Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-22T06:44:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 241413.pdf: 1484767 bytes, checksum: c1e7cc0760e15a4730de832d5bec248f (MD5) / O aumento da concentração intracelular de guanosina monofosfato cíclico (cGMP) após a ativação da guanilil ciclase solúvel (sGC) é o principal mecanismo mediador do efeito antiproliferativo do óxido nítrico (NO) em células musculares lisas vasculares (CMLV). Entretanto, pouco se conhece sobre o efeito do NO na proliferação de células musculares lisas uterinas (CMLU). Além disso, a importância dos canais de potássio (CK) e de adenosina monofosfato cíclico (cAMP) na proliferação celular, nos levou a investigar a relação entre o NO, os nucleotídeos cíclicos e CK na proliferação de células musculares lisas vascular e uterina. Os doadores de NO (dois nitrosotióis, S-nitroso-N-acetil-D,L-penicilamina, SNAP, S-nitrosoglutationa, GSNO, e um nitrato orgânico, propano-1,2,3-triol trinitrato, GTN) inibiram a proliferação das células musculares lisas de maneira concentração-dependente sem induzir morte celular. O efeito citostático dos doadores pode ser inteiramente atribuído à liberação de NO, uma vez que nem NAP nem GSH (precursores não-nitrosilados dos nitrosotióis) interferiram na proliferação celular. A prevenção do efeito inibitório do NO na proliferação de CMLV por ODQ, um inibidor seletivo da sGC e por KT-5823, um inibidor da proteína quinase dependente de cGMP, PKG, bem como a prevenção do efeito antiproliferativo do 8-Br-cGMP, um análogo de cGMP permeável à membrana, pelo KT-5823, confirmaram que o NO inibe a proliferação da CMLV por um mecanismo dependente de cGMP e que a PKG é o alvo molecular mais importante deste nucleotídeo cíclico. Em contraste, ambos os compostos em nada interferiram com a inibição da proliferação de CMLU induzida por NO. A idêntica abundância do mRNA da sGC nos dois tipos de células musculares lisas e a prevenção do efeito antiproliferativo do BAY 41-2272 (um ativador da sGC) na CMLU por ODQ e KT-5823, demonstraram que o mecanismo de transdução de sinal sGC/cGMP/PKG pode ser mobilizado para reduzir a proliferação do músculo liso uterino, mas que o efeito do NO na proliferação da CMLU não está correlacionado com ativação da sGC, nem com o aumento da concentração intracelular de cGMP nem com a ativação da PKG. A prevenção dos efeitos antiproliferativos do NO e do isoproterenol (um agonista beta-adrenérgico e ativador clássico de adenilil ciclase, AC) na CMLU por SQ22536 (um inibidor seletivo de AC) e KT-5720 (um inibidor seletivo da proteína quinase dependente de cAMP; PKA), assim como a prevenção do efeito inibitório do dibutiril-cAMP (um análogo de cAMP permeável à membrana) por KT-5720, mostraram que o efeito do NO na proliferação da CMLU é mediado por ativação da AC, aumento da concentração intracelular de cAMP e ativação da PKA. Uma fração significativa do efeito antiproliferativo do NO nas células musculares lisas vascular e uterina também é mediada por CK uma vez que o tetraetilamônio, um bloqueador não-seletivo de CK, preveniu o efeito do NO. Contudo, o bloqueio do efeito inibitório do NO na proliferação das células musculares lisas por 4-aminopiridina (um bloqueador seletivo de CK dependente de voltagem) e por bloqueadores de canais de potássio dependentes de cálcio (iberiotoxina, caribdotoxina, apamina e clotrimazol) mostrou que a modulação de CK voltagem- e cálcio-dependentes parece ter a mesma importância para o efeito do NO na inibição da proliferação de ambas as células. Este achado está em contraste com a relevância dos canais ATP-dependentes apenas em CMLU, demonstrada pelo bloqueio do efeito do NO com a glibenclamida, um bloqueador seletivo de CK ATP-dependente. O efeito antiproliferativo