Resumo: A leishmaniose visceral é uma doença imunomediada que pode causar alterações na população de linfócitos T em diferentes órgãos e tecidos, e também aumento de células inflamatórias no encéfalo de cães infectados. O objetivo deste estudo foi avaliar e caracterizar as lesões encefálicas por meio de análise de cortes histológicos do encéfalo e as subpopulações de linfócitos T CD4+, CD8+, duplo-positivos (DP), duplo-negativos (DN), TCRs αβ e δγ e células dendríticas (cd11c+/MHC-II+) provenientes de linfonodos regionais da cabeça e do linfonodo poplíteo de cães com leishmaniose visceral utilizando citometria de fluxo. Os resultados mostram que encéfalos de cães com LV podem apresentar infiltrados inflamatórios em região de leptomeninges, plexo coroide e região subependimária. Entre os linfonodos, não houve diferença entre as subpopulações de linfócitos T, porém, observamos redução dos linfócitos T CD8+ e aumento dos T DN e TCR δγ enquanto que os CD4+ e DP e TCR αβ mantiveram-se próximos a valores de cães saudáveis, sugerindo assim que os linfócitos DN e TCR δγ podem estar relacionados com a resposta imunológica de cães sintomáticos com LV. Todos esses achados descartam a hipótese de que os linfonodos regionais da cabeça poderiam apresentar um padrão de resposta imune específica relacionada com as lesões encefálicas dos cães / Abstract: - Visceral leishmaniasis (VL) is an immune-mediated disease which may cause changes in T lymphocytes population in different organs and tissues, and also an increase in the inflammatory cells population in the brain of infected dogs. The aim of this study was to evaluate the encephalic lesions in brain sections, and to characterize the T lymphocytes subsets CD4+, CD8+, double-positive (DP), double-negative (DN), the TCRs αβ and δγ, and the dendritic cells (CD11c+/MHC-II+) from the regional lymph nodes of the head and the popliteal lymph node using flow cytometry. The results evidenced that the brain of dogs with VL may present inflammatory infiltrates in leptomeninges, choroid plexus and subependymal area. Between the lymph nodes, there was no difference among the T cell subsets, nevertheless, there was noticed a reduction in the CD8+ lymphocytes and an increase in the DN subset as well as the TCR δγ, while CD4+, DP and TCR αβ were detected in amounts closely related to described reference ranges, which suggests that the DN and TCR δγ lymphocytes may be related to the immune response in symptomatic dogs. Altogether, these findings discard the hypothesis that the regional lymph nodes of the head may present a specific pattern of immune response related to the brain lesions in dogs with VL / Orientador: Gisele Fabrino Machado / Banca: Wagner Luis Ferreira / Banca: Antonio Carlos Alessi / Mestre

Resumo: A leishmaniose visceral é uma doença que causa manifestações clínicas variadas em cães, que podem apresentar desde alterações subclínicas a desordens generalizadas, incluindo alterações neurológicas. Há evidências do comprometimento das barreiras encefálicas, como a presença de infiltrado inflamatório com predomínio de linfócitos T CD3+ no sistema nervoso central. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi determinar e comparar os imunofenótipos de linfócitos T no sangue periférico e no liquor e avaliar as lesões encefálicas em cães infectados. Verificou-se que os linfócitos T presentes em maior quantidade no liquor foram os duplos negativos (DN) e os duplos positivos (DP), com predomínio de TCRαβ. Também verificou-se que as células sanguíneas não diferiram das células do liquor em quantidade, o que indica que pode estar havendo um comprometimento da barreira hematoliquórica, permitindo que as células do sangue migrem para o liquor. Ocorreu também o predomínio de infiltrado linfohistioplasmocitário no encéfalo, principalmente em leptomeninges. Porém, não houve correlação entre a inflamação nessa área e as células T. Além disso, a correlação positiva entre a inflamação no subepêndima e as células T DN do liquor indica que essas células chegam no encéfalo também pelos vasos subependimários. Em conjunto, os resultados contribuem para explicar a inflamação observada no encéfalo de cães com leishmaniose, sendo que as células T DN podem ser responsáveis pela progressão neurológica da doença / Abstract: Visceral leishmaniasis (VL) is a disease causing several clinical manifestations in dogs, that can present from subclinical to generalized disorders, including neurological disorders. There are evidences of cerebral barriers involvement, such as the presence of inflammatory infiltrate with predominance of CD3+ T cells in the brain of infected dogs. Therefore, the aim of this study was to determine and to compare the immunophenotypes of T lymphocytes in the peripheral blood and in the cerebrospinal fluid (CSF) of dogs with VL and evaluate the brain lesions. It was detected that the double negative (DN) and double positive (DP) T cells were present in higher percentage in the CSF, with predominance of TCRαβ. Besides, the amount of blood T cells did not differ from those observed in the CSF, indicating