L'objectif de ce projet consiste à identifier des molécules fluorescentes, naturellement présentes dans les cellules, et dont l'évolution de leur concentration sera représentative du comportement métabolique de cellules en suspension. Ces molécules pourront servir au suivi du métabolisme cellulaire en temps réel durant une culture. Un besoin pour ce type d'outils se fait sentir afin de pouvoir développer et optimiser des bioprocédés, dont ceux utilisant des cellules végétales indifférenciées en suspension. La première étape fut la sélection et la caractérisation expérimentale de 11 molécules candidates à l'aide d'un spectrophomètre équipé d'un monochromateur quadruple. Après la réalisation des empreintes optiques des molécules, 16 zones d'intérêt dans le spectre d'autofluorescence furent identifiées et suivies dans le temps. Les signaux de la suspension complète, du milieu et des cellules filtrées furent analysés afin d'identifier 10 marqueurs métaboliques, caractérisés par 10 couples de longueurs d'ondes corrélés à des variables de culture. Cette méthode a permis d'identifier dix marqueurs métaboliques dans la suspension complète et laisse entrevoir la possibilité de plusieurs autres dans le milieu et les cellules filtrées. Le fait que certains marqueurs puissent se valider entre eux rajoute à la puissance de cette méthode. Il a donc été démontré que l'autofluorescence des cellules de plante indifférenciées en suspension contient assez d'information pour permettre le suivi de la croissance cellulaire en temps réel. La prochaine étape sera donc de valider ces marqueurs sur d'autres types de cellules.

Le rôle des lipides comme des acteurs moléculaires de la voie sécrétoire des plantes n'est pas encore complètement élucidé. Le Glucosylceramide (GlcCer) est synthétisé par la Glucosylceramide synthase (GCS) chez les plantes et constitue un des sphingolipides complexes clé dans les membranes, mais on connaît peu les exigences cellulaires pour le GlcCer. Cette étude repose sur le blocage de la biosynthèse de GlcCer, par l'utilisation d'inhibiteurs chez le tabac et l’arabidopsis, et la production de mutants d'Arabidopsis, pour déterminer l'impact de la biosynthèse du GlcCer sur la dynamique endomembranaire des cellules végétales. Dans une approche qui inclue la biochimie des lipides, l'imagerie de cellules vivantes, des études ultrastructurales par microscopie electronique à transmission et des études sur le développement de la plante entière, nous avons acquis une meilleure compréhension de l'impact de la synthèse du GlcCer dans les cellules végétales qui peut être résumée comme suit: (1) Sur la base d’un analyse théorique et de la microscopie de cellules vivantes on a déterminé que la GCS est situé dans le Réticulum Endoplasmique (au début de la voie sécrétoire) dans les cellules végétales, (2) PDMP est un inhibiteur spécifique de GCS chez les plantes, (3) La perturbation de la biosynthèse du GlcCer par le PDMP et par un approche génétique ont montré que le GlcCer est important pour le trafic normale des protéines et pour la dynamique des endomembranes, notamment dans le maintien de la structure de l’appareil de Golgi, (4) La régulation du trafic des protéines mediée par la synthèse du GlcCer pourrait être critique dans l’etablissement et le maintien de la polarité cellulaire, tel qu’il est suggéré par des changements dans la localisation des marqueurs polaires chez l’Arabidopsis traitée avec PDMP, et (5) Un bloc dans la synthèse du GlcCer peut conduire à des défauts importants dans le développement des plantes, comme le montrent des mutants d'Arabidopsis avec une croissance anormale des racines primaires et incapables à se développer jusqu’aux étapes reproductives. Les interactions potentielles entre GlcCer et les machineries de transport sont discutés, ainsi que les mécanismes cellulaires qui sont potentiellement déclenchés dans les cellules végétales pour compenser une perturbation de la biosynthèse du GlcCer. / The role of lipids as molecular actors in protein secretion is not well understood in plants. Glucosylceramide (GlcCer) is synthesized by Glucosylceramide Synthase (GCS) in plants and constitutes a key complex sphingolipid in membranes, but little is known about the plant cellular requirements for GlcCer. This study relied upon the block of GlcCer biosynthesis, by the use of inhibitors in tobacco and Arabidopsis, and the production of Arabidopsis mutants, to determine the impact of GlcCer biosynthesis on plant cell endomembrane dynamics. In a comprehensive approach that included lipid biochemistry, live cell imaging, ultrastructural studies by Transmission Electron Microscopy, and whole plant developmental studies, we have gained a better understanding of the impact of