do ativador de CK dependentes de cálcio (NS1619), confirmou o envolvimento destes canais no efeito inibitório do NO na proliferação da CMLV, da mesma forma que o cromakalim e o diazóxido (ativadores de CK ATP-dependente), confirmaram a participação deste tipo de canal no efeito inibitório do NO na proliferação de CMLU. Além disso, a prevenção completa do efeito antiproliferativo do NO na CMLV por combinação de concentrações sub-efetivas de ODQ e TEA, sugere que o NO inibe a proliferação do músculo liso através da fosforilação de CK. Assim, a reversão completa dos efeitos antiproliferativos de 8-Br-cGMP na CMLV e de Db-cAMP na CMLU por bloqueadores de CK indica que a fosforilação de CK deve ser relevante no efeito inibitório do NO na proliferação de ambas as células. Nossos dados também sugerem que CMLV incubadas com doadores de NO por um curto período de tempo formam reservas de nitrosotióis que mantém a atividade da sGC e a modulação de CK, causando um efeito antiproliferativo de longa duração do NO. Finalmente, o efeito inibitório do NO na proliferação foi mimetizado por nifedipina (um bloqueador de canal de cálcio) e revertido por A23187 (um ionóforo de cálcio) na CMLV, sugerindo que a modulação dos canais de potássio mediada por NO altera a sinalização de cálcio e inibe a proliferação celular. Em resumo, nossos resultados mostram que o efeito antiproliferativo do NO na CMLU depende de cAMP e ativação de PKA, apesar da presença e da funcionalidade do mecanismo de transdução de sinal sGC/cGMP/PKG, sugerindo a não-universalidade do paradigma NO/cGMP, pelo menos no que refere à inibição da proliferação de células musculares lisas. Além disso, o efeito antiproliferativo do NO também mobiliza diferentes subtipos de CK, através de mecanismos dependentes de nucleotídeos cíclicos e/ou nitrosilação.

Orientadora : Profª Drª Andréa Emilia Marques Stinghen / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 02/08/2013 / Inclui referências / Área de concentração: Microbiologia / Resumo: O p-cresol (PC) e seu conjugado p-cresilsulfato (PCS) sao toxinas uremicas de baixo peso molecular que quando ligadas a proteinas, sobretudo a albumina, podem desencadear via NF-ƒÈB a producao da quimiocina monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Essa quimiocina e responsavel pela quimioatracao de monocitos para a camada intima do vaso durante os eventos que precedem a aterosclerose. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro o papel do PC e PCS na expressao de MCP-1, via fator de transcricao NF-ƒÈB p65. O PCS foi sintetizado a partir da sulfatacao do PC com acido clorosulfonico e caracterizado por cromatografia de camada delgada (CCD). As concentracoes de PC e PCS utilizadas nos experimentos seguiu o preconizado pelo European Group of Uremic Toxins (EuTox). Sendo assim, utilizaram-se as concentracoes normais, PC1 (0,60 mg/L) e PCS1 (2,87 mg/L), minimas uremicas PC2 (20,10 mg/L) e PCS2 (15,60 mg/L) e maximas uremicas PC3 (40,70 mg/L) e PCS3 (47,20 mg/L). Como modelo experimental foram utilizadas celulas musculares lisas humanas (VSMC) extraidas atraves de digestao enzimatica de veia de cordao umbilical. A fim de avaliar a viabilidade das celulas frente as toxinas foi realizado o ensaio de MTT. Para verificar a expressao de MCP-1, as celulas foram tratadas com PC e PCS em cinetica de 0 e 3 horas nas concentracoes descritas acima. Para fins de comparacao, as VSMC tambem foram tratadas com 1 ƒÊg/mL de lipopolissacarideo (LPS), outra conhecida toxina uremica de baixo peso molecular. Todos os ensaios foram realizados na presenca e ausencia de inibidor da via NF-ƒÈB p65. Atraves do ensaio de MTT verificou-se que nao houve diferenca significativa na viabilidade celular entre o controle e todas as concentracoes testadas de