neurotropic virus causing neurobehavioral disorders in animals and possibly humans. Using human neural progenitor cells, it had been shown, before my arrival in the laboratory, that BDV induces an alteration in human neurogenesis. Here, we aimed at identifying the viral determinants involved in BDV-induced impairment of neurogenesis and at characterizing the underlying molecular mechanisms. We demonstrated that the phosphoprotein (P) and the nucleoprotein (N), but not the X protein, reduce neurogenesis. Focusing on the role of P, we evidenced an impairment of GABAergic neurogenesis. Then, seeking for the molecular mechanisms responsible for P-induced inhibition of neurogenesis, we showed that it induces a decrease in the expression of cellular factors involved in either neuronal specification (ApoE, Noggin) or maturation (SCG10/Stathmin, TH). Thus, in this study, we demonstrated for the first time that a viral protein is capable of inhibiting GABAergic neurogenesis, a process that is dysregulated in some psychiatric diseases. Our results improve our understanding of the pathogenesis of this persistent neurotropic virus and of its possible role in psychiatric disorders.

[...]Mon projet de Doctorat a donc visé à : 1. déterminer le rôle de la voie de signalisation PKR1 in vivo ; 2. la perte de la voie de signalisation PKR1 provenant de l'épicarde induit des dysfonctions cardiaques et rénales ; 3. mettre en évidence le rôle de PKR1 dans l'activation et la différentiation des cellules progénitrices.[...]