GlcCer in plant cells that can be summarised as follows: (1) Based on theoretical analysis and live-cell microscopy the GCS is located to the Endoplasmic Reticulum (at the beginning of the secretory pathway) in plant cells, (2) PDMP is a specific inhibitor of GCS in plants, (3) Disruption of GlcCer biosynthesis using PDMP and genetic approaches showed that GlcCer is important for normal protein trafficking and endomembrane dynamics, notably in the maintenance of Golgi structure, (4) The regulation of protein trafficking by the synthesis of GlcCer could be critical in the establishment and maintenance of cell polarity, as suggested by defects in the localisation of polar markers in Arabidopsis treated with PDMP, and (5) A block in GlcCer synthesis may be conducive to severe defects in plant development, as Arabidopsis mutants showed abnormal primary root growth and inability to develop to reproductive stages. Potential interactions between GlcCer and the transport machineries are discussed, as well as cellular mechanisms that may be set off following a disruption of GlcCer biosynthesis in plant cells.

La morphogenèse des plantes repose sur deux mécanismes cellulaires : la division et l'élongation. Par ailleurs, la croissance est source de contraintes mécaniques qui affectent les cellules et guident la morphogenèse. Si les contraintes mécaniques influencent l'orientation du plan de division dans les cellules animales, rien n'est prouvé pour les cellules végétales. À l'heure actuelle, la forme de la cellule est proposée comme le facteur principal gouvernant l'orientation du plan dans les divisions symétriques : les cellules se divisent selon un des plans les plus courts. Cette règle géométrique a été validée dans des tissus à croissance ou courbure isotropes, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents demeurent inconnus. Dans cette thèse, un pipeline a été mis au point pour analyser les divisions cellulaires dans les différents domaines du méristème apical caulinaire d'Arabidopsis thaliana et questionner l'application de la règle géométrique dans ce tissu. La zone frontière du méristème présente une proportion anormalement basse de plans de division très courts. Des simulations de tissus en croissance, dans lesquelles une règle de division mécanique a été implémentée, ont montrées le même biais sur les orientation des plans, comparé à la règle géométrique. Des ablations laser de quelques cellules de l'épiderme ont également été effectuées afin de perturber localement le patron de contraintes mécaniques. Les résultats montrent que l'orientation du plan des divisions postérieures à cette perturbation suit le nouveau patron de contraintes. Enfin, une nouvelle méthode quantitative, basée sur l'utilisation d'un micro-indenteur, a été mise au point pour quantifier la réponse du cytosquelette, et en particulier des microtubules, aux contraintes mécaniques. Le protocole de compression a été testé et validé sur les mutants katanin et spiral2, dans lesquels la réponse aux contraintes est respectivement faible ou amplifiée. / Morphogenesis during primary plant growth is driven by cell division and elongation. In turn, growth generates mechanical stress, which impacts cellular events and channels morphogenesis. Mechanical stress impacts the orientation of division plane in single animal cells; this remains to be fully demonstrated in plants. Currently, cell geometry is proposed to be the main factor determining plane orientation in symmetric divisions: cell divide along one the shortest paths. This geometrical rule was tested on tissues with rather isotropic shapes or growth and the corresponding molecular mechanism remains unknown, although it could involve tension within the cytoskeleton. To address these shortcomings, we developed a pipeline to analyze cell divisions in the different domains of the shoot apical meristem of Arabidopsis thaliana. We computed the probability of each possible planes according to cell geometry and compared the output to observed orientations. A quarter of the cells did not follow the geometrical rule. Boundary domain was enriched in long planes aligned with supracellular maximal tension lines. Computer simulations of a growing tissue following a division rule that relies on tension gave the most realistic outputs. Mechanical perturbations of local stress pattern, by laser ablations, further confirmed the importance of mechanical stress in cell division. To explore the role of microtubules in this process, we developed a microindenter-based protocol to quantify the cytoskeletal response to mechanical stress. This protocol was tested and validated in the katanin and spiral2 mutants, in which the response to stress is delayed or promoted respectively.