PC e PCS. As VSMC expostas a PC2 e PC3 produziram niveis significativos de MCP-1 apos 3h de tratamento (149,8 } 16 pg/mL, p<0,001 e 143,5 } 28,7 pg/mL, p<0,05 respectivamente) quando comparados ao tempo 0h. PCS3 estimulou de forma mais intensa a producao de MCP-1 do que as VSMC tratadas com PC3 (162,7 } 7,5 pg/mL vs 143,7 } 28 pg/mL, p<0,005) em 3h. Na presenca do inibidor de NF-ƒÈB p65, houve uma diminuicao significativa na producao de MCP-1 apos o tratamento por 3h com PC2 (149,8 } 16 pg/mL vs 36,4 } 10,5 pg/mL; p<0,001) e PC3 (143,6 } 28 pg/mL vs 50 } 18 pg/mL; p<0,05). Apos tratamento com PCS1 houve diferenca significativa nos niveis de MCP-1 na presenca de inibidor (156,49 } 15,9 pg/mL vs 102,3 } 4,6 pg/mL; p<0,05). Apos 3h de tratamento com LPS, nao houve producao significativa de MCP-1 em relacao ao controle (35,5 } 8,9 pg/mL vs 34 } 8,9 pg/mL). Ainda, na presenca do inibidor, verificou-se uma leve diminuicao nos niveis de MCP-1, porem nao significativa (35,5 } 8,9 pg/mL vs 25,6 } 6,5 pg/mL). Com base em nossos resultados, concluimos que apesar de PC e PCS nao serem citotoxicas, induzem a expressao de niveis significativos de MCP-1, sendo o PCS mais efetivo na inducao da expressao de MCP-1 que seu precursor PC. Assim como PC e PCS, LPS tambem ativa a producao de MCP-1 via NF-ƒÈB. Desta forma sugerimos que a inibicao da via NF-ƒÈB p65 poderia diminuir niveis de MCP-1 e consequentemente a progressao do desenvolvimento da aterosclerose na DRC. Palavras chave: doenca renal cronica, toxicidade uremica, p-cresol, p-cresilsulfato, LPS, MCP-1 e NF-ƒÈB. / Abstract: p-cresol (PC) and its conjugate p-cresyl sulfate are low molecular weight uremic toxins that when attached to proteins, especially albumin, can trigger via NF-êB the production of chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). This chemokine is responsible for monocytes chemoattraction to the vessel intimal layer during the events that precede atherosclerosis. Thus, the aim of this study was to investigate the in vitro role of PC and PCS in MCP-1 expression via transcription factor NF-êB p65. PCS was synthesized from PC sulfation with chlorosulphonic acid and characterized by thin layer chromatography (TLC). The PCS and PC concentrations were used according to the recommendations of the European Uremic Toxins Work Group (EuTox). So we used normal, PC1 (0.60 mg/L) and PCS1 (2.87 mg/L), uremic minimum PC2 (20.10 mg/L) and PCS2 (15.60 mg/L) and maximum uremic concentrations PC3 (40.70 mg/L) and PCS3 (47.20 mg/L). As experimental model we used human smooth muscle cells (VSMC) extracted by enzymatic digestion of umbilical cord vein. In order to assess the cells viability after toxins treatment, MTT assay was performed. To verify MCP-1 expression, cells were treated with PC or PCS in a kinetics of 0 and 3 h using the concentrations described above. For comparison purposes, the VSMC were also treated with lipopolysaccharide (LPS) (1 ìg/mL), other low molecular weight uremic toxin. All assays were performed in the presence and absence of NF-êB p65 inhibitor pathway. MTT assay showed that there was no significant difference in cell viability between control and all concentrations of PC and PCS tested. VSMC exposed to PC2 and PC3 produced significant levels of MCP-1 after 3h treatment (149.8 ± 16 pg/mL, p<0.001, and 143.5 ± 28.7 pg/mL, p<0.05 respectively) when compared to time 0h. PCS3 stimulated more intensively MCP-1 production in VSMC treated with the PC3 (162.7 ± 7.5 pg/mL vs 143.7 ± 28 pg/mL, p<0.005) after 3h. In the presence of NF-êB p65 inhibitor, there was a significant decrease in MCP-1 production after 3h treatment with PC2 (149.8 ± 16 pg/mL vs 36.4 ± 10.5 pg/mL, p<0.001) and PC3 (143.6 ± 28 pg/mL vs 50 ± 18 pg/mL, p<0.05). After PCS1 treatment