that the blood-CSF barrier may be damaged, allowing the migration of cells from the blood to the CSF. Moreover, inflammatory infiltrate with predominance of lymphohistioplasmacytic cells was observed, mainly in leptomeninges. However, there was no correlation between the intensity of the inflammation in this area and the T cells. Furthermore, the positive correlation between intensity of the inflammation in the subependimal area and DN T cells in the CSF indicates that these cells also may reach the brain through the subependymal vessels. Together, the results contribute to explain the inflammation observed in the brain of dogs with VL, where the DN T cells may contribute to the neurological progression of the disease / Orientador: Gisele Fabrino Machado / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Banca: Antonio Carlos Alessi / Mestre

Orientador: Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T00:09:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soares_LannyCristinaBurlandy_D.pdf: 1993850 bytes, checksum: c3f425ae548a166847fe87f0b24ad2b0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Em doenças causadas por microorganismos intracelulares como a tuberculose, criptococose e listeriose foi demonstrado que as células T CD8+ contribuem de forma relevante para o controle da infecção. Em trabalho anterior verificamos um aumento do número de linfócitos T CD8+ no lavado broncoalveolar de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, sugerindo um papel para estas células, cuja ação efetora se dá por meio da produção de citocinas como o IFN-? e atividade citotóxica. O presente estudo teve por objetivo verificar o estado de ativação e a produção de moléculas citotóxicas por linfócitos do sangue periférico (CD4+ e CD8+) de pacientes com PCM, indivíduos com PCM-Infecção e controles, tanto ex-vivo como in vitro, após estimulação com leveduras de P. brasiliensis. A expressão dos marcadores de ativação e moléculas citotóxicas foi avaliada por citometria de fluxo. A análise ex-vivo mostrou que, de maneira geral, os pacientes apresentam menor freqüência de células positivas para moléculas citotóxicas (granzima A, B e perforina), em relação aos indivíduos com PCM-infecção. A estimulação com leveduras de P. brasiliensis levou a um aumento discreto de células ativadas (CD69+) e uma redução na expressão de grânulos citotóxicos. A adição de IL-15 às culturas mostrou elevação da freqüência de células CD69+ apenas no grupo com PCM-infecção e controles. Já as células T CD4+ e CD8+ dos pacientes foram ativadas apenas na ausência do fungo. O efeito da adição de IL-15 na expressão dos grânulos foi pouco expressivo em relação à granzima A e B, mas maior freqüência de células CD8+perforina+ foi observada em indivíduos com PCM-infecção, em relação aos pacientes. Menor expressão do receptor para IL-15 (IL-15Ra) foi detectada em células T CD4+ de pacientes com PCM comparada ao grupo PCM-infecção e aos controles. A dosagem da granulisina sérica pela metodologia de ELISA mostrou níveis inferiores nos pacientes com PCM, comparado aos outros grupos. Além disso, os resultados mostraram uma tendência a um aumento de granulisina nos pacientes após terapia antifúngica. Em conjunto os resultados mostraram que os linfócitos de pacientes com PCM encontram-se em um estado de menor ativação, expressam menores quantidades do receptor para IL-15 e produzem níveis basais de grânulos citotóxicos (granzima A, B, perforina e granulisina). Estes fatores, ao lado de outros mecanismos que comprometem a imunidade celular, poderiam resultar em atividade citotóxica deficitária e, portanto, menor capacidade de lisar o fungo / Abstract: CD8+ T cells play a pivotal role in host defense against diseases caused by intracellular pathogens such as tuberculosis, cryptococcosis and listeriosis. In a previous study we verified an increased number of T CD8+ cells in bronchoalveolar lavage of patients with pulmonary paracoccidioidomycosis (PCM), suggesting a role for them in the local immune response. CD8+ T cells effector functions include cytokines production, mainly IFN-? and cytotoxic activity. The aims of this study were to verify the activation state as well as the production of cytotoxic molecules by peripheral blood lymphocytes (CD8+ and CD4+) from patients with PCM, individuals with PCM-infection and controls, both ex-vivo and in vitro after stimulation with P. brasiliensis yeast cells. The expression of activation and cytotoxic molecules was evaluated by flow cytometry. The ex-vivo analysis showed that, in general, the patients presented a lower frequency of granzime A, B and perforin-positive cells as compared to PCM-infection individuals. P. brasiliensis yeast cells stimulation led to a discrete increase in CD69+ cells and a reduction in cytotoxic granules expression in all groups. The addition of IL-15 to the cultures induced an increase in the frequency of CD69+ cells only in individuals with PCM-infection and controls. Differently, CD8+ and CD4+ T cells from PCM patients were activated only in the absence of fungal cells. The effect of IL-15 in granzyme A