Le développement des plantes nécessite la coordination des mécanismes de différenciation des cellules méristématiques en cellules hautement spécialisées: la division, la croissance et la formation de la géométrie cellulaire. La différenciation et la morphogenèse cellulaires sont étroitement liées et régulées par les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire. Les mécanismes conduisant à l’émergence de diverses formes et fonctions des tissus végétaux sont complexes et encore peu compris. Ma thèse de doctorat approfondie les principes mécaniques à la base de la formation des cellules épidermiques ondulées. Je me suis également penché sur l’étude des avantages mécaniques que confèrent les motifs imbriqués. Les cellules épidermiques sont constituées de deux parois cellulaires périclines parallèles reliées par des parois anticlines. Aux jonctions, les cellules épidermiques forment des cavités et des saillies imbriquées les unes aux autres. Des images en 3D, prises en microscopie confocale, de cotylédons marqués par des fluorophores spécifiques à la cellulose montrent une déposition accrue de cellulose au niveau des cavités des parois périclines s’étendant le long des parois anticlines. Le marquage des cotylédons par COS488 démontre également une plus grande abondance de pectines dé-estérifiées aux mêmes sites. J'ai développé des modèles par éléments finis de la déformation de la paroi cellulaire et simulé les disparités biochimiques en alternant les régions plus rigides à travers et au long des parois périclines des deux côtés d'une paroi anticline. Le modèle montre que les parois rigidifiées non déformables se développent en cavités lorsque la pression interne étire la paroi cellulaire. Le modèle suggère également la présence de contraintes mécaniques plus élevées au niveau des saillies. Les résultats du modèle indiquent qu'une boucle de rétroaction positive entre la contrainte et la rigidité de la paroi cellulaire générerait les formes ondulées à partir de différences infinitésimales de rigidité ou de contrainte de la paroi cellulaire. En outre, le modèle suggère que des événements de flambage stochastiques peuvent initier la morphogenèse des cellules. On a longtemps émis l'hypothèse que le motif imbriqué de cellules épidermiques améliore l'adhérence cellule-cellule et donc la résistance de traction de l'épiderme. L'étirage des feuilles d'Arabidopsis de type sauvage ou du mutant any1 (caractérisé par une réduction de l'ondulation cellulaire) n'a montré aucun détachement cellulaire en cas de rupture du tissu. J'ai émis l'hypothèse que les jonctions des cellules ondulantes renforcent la résistance de l'épiderme contre la propagation de fissures. J'ai observé une grande anisotropie dans la réponse mécanique à la rupture de l'épiderme d'oignon selon l’orientation des cellules. Les fissures qui suivent l’alignement des cellules se propagent sans trop de résistance, entraînant une rupture fragile du tissu. Ceci découlerait de la propagation de la ligne de rupture par suite du détachement des cellules. Les fissures se propagent difficilement lorsqu’elles sont perpendiculaires à l'axe principal des cellules. En fracturant des feuilles dont les cellules épidermiques sont ondulées, j'ai remarqué que les fissures se propageaient, par intermittence, à la fois au niveau des jonctions de la cellule et de la paroi cellulaire. J'ai émis l'hypothèse que ce motif de fracture d'épiderme à cellules ondulées se caractérisait par une augmentation de la résistance à la fracture. Pour n’étudier que les effets de la géométrie des cellules sur cette résistance, j’ai éliminé le rôle que jouerait l’anisotropie des matériaux en concevant des modèles physiques macroscopiques de l'épiderme. J’ai gravé au laser des motifs cellulaires sur du poly-méthacrylate de méthyle. De cette façon, le matériau isotrope permettait d'étudier uniquement l'effet de la géométrie cellulaire. Alors que la fracturation des spécimens de contrôle sans gravure et des spécimens avec des cellules gravées longitudinalement ont démontré une rupture fragile, une fracturation transversale aux rangées cellulaires, dans les modèles mimant des cellules d’oignon ou des cellules ondulées de cotylédons d’Arabidopsis, a montré une résistance accrue à la fracture. En conclusion, je démontre que la forme ondulée des cellules épidermiques est le résultat d’une distribution