there was a significant difference in MCP-1 levels in the presence of inhibitor (156.49 ± 15.9 pg/mL vs 102.3 ± 4.6 pg/mL, p<0.05). Finally after 3h treatment with LPS, there was no significant production of MCP-1 compared to control (35.5 ± 8.9 pg/mL vs 34 ± 8.9 pg/mL), and , in the presence of the inhibitor, there was a slightly decrease in MCP-1 levels, but not significantly (35.5 ± 8.9 pg/mL vs. 25.6 ± 6.5 pg/mL). Based on our findings, we concluded that in spite of PCS and PC are not cytotoxic, they induce significantly MCP-1expression and PCS is more effective than its precursor PC. As PC and PCS, LPS also activates MCP-1 production via NF-êB. Therefore, we suggest that the inhibition of NF-êB could decrease MCP-1 levels and hence the development of atherosclerosis progression of CKD. Keywords: chronic kidney disease, uremic toxicity, p-cresol, p-cresyl sulfate, LPS, MCP-1 and NF-êB.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-23T17:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 248604.pdf: 837714 bytes, checksum: 019309fd773e7f81d605fc584437ac7a (MD5) / A proteína celular do prion (PrPC) é expressa em vários tipos celulares, especialmente em neurônios. Sua função fisiológica é desconhecida, no entanto, seu papel no desenvolvimento das doenças neurodegenerativas foi bem descrito, as quais resultam de uma mudança conformacional da PrPC para a forma scrapie (PrPSC). Vários estudos têm mostrado uma associação entre a PrPC, o metabolismo do cobre e a atividade antioxidante da superóxido dismutase (SOD). Contudo, os processos celulares envolvendo a PrPC, neste contexto, permanecem indefinidos. Considerando que o padrão de expressão protéica da SOD em vasos lesados foi similar ao verificado no cérebro de camundongos knockout para a PrPC, a hipótese do presente estudo foi que alterações da expressão da PrPC levariam à anormalidade da regulação do cobre e induziriam sub-atividade da SOD da parede vascular. Assim, nossos objetivos foram estudar se a expressão da PrPC sofre indução por agentes que desencadeiam o estresse do retículo endoplasmático (RE) e determinar seu envolvimento no que se refere à atividade da SOD. Análises de western blotting e RT-PCR foram usadas para determinar a ocorrência de alteração da expressão da PrPC na presença de estresse do RE. Células musculares lisas de aorta de coelho foram cultivadas por diferentes períodos de tempo (4, 8 e 18 horas), com agentes estressores do RE, angiotensina II (AngII, 100 nM), tunicamicina (Tn, 5 g/mL) e 7-cetocolesterol (7kc, 5 g/mL). A atividade da SOD foi determinada pelo método de inibição da redução do citocromo c, e a atividade basal da SOD foi 13,9 1,2 U/mg de proteína. O estresse do RE produziu diminuição significativa na atividade da SOD após incubação por 4 horas com Tn (29%) e 7kc (12%), 8 horas com Tn (37%), bem como, após 18 horas com AngII (42%) e 7kc (32%); inversamente, foi observado um aumento significativo na atividade da SOD nas células expostas a AngII (41%) durante 8 horas. A concentração celular de cobre, determinada através de espectroscopia de absorção atômica, foi cerca de 9 vezes maior nas células estimuladas com AngII por 8 horas. As análises de western blotting para as isoenzimas da SOD mostraram um perfil variado de expressão, em todos os tempos de incubação com os diferentes estímulos, que não se correlacionou com a atividade enzimática. A expressão da PrPC diminuiu após a exposição a todos os estímulos nos diferentes tempos de incubação. Os ensaios de RT-PCR mostraram aumento da expressão do mRNA para PrPC apenas nas células estimuladas durante 8 horas com os diferentes agentes estressores. A expressão do mRNA para PrPC também foi avaliada em fragmentos de artérias ilíacas de coelhos submetidos à lesão por cateter balão, com sobrevida de 7 e 14 dias, bem como logo após a lesão. Neste ensaio, a expressão do mRNA para PrPC apresentou aumento pronunciado no grupo avaliado logo após a lesão. Os resultados obtidos com os modelos de estresse do RE vascular aqui utilizados não demonstraram um perfil de atividade antioxidante para a PrPC. O que não descarta a hipótese desta proteína estar envolvida em outro tipo de resposta celular frente ao estresse oxidativo. Palavras-chave: superóxido dismutase, proteína celular do prion, estresse do retículo endoplasmático, células musculares lisas de aorta de coelho.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:59:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 328682.pdf: 1289481 bytes, checksum: d3c73b57b619fdfc6698fa38bc425b09 (MD5) Previous issue date: 2014 / Doenças cardiovasculares são uma das principais causas de mortalidade em muitas partes do mundo, com a aterosclerose figurando como principal causa de oclusão coronariana, acidente vascular cerebral e aneurisma da aorta. A veia safena é a prótese vascular mais comumente usada para enxertos vasculares de pequeno calibre (< 6 mm). No entanto, 10% -40% dos pacientes não têm uma veia safena adequada para substituição de prótese devido à incompatibilidade de tamanho ou doença venosa. Abordagens de engenharia de tecidos estão sendo usadas para desenvolver métodos paliativos para essas patologias, como a construção de vasos sanguíneos artificiais. Este trabalho teve como objetivo a biossíntese de vasos artificiais a partir de celulose bacteriana (CB) produzida por Gluconacetobacter hansenii. Os vasos obtidos exibiram propriedades mecânicas comparáveis às dos vasos nativos e sua análise morfológica mostrou a presença de fases ligadas entre si, uma superfície densa e outra porosa, imitando a túnica íntima e média dos vasos nativos, respectivamente. A cultura in vitro das células musculares lisas de aorta humana no interior dos vasos de CB demonstrou a sua capacidade de suportar a colonização celular, tendo as células permanecido viáveis após 14 dias de cultura e apresentando uma morfologia alongada. Os vasos colonizados por sete dias seguiram para um reator de fluxo pulsante, onde permaneceram por mais sete dias em condição dinâmica. O vaso de celulose tecidual muscular apresentou a formação de uma monocamada confluente e direcionada paralelamente à direção do fluxo contínuo. Em condições de cultura dinâmica as células apresentaram maior viabilidade e capacidade de proliferação do que no controle estático, indicando que o ambiente celular propiciado pelo reator de perfusão mimetizam aqueles encontrados no sistema vascular natural. Estes vasos de CB constituem uma plataforma para aplicações como biorreator tecidual, permitindo ensaios com células e outros agentes terapêuticos, através de interações com a monocamada de células confluentes que responde à estimulação dinâmica de fluxo pulsante.<br> / Abstract : Cardiovascular diseases are one of the main causes of mortality in many parts of the world, with atherosclerosis figuring as the principal cause of coronary occlusion, stroke and aortic aneurysm. Saphenous vein is the most commonly used vascular prosthesis for small-caliber (< 6 mm) vascular grafts, however, 10%?40% of patients do not have a saphenous vein suitable for prosthetic replacement due to size mismatch or venous disease. Tissue engineering approaches are being used to develop palliative methods for these pathologies such as the construction of artificial blood vessels. Here we describe the biosynthesis of artificial blood vessels using Gluconacetobacter hasenii?s bacterial cellulose (BC) as scaffolding. The vessels obtained exhibited morphological and mechanical properties similar to native vessels and their morphology showed the presence of a dense and a porous phase, connected as a basis to mimic the intimal and medial layers of a blood vessel, respectively. In vitro cultures of human aortic smooth cells HASMCs in the presence of cellulose tubular scaffolds demonstrated their ability to support cell colonization, with cells remaining viable after 14 days of culture and showing an elongated morphology. Vessels colonized for seven days were placed in a pulsed flow reactor, where they remained for another seven days in dynamic condition. The cellulose muscle tissue vessel showed the formation of a confluent monolayer oriented parallel to direction in the continuous flow. In the interior of the vessels, cells in dynamic culture condition showed greater proliferation and cell viability compared to the static control. These BC vessels have proved to be a promising platform for the development of an in vivo-like bioreactor, allowing cell and drug assays on the confluent cell monolayer which responds to the dynamic stimulation of pulsatile flow.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T13:04:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-19Bitstream added on 2014-06-13T20:11:37Z : No. of bitstreams: 1 assuncao_pcf_me_botfmvz_parcial.pdf: 85672 bytes, checksum: b2768cf7237b3ea1289fafe37d1af5d3 (MD5) / O exercício de alta intensidade em animais está associado à lesão de células musculares e à indução da resposta de fase aguda (RFA). Uma das alterações provocada por esta RFA é o estimulo da síntese de proteínas de fase aguda pelo fígado e por órgãos extra-hepáticos. Esta RFA é rápida e não específica. Foram utilizados dez equinos das raças Puro sangue Árabe (n=5) e Crioula (n=5), submetidos a testes de exercício de rápida aceleração e curta duração predominantemente anaérobico (TRA) e exercícios de baixa intensidade e longa duração (TLD) predominantemente aeróbico em esteira. Amostras de sangue venoso foram colhidas antes do inicio do exercíco (T0) e em diferentes momentos após o exercício: imediatamente após (T1), 30 minutos (T2), 03h (T3), 12h (T4), 24h (T5) e 48h (T6) após o exercício. A avaliação dos protocolos de exercício baseou-se na avaliação da atividade sérica de creatina quinase (CK) e na dosagem de fibrinogênio e proteínas de fase aguda por SDS-PAGE. Observou-se diminuição nas concentrações de haptoglobina (p˂0,05) no TRA, entre os momentos T1 e T2 e entre T1 e T4 após a prática do mesmo. As concentrações de albumina apresentaram aumento (p<0,05) no T2, no protocolo TLD. Os valores de α-1 glicoproteína ácida apresentaram aumento significativo (p<0,05) quando comparados os protocolos TRA E TLD no T2 / The high intensity exercise in animals is associated with muscle cell lesions and an acute phase response (APR). One of the changes promoted by this APR is the stimulus to produce acute phase proteins by the liver and extrahepatic organs. This APR is fast and non-specific. Ten horses were used: five Arabian breed and five Creole breed. These animals were submitted to rapid acceleration and short duration exercises (TRA) and low intensity and long duration exercises on treadmill. Blood samples were obtained before (T0) and in different moments after exercise: immediately after (T1), 30 minutes(T2), 3 hours(T3), 12 hours(T4), 24 hours (T4)and 48 hours(T5) after the exercises. To evaluate the different exercise protocols, the creatine kinase serum activity and fibrinogen concentration were determined. Serum electrophoresis was also performed by means of SDS-PAGE. Observed a decrease in the concentrations of haptoglobin (p ˂ 0.05) in TRA, between T1 and T2 and between T1 and T4 after practice the same. Albumin concentrations showed an increase (p <0.05) in T2, the protocol TLD. The values of α 1-acid glycoprotein showed a significant increase (p <0.05) when compared protocols TRA AND TLD in T2

Orientador: Elizabeth Moreira dos Santos Schmidt / Banca: José Jurandir Fagliari / Banca: Marcos Jun Watanabe / Resumo: O exercício de alta intensidade em animais está associado à lesão de células musculares e à indução da resposta de fase aguda (RFA). Uma das alterações provocada por esta RFA é o estimulo da síntese de proteínas de fase aguda pelo fígado e por órgãos extra-hepáticos. Esta RFA é rápida e não específica. Foram utilizados dez equinos das raças Puro sangue Árabe (n=5) e Crioula (n=5), submetidos a testes de exercício de rápida aceleração e curta duração predominantemente anaérobico (TRA) e exercícios de baixa intensidade e longa duração (TLD) predominantemente aeróbico em esteira. Amostras de sangue venoso foram colhidas antes do inicio do exercíco (T0) e em diferentes momentos após o exercício: imediatamente após (T1), 30 minutos (T2), 03h (T3), 12h (T4), 24h (T5) e 48h (T6) após o exercício. A avaliação dos protocolos de exercício baseou-se na avaliação da atividade sérica de creatina quinase (CK) e na dosagem de fibrinogênio e proteínas de fase aguda por SDS-PAGE. Observou-se diminuição nas concentrações de haptoglobina (p˂0,05) no TRA, entre os momentos T1 e T2 e entre T1 e T4 após a prática do mesmo. As concentrações de albumina apresentaram aumento (p<0,05) no T2, no protocolo TLD. Os valores de α-1 glicoproteína ácida apresentaram aumento significativo (p<0,05) quando comparados os protocolos TRA E TLD no T2 / Abstract: The high intensity exercise in animals is associated with muscle cell lesions and an acute phase response (APR). One of the changes promoted by this APR is the stimulus to produce acute phase proteins by the liver and extrahepatic organs. This APR is fast and non-specific. Ten horses were used: five Arabian breed and five Creole breed. These animals were submitted to rapid acceleration and short duration exercises (TRA) and low intensity and long duration exercises on treadmill. Blood samples were obtained before (T0) and in different moments after exercise: immediately after (T1), 30 minutes(T2), 3 hours(T3), 12 hours(T4), 24 hours (T4)and 48 hours(T5) after the exercises. To evaluate the different exercise protocols, the creatine kinase serum activity and fibrinogen concentration were determined. Serum electrophoresis was also performed by means of SDS-PAGE. Observed a decrease in the concentrations of haptoglobin (p ˂ 0.05) in TRA, between T1 and T2 and between T1 and T4 after practice the same. Albumin concentrations showed an increase (p <0.05) in T2, the protocol TLD. The values of α 1-acid glycoprotein showed a significant increase (p <0.05) when compared protocols TRA AND TLD in T2 / Mestre

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-05-24T17:40:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338128.pdf: 2873785 bytes, checksum: 55675b858483a8a04254782459b2cae6 (MD5) Previous issue date: 2015 / O mecanismo pelo qual a disfunção vascular séptica é iniciada, e como baixas concentrações de óxido nítrico (NO) podem estar relacionadas às vias de sinalização dos receptores de glicocorticoides (GR), são pouco entendidas. Os objetivos desse trabalho foram avaliar como a produção inicial de NO, induzida por lipopolissacarídeo (LPS), pode interferir na ativação de células musculares lisas obtidas de aorta de ratos (A7r5) e na distribuição celular dos GR. Células A7r5 estimuladas com LPS e Interferon-? (IFN) apresentaram um rápido (em minutos) aumento na produção de NO e ânion superóxido, formando peroxinitrito, e posterior ativação do NF-kB, expressão da NOS-2 e acúmulo de nitrito no sobrenadante celular. A inibição da NO sintase (NOS) e NADPH oxidase (NOX), ou o sequestro do NO e do ânion superóxido, diminuíram todos estes eventos. O silenciamento das enzimas envolvidas demonstrou que apenas a ativação das isoformas NOS-1 e NOX-1 são importantes para a expressão da NOS-2 nas células A7r5. O pré-tratamento de ratos adrenalectomizados (ADX) com 7-nitroindazol (7-NI), antes do desafio com LPS reduziu os níveis plasmáticos de IL-6 e de NOx, diminuiu a translocação nuclear de GR e reduziu a mortalidade induzida por LPS em 65%. Observou-se que a translocação nuclear de GR mediada pelo pulso de NO e peroxinitrito depende da integridade do domínio de dimerização do GR, pois não foi observada translocação de GR em fibroblastos de camundongos deficientes na dimerização de GR (GRdim/dim), bem como o pré-tratamento com 7-NI não preveniu a mortalidade destes camundongos quando desafiados com LPS. Dessa forma, concluímos que a rápida formação de NO, ânion superóxido e peroxinitrito, derivados da atividade da NOS-1 e da NOX-1, respectivamente, atuam como agentes sinalizadores para a expressão da NOS-2 através da ativação de NF-kB, sendo importantes para o início da disfunção vascular séptica. Além disso, demonstramos de forma inédita que este pulso de espécies reativas participa de uma nova via de translocação nuclear de GR induzida por LPS/IFN, na ausência de corticoides. Esta nova via pode ser importante para ajudar a entender as causas da falha dos glicocorticoides em conter a inflamação em fases avançadas da sepse. Palavras-chave: células musculares lisas vasculares, óxido nítrico, óxido nítrico sintases, peroxinitrito, receptores de glicocorticoides, translocação nuclear.<br> / Abstract : The mechanism whereby the vascular dysfunction is initiated, and how low concentrations of nitric oxide (NO) are related to glucocorticoid receptors (GR) signaling pathways are poorly understood. The objectives of this study were to understand how an initial NO release induced by lipopolysaccharide (LPS) could interfere with the activation of smooth muscle cells from rat aorta (A7r5) and cellular distribution of GR. A7r5 cells stimulated with LPS and interferon-? (IFN) showed a rapid (within minutes) increase in NO and superoxide production, forming peroxynitrite with subsequent NF-kB activation, NOS-2 expression and nitrite accumulation in cell supernatant. The inhibition of NO synthase (NOS) and NADPH oxidase (NOX) or the scavenging of NO and superoxide anion, decreased all these events. The silencing of involved enzymes showed that only the activation of NOS-1 and NOX-1 isoforms are important for the expression of NOS-2 in A7r5 cells. Pretreatment of adrenalectomized (ADX) rats with 7-nitroindazole (7-NI) before LPS challenge, reduced the plasma levels of IL-6 and NOx, decreased nuclear translocation of GR and reduced mortality induced by LPS in 65%. It was observed that the nuclear translocation of GR mediated by the NO and peroxynitrite pulse depends on the integrity of the dimerization domain of the receptor, once GR translocation in fibroblasts obtained from GR dimerization deficient mice (GRdim/dim) was not observed. Also, pre-treatment with 7-NI did not prevent the death of these mice when they were challenged with LPS. Thus, we conclude that rapid formation of NO, superoxide and peroxynitrite derived from the activity of NOS-1 and NOX-1, respectively, act as signaling agents for the expression of NOS-2 through the activation of NF-kB, being important for the initiation of septic vascular dysfunction. Furthermore, we demonstrated for the first time that this pulse of reactive species participate in a new route of GR nuclear translocation induced by LPS/IFN, in the absence of steroids. This new pathway may be important to help understand the causes of glucocorticoids failure to contain inflammation in advanced stages of sepsis.