and B expression was low but a higher frequency of CD8+perforin+ was detected in individuals with PCM-infection than in patients with PCM. IL-15Ra expression was lower in CD4+ T cells from patients in relation to individuals with PCM-infection and controls. The detection of granulysin levels by ELISA showed lower levels in PCM patients than in individuals with PCM-infection and controls. Moreover, a tendency to a rise in granulysin levels was observed after antifungal therapy. Altogether the results showed that lymphocytes from PCM patients are poorly activated, express low levels of IL-15Ra and produce basal levels of cytotoxic granules (granzyme A, B, perforin and granulysin). These findings, in addition to other mechanisms that impair cellular immunity, may account to defective cytotoxic activity and consequently low capacity to kill the fungus / Doutorado / Ciencias Medicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Jose Andres Yunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T02:57:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ganazza_MonicaAparecida_M.pdf: 2462267 bytes, checksum: 471302ae0756c283d944a7545a0ff930 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais comum da infância. Os atuais protocolos de tratamento da LLA levam à cura em 70% dos casos e parte do sucesso se deve à aplicação de diferentes tratamentos para os pacientes estratificados em diferentes grupos de risco, segundo fatores prognóstico pré-tratamento (contagem leucocitária e idade ao diagnóstico). Contudo, pacientes considerados em remissão podem apresentar conteúdo substancial de células neoplásicas, chamada doença residual mínima (DRM), cuja proliferação está associada com a recaída da doença e que podem estar em níveis indetectáveis pelas técnicas convencionais de análise morfológica. Vários trabalhos têm mostrado que é possível prever a evolução clínica dos pacientes com base na DRM, porém, no protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento da Leucemia Infantil (GBTLI), a DRM não é utilizada como critério de realocação dos pacientes nos grupos de risco. Desta forma, o presente estudo objetivou (1) obter dados prospectivos de DRM com o uso de reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de rearranjos de genes de imunoglobulina (Ig) e receptores de células T (TCR); (2) comparar resultados de DRM com fatores prognósticos ao diagnóstico e de resposta utilizados nos protocolos do GBTLI e (3) avaliar o valor preditivo da DRM em pacientes tratados pelo protocolo GBTLI-99. No total, foram estudadas 91 amostras de LLA pediátrica classificadas e tratadas pelo protocolo GBTLI-99. Duas metodologias foram empregadas, metodologia do grupo brasileiro (91 casos) e metodologia Biomed-1 (78 casos), as quais são baseadas em PCR com primers consenso para as regiões VDJ das imunoglobulinas e TCR seguido por análise de formação de homo/heteroduplex. Ambos métodos mostraram-se tecnicamente factíveis, reprodutíveis e capazes de detectar marcadores moleculares para a análise da DRM na maioria dos casos, a saber, 2 ou mais marcadores de DRM em 85,7 e 76,9% do total das amostras analisadas, respectivamente. As mesmas metodologias foram aplicadas para a análise da DRM nos dias 14 e 28 da terapia de indução e demonstraram concordância de 96% na detecção da DRM. Gênero masculino, idade <1 e _ 9 anos, imunofenótipo LLA-T, classificação em alto risco, ausência de CD10, presença de blastos no dia 14, presença de mais de 5% de blastos leucêmicos na medula óssea (MO) do D14 e resposta ao tratamento associaram-se com DRM positiva no D14. Já DRM positiva no D28 mostrou estar associada com imunofenótipo LLA-T, ausência de calla (CD10), presença de mais de 5% de blastos leucêmicos na MO no D28 e resposta ao tratamento. O valor preditivo da DRM, nas condições testadas, mostrou-se pouco útil para casos classificados como sendo de risco baixo pelo GBTLI/99. Para casos de alto risco, entretanto, a ausência de DRM no D14 caracteriza um grupo de pacientes com sobrevida similar a pacientes de risco básico. Novos protocolos para análise da DRM foram propostos baseados nas metodologias aplicadas no presente estudo visando otimizar o tempo e minimizar os custos / Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common pediatric cancer. The recent ALL treatment protocols can achieve the complete remission in 70% of cases and this success is due to different treatments for patients stratified into different risk groups , according to pre-treatment prognostic factors (white count cells and diagnosis age). Therefore, patients considered in remission may have substantial contents of neoplasic cells, the minimal residual disease (MRD). The proliferation of such neoplasic cells is associated with disease relapse and they can be undeteced by conventional methods. It has been demonstrated that the clinical evolution of patients based on MRD can be forecasted. Therefore, in the Brazilian Group for Childhood Leukemia Treatment (GBTLI), MRD is not used as a reallocation criterion of patients in risk groups. The present study aimed to (1) obtain MRD data through