alternée de la rigidité dans la paroi cellulaire, un processus qui pourrait être initié par une anisotropie de stress stochastique due au flambement. De plus, ces formes cellulaires augmentent la résistance à la rupture de l'épiderme végétal en le protégeant contre la propagation des fissures; un mécanisme de défense ingénieux pour les surfaces les plus exposées. / Plant development entails cell division, cell growth and shaping, and the differentiation of meristematic cells into highly specialized cell types. Differentiation and cell shape are closely linked and involve the regulation of the mechanical properties of the cell wall. The mechanisms leading to the generation of the diverse array of shapes and functionalities found in plant tissues are perplexing and poorly understood. In my Ph.D. research, I investigated the mechanical principles underlying the formation of wavy leaf pavement cells. Further, I studied the putative mechanical advantage that emerges from the interlocking patterns. Epidermal pavement cells consist of two parallel periclinal walls connected by vertical anticlinal walls. At the borders, wavy pavement cells make interlocking indentations and protrusions. 3D confocal micrographs of cotyledons stained with cellulose-specific fluorophores revealed a significant accumulation of cellulose at the sites of indentation on the periclinal walls extending down the anticlinal walls. Staining the cotyledon samples with COS488 also suggested a higher abundance of de-esterified pectin at these sites. I developed finite element models of the cell wall deformation and simulated the biochemical inhomogeneities by assigning alternately stiffened regions across and along the periclinal walls on two sides of an anticlinal wall. It was observed that the non-deforming stiffened regions develop into sites of indentations when the internal pressure stretches the cell wall. The model also suggested higher stresses to associate with the neck regions. The model results indicate that a positive feedback loop between stress and cell wall stiffness could generate wavy shapes starting from infinitesimally small differences in cell wall stiffness or stress. Further, the model suggests that stochastic buckling events can initiate the cell shaping process. It has been long hypothesized that the interlocking pattern of pavement cells improves cell-cell adhesion and thus the tensile strength of the epidermis. Stretching to rupture the leaf samples of wild-type Arabidopsis or any1 mutant with reduced cell waviness did not show any cell detachment upon failure. However, I hypothesized the undulating cell borders could enhance the resistance of the epidermis against the propagation of damage. I observed a considerable anisotropy in the tear behavior of onion epidermis parallel and perpendicular to the cells’ main axis. Tears along the cell lines propagated without much resistance resulting in brittle failure of the tissue. This was observed to originate from tears propagating by cell detachment. Perpendicular to the cells’ main axis, tears had considerable difficulty in propagating. Fracturing the leaf samples with wavy epidermal cells, I noticed the cracks propagated in both the cell borders and the cell wall intermittently. I hypothesized that this pattern of fracture in the epidermis with wavy cells indicates an increase in the fracture toughness. To untangle the influence of material anisotropy from the cell geometry on fracture toughness, I designed macroscopic physical models of the epidermis by laser engraving the cell patterns on polymethylmethacrylate. This way, the isotropic material would allow studying only the effect of cell geometry. While fracturing the control specimens with no engraving and the specimens with longitudinally placed cells demonstrated a brittle fracture, fractures transverse to cell lines in the onion cell patterns or across the Arabidopsis cotyledon wavy cell pattern showed an increased fracture toughness. I suggest the wavy shape of pavement cells in the epidermis results from the alternate placement of stiffer regions in the cell wall, a process that can initiate from a stochastic stress anisotropy due to buckling. Further, these shapes increase the fracture toughness of the plant epidermis protecting it against the spread of damage; an ingenious defense mechanism at the most exposed surfaces.