the use of polymerase chain reaction (PCR) for the detection of immunoglobulin (Ig) and T cell receptor genes rearrangements (TCR); (2) compare the results of MRD with prognostic factors at diagnosis and response factors used in the GBTLI protocols and (3) estimate the predictive value of MRD in patients treated by the GBTLI-99 protocol. In total, 91 samples of pediatric ALL classified and treated with the GBTLI-99 protocol were studied using two methodologies: Brazilian group methodology (91 cases) and Biomed-1 methodology (78 cases), both using the consensus PCR primers for the immunoglobulin and TCR VDJ regions followed by homo/heteroduplex formation. These methods were feasible, reproducible and able to detect molecular markers for MRD analysis in most cases, since they provided the detection of two or more markers in 85,7% and 76,9% of the samples analyzed, respectively. The same methodologies were applied in the MRD analysis on days 14 and 28 of induction therapy and the results are in agreement in 96% of the MRD detection. Male, age (<1 e _ 9 years), immunophenotyping (T-ALL), high risk classification, calla (CD10) absence, presence of blasts in peripheral blood on day 14, presence of more than 5% of leukemic blasts in the bone marrow (BM) on day 14 of treatment response were associated with positive MRD on D14. Already, positive MRD on day 28 of treatment were associated with immunophenotyping (T-ALL), CD10 absence, presence of more than 5% of leukemic blasts in the BM on D28 and treatment response. MRD predictive value on the conditions tested proved to be useful for the patients classified by GBTLI/99 as basic risk. However, for high risk cases, the absence of MRD on D14 defines a new group of patients with similar survival to basic risk patients. New protocols to the MRD analysis were proposed based on methodologies applied in this study to optimize the time and minimize the costs / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Gisele Fabrino Machado / Resumo: O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão gênica do PD-1 e seu ligante PD-L1, e do FoxP3 em felinos com gengivoestomatite crônica (GCF). Adicionalmente, foi feita uma caracterização do perfil dos indivíduos acometidos com a enfermidade a fim de se verificar a associação entre os resultados encontrados com os aspectos clínicos das lesões e com as análises histopatológicas das lesões. Para tal, após avaliação clínica, foram colhidas amostras da mucosa oral de sete gatos acometidos por gengivoestomatite crônica e de sete gatos aparentemente saudáveis para controle. Também foi feita a coleta de sangue para extração do soro e swab orofaríngeo para triagem das principais viroses felinas como Calicivirus (FCV), Herpesvirus (FHV-1), Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV), Vírus da Leucemia Felina (FeLV) e Coronavirus (FCoV), assim como avaliação da função renal desses animais. O fragmento colhido foi dividido em duas partes, uma para processamento histopatológico e outra para PCR em tempo real. Foi realizada imuno-histoquímica para detecção do FCoV em específico nas lesões dos gatos com GCF. Como resultado, verificou-se que cinco dos sete gatos com a doença incluídos no estudo, eram machos, adultos, sem raça definida, castrados, viviam em ambiente com superlotação de animais, tinham acesso livre para a rua, se alimentavam de uma dieta mista composta por ração e comida caseira, e recebiam reforços anuais de vacinação. Cinco gatos com GCF eram negativos para FCV, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main objective of the present study was to evaluate the gene expression of PD-1 and its ligand PD-L1, and FoxP3, as immune response modulators, in cats diagnosed with feline chronic gingivostomatitis (FCGS). Additionally, it was performed a characterization of the feline profile with FCGS the association between the results found with clinical evalution of oral cavity as well as histopathological analysis. For this, oral mucosa samples were collected from seven cats with FCGS and seven from healthy cats. Previously, clinical evalution was done and oral lesion severety was scored by a system. Blood samples and oropharyngeal swabs were collected for major feline viruses screening, such as Calicivirus (FCV), Herpesvirus (FHV-1), Feline Immunodeficiency Virus (FIV), Feline Leukemia Virus (FeLV) and Coronavirus. (FCoV), and also, renal function evaluation. The oral mucosa fragment was divided into two parts, one for histopathological processing and another for RTPCR. Immunohistochemistry was performed to detect FCoV in lesions of cats with FCGS. As result, it was found that five of seven cats with FCGS included in the study were males, adults and mixed breed. All cats were neutered, lived in a multi-cat household, had an outdoor lyifestyle, received a mixed diet, and received routine booster immunizations. Five cats were negative for FCV, FHV- 1, FIV and FeLV infection, no one was positive for FCoV at immunohistochemistry. At histopathological evaluation, it was observed minim... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor