Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-14Bitstream added on 2014-06-13T18:20:00Z : No. of bitstreams: 1 delfiol_djz_me_botfmvz.pdf: 582216 bytes, checksum: 773e9de40b6bbe5e492ca1d83c32e1f4 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Em ovinos o excesso de enxofre na dieta é apontado como uma das principais causas de polioencefalomalacia (PEM). Na literatura nacional relatos de PEM induzida por enxofre em ovinos são escassos. O objetivo desta dissertação foi induzir PEM em ovinos fornecendo uma dieta rica em carboidratos e com diferentes níveis de enxofre e realizar avaliações clínicas e laboratoriais. Foram utilizados 18 ovinos divididos em três grupos (G1, G2 e G3) que receberam diferentes níveis de enxofre na dieta 0,2%, 0,9% e 1,2% respectivamente. Exames clínicos (frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal e motricidade ruminal) e laboratoriais (concentração de sulfeto de hidrogênio ruminal, hemogasometria venosa, pH do fluído ruminal, concentração de cobre sérico e hepático, tomografia computadorizada, necropsia e histopatológico) foram realizados em diferentes momentos. A temperatura retal, hemogasometria venosa e pH do fluido ruminal estavam dentro dos valores de referência para a espécie. Taquicardia e taquipnéia foram observadas nos três grupos. A motricidade ruminal estava diminuída nos grupos G2 e G3 em relação ao G1. Quanto maior a ingestão de enxofre, menor foram os níveis de cobre sérico e hepático detectados nos ovinos. Elevados valores de sulfeto de hidrogênio foram detectados nos grupos G2 e G3. Nenhum animal apresentou sinais clínicos de PEM. Na tomografia computadorizada, necropsia e exame histopatológico do sistema nervoso central, nenhuma alteração compatível com PEM foi observada. É provável que algum outro fator pode estar associado ao excesso de enxofre na dieta para que os ovinos desenvolvam PEM / The excess sulfur intake in sheep is described as major cause of polioencephalomalacia (PEM). In the national literature are scarce reports of sulfur induced PEM in sheep. This work aimed to feed sheep using a rich carbohydrate diet supplemented with different levels of sulfur in order to induce PEM, and to perform clinical and laboratory tests. Eighteen sheep were divided into three groups (G1, G2, and G3) and supplemented with 0.2%, 0.9% and 1.2% sulfur in diet, respectively. Clinical evaluation (i.e., heart rate, respiratory rate, rectal temperature and rumen motility) and laboratory exams (i.e., ruminal hydrogen sulfide concentration, venous gas analysis, ruminal pH, serum and liver copper concentration, computed axial tomography, necropsy, and histopathological examination) were performed. Rectal temperature, venous gas and ruminal pH were within normal limits. Tachycardia and tachypnea were observed in the three groups. Rumen motility was decreased in groups G2 and G3 when compared with G1. The higher the sulfur intake, the lower the serum and liver levels of copper. Increased ruminal hydrogen sulfide concentration was detected in G2 and G3. None of the animals had clinical signs of PEM. Computed axial tomography, necropsy, and histopathological examination of the central nervous system showed no evidence of PEM. It is thought that other factors are associated with excessive sulfur consumption for a PEM outbreak to occur in sheep

Orientador: Alexandre Secorun Borges / Banca: Roberto Calderon Gonçalves / Banca: José Augusto Bastos Afonso da Silva / Resumo: Em ovinos o excesso de enxofre na dieta é apontado como uma das principais causas de polioencefalomalacia (PEM). Na literatura nacional relatos de PEM induzida por enxofre em ovinos são escassos. O objetivo desta dissertação foi induzir PEM em ovinos fornecendo uma dieta rica em carboidratos e com diferentes níveis de enxofre e realizar avaliações clínicas e laboratoriais. Foram utilizados 18 ovinos divididos em três grupos (G1, G2 e G3) que receberam diferentes níveis de enxofre na dieta 0,2%, 0,9% e 1,2% respectivamente. Exames clínicos (frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal e motricidade ruminal) e laboratoriais (concentração de sulfeto de hidrogênio ruminal, hemogasometria venosa, pH do fluído ruminal, concentração de cobre sérico e hepático, tomografia computadorizada, necropsia e histopatológico) foram realizados em diferentes momentos. A temperatura retal, hemogasometria venosa e pH do fluido ruminal estavam dentro dos valores de referência para a espécie. Taquicardia e taquipnéia foram observadas nos três grupos. A motricidade ruminal estava diminuída nos grupos G2 e G3 em relação ao G1. Quanto maior a ingestão de enxofre, menor foram os níveis de cobre sérico e hepático detectados nos ovinos. Elevados valores de sulfeto de hidrogênio foram detectados nos grupos G2 e G3. Nenhum animal apresentou sinais clínicos de PEM. Na tomografia computadorizada, necropsia e exame histopatológico do sistema nervoso central, nenhuma alteração compatível com PEM foi observada. É provável que algum outro fator pode estar associado ao excesso de enxofre na dieta para que os ovinos desenvolvam PEM / Abstract: The excess sulfur intake in sheep is described as major cause of polioencephalomalacia (PEM). In the national literature are scarce reports of sulfur induced PEM in sheep. This work aimed to feed sheep using a rich carbohydrate diet supplemented with different levels of sulfur in order to induce PEM, and to perform clinical and laboratory tests. Eighteen sheep were divided into three groups (G1, G2, and G3) and supplemented with 0.2%, 0.9% and 1.2% sulfur in diet, respectively. Clinical evaluation (i.e., heart rate, respiratory rate, rectal temperature and rumen motility) and laboratory exams (i.e., ruminal hydrogen sulfide concentration, venous gas analysis, ruminal pH, serum and liver copper concentration, computed axial tomography, necropsy, and histopathological examination) were performed. Rectal temperature, venous gas and ruminal pH were within normal limits. Tachycardia and tachypnea were observed in the three groups. Rumen motility was decreased in groups G2 and G3 when compared with G1. The higher the sulfur intake, the lower the serum and liver levels of copper. Increased ruminal hydrogen sulfide concentration was detected in G2 and G3. None of the animals had clinical signs of PEM. Computed axial tomography, necropsy, and histopathological examination of the central nervous system showed no evidence of PEM. It is thought that other factors are associated with excessive sulfur consumption for a PEM outbreak to occur in sheep / Mestre

Orientador: Cláudio Aparecido Casatti / Resumo: As teneurinas (TENs) pertencem a uma família de proteínas transmembrana do tipo II constituída por quatro membros homólogos, estruturalmente conservados entre as espécies. Essas proteínas estão presentes no SNC, principalmente durante a neurogênese, colaborando na estabilização dos circuitos neurais. Estudos neuroanatômicos mostraram que as TENs apresentam distribuição similar em peixes, aves e roedores durante o desenvolvimento e maturação do SNC, permanecendo em algumas regiões em animais adultos. A participação das TENs durante reparação tecidual tem sido pobremente explorada; entretanto a presença neurestina (uma proteína homóloga a Ten-2) foi notada em neurônios do bulbo olfatório de ratos adultos, após indução de lesão química na mucosa olfatória. O propósito do presente estudo foi verificar possíveis alterações na Ten-2 após indução de lesão mecânica no córtex cerebral de ratos adultos empregando técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR convencional). Para isso, ratos machos adultos (Rattus norvegicus, n=32) foram divididos em grupo controle (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 12 horas pós-operatório (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 24 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR) e grupo lesão 48 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR). A lesão mecânica foi realizada usando agulha hipodérmica de metal (0,8mm de diâmetro) acoplada ao aparelho estereotáxico (coordenadas AP: +10,21 mm; DV: -2,5 mm e ML: +1,5 mm). Os animais do grupo controle não foram submetidos aos pr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Teneurins (TENs) constitute a type II transmembrane protein family with four homologues structurally preserved among the species. These proteins are present in the central nervous system (CNS), mainly during neurogenesis, collaborating in the establishment of neuronal circuits. Neuroanatomic studies showed that TENs have compatible distribution among fish, chicken and rodents, during development and maturation of the CNS, remaining in a few regions in adult animals. The participation of TENs during tissue repair in the CNS has been scarcely explored; however, the unusual presence of neurestin (a homologue Ten-2 protein) was noticed in neurons of adult rat olfactory bulb, after chemically induced lesion in the olfactory mucosa. The purpose of the present study was to verify possible Ten-2 alterations after induced mechanical lesion in the adult rat cerebral cortex using immunohistochemistry (IHQ) and conventional polymerase chain reaction (PCR) techniques. For this, adult male rats (Rattus norvegicus, n=32) were divided into control group (n=4, IHQ; n=4, PCR) and 12h lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR), 24h lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR) and 48h postoperatory lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR) groups. The mechanical lesion was created using a hypodermic metal needle (0.8 mm of diameter) coupled with stereotaxic apparatus (coordinates: AP, +10.21 mm; DV, -2.5 mm; ML, +1.5 mm). Animals from control group were not submitted to surgical procedures. For IHQ analysis, animals were submitted to transc... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Helmut Patrocinio (hell.kenn@gmail.com) on 2017-11-10T16:29:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Marcos_Romualdo_Costa_TESE.pdf: 3272089 bytes, checksum: aaf244c49f569e8c070d41f2727a24c6 (MD5) / Approved for entry into archive by Ismael Pereira (ismael@neuro.ufrn.br) on 2017-11-10T17:31:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Marcos_Romualdo_Costa_TESE.pdf: 3272089 bytes, checksum: aaf244c49f569e8c070d41f2727a24c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-10T17:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Marcos_Romualdo_Costa_TESE.pdf: 3272089 bytes, checksum: aaf244c49f569e8c070d41f2727a24c6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Ao longo do desenvolvimento, as c?lulas neuroepiteliais do telenc?falo dividemse originando progenitores respons?veis pela gera??o sequencial dos diferentes tipos de neur?nios, astr?citos e oligodendr?citos do c?rtex cerebral. At? o presente, os progenitores telencef?licos estariam localizados nas zonas ventricular (ZV) e subventricular (ZSV). Sua posi??o ao longo dos eixos dorsoventral e rostro-caudal ? relacionada com territ?rios g?nicos e tipos celulares espec?ficos. Desta forma, observa-se a gera??o de neur?nios corticais glutamat?rgicos ou GABA?rgicos na ZV e ZSV do telenc?falo dorsal e ventral de roedores, respectivamente. Neste trabalho investigamos o potencial proliferativo in vivo e in vitro da zona marginal (ZM), conhecida por possuir neur?nios migrat?rios e diferenciados durante a corticog?nese. Determinamos o fen?tipo de c?lulas proliferativas da ZM e atrav?s de an?lise clonal utilizando infec??o por retrovirus contendo o gene para GFP (prote?na flourescente verde) acompanhamos as linhagens derivadas destes progenitores in vitro. C?lulas proliferativas in vivo foram marcadas atrav?s da administra??o do BrdU (bromodeoxiuridina, marcador da fase S do ciclo celular), combinada a ensaios imunohistoqu?micos para a identifica??o deste ant?geno e da forma fosforilada da histona 3 (expressa no final da fase G2 e durante a fase M do ciclo celular). Identificamos c?lulas proliferativas na ZM de camundongos a partir do dia embrinon?rio 14 (E14 - logo ap?s a divis?o da pr?-placa quando a ZM se torna distingu?vel) e por toda a corticog?nese com um aumento na proporc?o de c?lulas proliferativas de ~tr?s vezes em E18. As c?lulas proliferativas na ZM n?o expressam Pax6 ou Tbr2, fatores transcricionais caracter?sticos dos precursores da ZV e ZSV respectivamente. Ao longo da corticog?nese, esta popula??o precursora apresenta um padr?o de express?o do fator transcricional Olig2 seguindo um gradiente l?tero-medial, de modo que no per?odo perinatal todas as c?lulas proliferativas na zona marginal expressam o gene olig2. A an?lise das linhagens clonais geradas a partir destes precursores revelou um elevado potencial gliog?nico (~70% de clones gliais puros) quando comparado a ZV /ZSV (3,3%). Al?m disso, a ZM apresentou um significativo potencial neurog?nico, originando cerca de 30% de clones contendo neur?nios. Mostramos que os clones gliais puros da ZM s?o significativamente maiores que os da ZV. Conclu?mos, portanto, que a ZM dorsal ? um nicho neurog?nico e gliog?nico no c?rtex cerebral em desenvolvimento apresentando c?lulas proliferativas in vivo e in vitro com caracter?sticas fenot?picas distintas dos progenitores da ZV e ZSV. Atrav?s de estudos de linhagem clonal in vitro, demonstramos diferentes comportamentos proliferativos e potenciais neuro-gliog?nicos das c?lulas isoladas da ZM e da ZV/ZSV, indicando a exist?ncia de um novo tipo de progenitor no telenc?falo. / During development, telencephalic neuroepithelial cells proliferate and give rise to progenitors, which are responsible for the sequential generation of different types of neurons, astrocytes and oligodendrocytes in the cerebral cortex. To date, telencephalic progenitors would be located in the ventricular (VZ) and subventricular (SVZ) zones. Their position along the rostro-caudal and dorsoventral axis is related to gene expression territories and the generation of specific cell types, such that dorsal telencephalic VZ/ZVZ generates glutamatergic neurons and ventral VZ/ZVZ GABAergic neurons. In this work we investigated the in vivo and in vitro proliferative potential of the marginal zone (MZ) described to harbor migrating and differentiating neurons during corticogenesis. We determined the phenotype of MZ proliferative cells and by clonal analysis with infection by GFP (green fluorescent protein) containing retroviruses we followed the lineages derived from the progenitors in vitro. Proliferative cells in vivo were labeled by BrdU (bromodeoxyuridine, S phase cell cycle marker) combined to immunohistochemistry for the identification of BrdU antigen and the phosphorylated form of H3 ?histone (expressed at the end of G2 and during M phase of the cell cycle). We identified proliferative cells in mice MZ from embryonic day (E)14 (just after preplate division when MZ becomes distinguishable) and through all corticogenesis with a three fold increase in E18. Proliferative cells in the MZ do not express Pax6 or Tbr2, transcriptional factors typical of VZ and SVZ precursors respectively. During corticogenesis, this precursor population displays a latero-medial gradient of expression of Olig2, such that perinatally, all proliferative cells in the MZ express Olig2. Clonal lineage analysis from these precursors revealed a high gliogenic potential (~70% pure glial clones) when compared to VZ/SVZ (2,3%). Furthermore, MZ displays neurogenic potential since 30% of all clones contained neurons identified by class III ?-tubulin immunolabeling. Here we show that pure glial clones in the MZ are significantly larger than those generated by VZ. Concluding, the dorsal MZ is a neurogenic and gliogenic niche in the developing cerebral cortex containing proliferative cells with distinct phenotypic characteristics from the VZ and SVZ. By clonal lineage analysis in vitro, we demonstrated different proliferative behaviors and neuro-gliogenic potential from cells isolated from the MZ and VZ/SVZ indicating a novel type of progenitor in the cerebral cortex.

Orientador: Iscia Teresinha Lopes-Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T13:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torres_FabioRossi_D.pdf: 9761976 bytes, checksum: 5bf6571c4665ed95a3d8ae8ccbb18717 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) e os distúrbios do desenvolvimento cortical (DDC) são duas das mais importantes causas de epilepsia. Avanços nos estudos de genética molecular levaram a descoberta de genes responsáveis por vários DDCs como a heterotopia nodular periventricular (HNP), o espectro da lissencefalia-heterotopia subcortical em banda (LIS-HSB), a esquizencefalia, a polimicrogiria e para um subtipo de ELT, a epilepsia autossômica dominante com auras auditivas (EADAA). Os principais objetivos deste projeto foram: 1) realizar uma triagem de mutações nos quatro principais genes associados aos DDC (FLN1, LIS1, DCX e EMX2) em um grande grupo de pacientes com este tipo de malformação, 2) mapear os loci para a EADAA, 3) investigar o mecanismo molecular das mutações identificadas. A triagem de mutações foi realizada através da técnica de denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) e subseqüente sequenciamento automático dos fragmentos alterados. Para estudo funcional das mutações identificadas foi utilizada a técnica de HUMARA e PCR em tempo real. A análise de ligação foi realizada através da amplificação por PCR de marcadores microsatélites marcados com fluoróforos e análise dos alelos com os programas Fragment Profiler® e MLINK®. Um total de 108 pacientes com diferentes formas de DDC foi estudado, 13 pacientes possuem HNP, 19 são portadores do espectro LIS-HSB, 46 possuem esquizencefalia, enquanto 30 são afetados por polimicrogiria perisilviana bilateral. Nosso grupo também identificou quatro famílias segregando EADAA, sendo que duas possuem poder estatístico significativo para estudos de análise de ligação. Uma mutação deletéria G987C que altera o sítio de splicing do sexto intron do gene FLN1 foi identificada em dois indivíduos relacionados, portadores da forma clássica e bilateral de HNP. Diferença no padrão de inativação do cromossomo X foi detectada como o provável fenômeno responsável pelas diferenças clínicas entre os dois pacientes. No grupo de pacientes com o espectro LIS-HSB, foi identificada uma mutação deletéria A1385C que altera uma histidina por uma prolina no aminoácido 277 da proteína LIS. Apenas alterações neutras foram identificadas no gene DCX. No grupo de indivíduos com esquizencefalia e polimicrogiria foram encontradas apenas variações neutras no gene EMX2. A análise de ligação foi positiva para um locus no cromossomo 10 apenas para uma família com EADAA. O sequenciamento automático de indivíduos afetados identificou uma mutação no gene LGI1 (IVS7-2A>G), além do mais, estudos de neuroimagem identificaram malformações corticais em pacientes com mutações em LGI1. Análise genética e de mutações na família de genes LGI e em MASS1 identificou apenas variantes neutras nestes genes para as demais famílias estudadas. A análise de ligação genômica randômica em uma família com EADAA informativa e sem mutações em LGI1 identificou uma região candidata a possuir um gene implicado com esta síndrome no cromossomo 6q22 que, no entanto não foi confirmado pela análise subseqüente de marcadores adicionais na região candidata. Através deste trabalho podemos concluir que: a) Mosaicismo, mutações em regiões não codificantes, grandes deleções e rearranjos, além da presença de casos atípicos, são fatores que podem estar influenciando na baixa freqüência de mutações encontradas em pacientes com HNP e o espectro LIS-HSB, b) mutação no gene FLN1 foi encontrada em casos familiares de HNP bilateral, c) o mecanismo patológico desta mutação é uma destruição do sito de splicing do sexto intron do gene FLN1, d) as diferenças fenotípicas entre os dois pacientes portando esta mutação podem ser explicadas por diferenças no padrão de inativação do cromossomo X, e) mutações de sentido trocado no gene LIS1 são raras em pacientes com LIS-HSB e a localização das mesmas em domínios terminais WD não estão relacionados a fenótipos menos severos, f) a esquizencefalia e a polimicrogiria não têm base genética relacionada com o gene EMX2, g) a EADAA é uma entidade geneticamente heterogênea, já que mutações em LGI1 foram identificadas em apenas uma família com esta síndrome, h) malformações corticais em pacientes com EADAA e mutações em LGI1 foram descritas pela primeira vez, i) os genes pertencentes à família LGI e MASS1, não estão envolvidos com a etiologia da EADAA nas demais famílias analisadas, j) um locus candidato para o segundo gene responsável pela EADAA foi identificado no cromossomo 6q22, no entanto a saturação da região com marcadores adicionais não confirmou este achado / Abstract: Temporal Lobe Epilepsy (TLE) and malformations of cortical development (MCD) are two of the most important causes of epilepsy. Extensive molecular genetic studies have resulted in gene discovery for MCD such as periventricular nodular heterotopia (PNH), lisencephaly/ subcortical band heterotopia spectrum (LIS-SBH), schizencephaly, polymicrogyria and for a subtype of TLE, the autossomic dominant partial epilepsy with auditory features (ADPEAF). The main goals of this project were 1) to screen for mutations in the four main genes responsible for abnormal cortical development (FLN1, LIS1, DCX and EMX2) in a large cohort of patients with different types of cortical malformations 2) to map the loci for ADPEAF and 3) to investigate molecular mechanisms of mutations identified. Mutation screening was performed by the polymerase chain reactions (PCR). PCR products were analyzed by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) and were subsequently sequenced using standard automatic sequencer. In addition, HUMARA marker and Real Time PCR were performed to study molecular mechanisms resulting from the mutations identified. Linkage analysis was carried out by amplifying microsatellites markers by PCR and analyzing alleles with Fragment profiler® software and MLINK® package program. We have studied a total of 108 patients with MCD. Thirteen had PNH, 19 had the LIS-SBH spectrum, 46 individuals had schizencephaly and 30 had polymicrogyria. In addition we have identified four families segregating ADPEAF. Two families were considered informative for linkage analysis. We found a G987C mutation that alters the splicing site of the 6th intron of the FLN1 gene in two related patients with classical PNH findings, skewed X chromosome inactivation was detected as the possible mechanism responsible for clinical differences between the two patients. In the LIS-SBH group, one patient with agyria/pachygyria had an A1385C transversion, which changes a histidine for a proline in amino acid 277 of the LIS1 protein. Furthermore, in the group of the schizencephalies and polymicrogyria we have detected only neutral variants in the EMX2 gene. Linkage analysis in ADPEAF showed linkage to chromosome 10q in only one family. Automatic sequencing identified a mutation in the LGI1 gene. In addition, neuroimaging studies showed cortical malformations in patients with LGI1 mutations. Mutation and genetics analysis of the LGI gene family and MASS1 in other pedigrees failed to show a role for these genes in the etiology of ADPEAF. A genome wide scan performed in a large family segregating ADPEAF point to a potential candidate region on chromosome 6q22, which was not confirmed after further investigation with additional microsatellite markers. We conclude that: a) Mosaicism, mutations in non coding regions, large deletions and the presence of atypical cases could have contributed for the low frequency of mutations found in patients with PNH and the LIS-SBH spectrum b) we found mutations in the FLN1 gene in familial cases of bilateral PNH, c) the pathologic mechanism of this mutation is the splicing site destruction of the 6th FLN1 gene intron, d) phenotypic differences between the two related patients harboring this FLN1 mutation were explained by a non random X chromosome inactivation, e) missense mutations in the LIS1 gene are a rare finding in patients with the LIS-SBH spectrum and its localization in latter WD domains are not always related with less severe LIS, f) schizencephaly and polymicrogyria appear not to have a genetic background in the EMX2, since our study detected only a neutral polymorphism in these patients, g) ADPEAF is a genetically heterogeneous entity, since mutations in the LGI1 gene were identified only in one family with this syndrome, h) cortical malformation in the left temporal lobe was detected by the first time in individuals with ADPEAF and LGI1 mutations, i) MASS1 and LGI gene family were not involved with ADPEAF etiology in the other pedigrees studied, j) a potential candidate locus to contain the second gene responsible for ADPEAF was identified in chromosome 6q22, however additional studies failed to confirm linkage in this region / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Fisiopatologia Medica

A acidúria 3-hidróxiisobutírica é uma doença metabólica hereditária causada pela deficiência da atividade da 3-hidroxiisobutiril-Coenzima A desidrogenase. Acúmulo tecidual e alta excreção urinária do ácido 3- hidroxiisobutírico são as características bioquímicas desta desordem. As manifestações clínicas são heterogêneas, geralmente incluindo achados dismórficos, atraso no desenvolvimento motor, retardo mental severo e encefalopatia aguda. A acidemia láctica também ocorre nos pacientes afetados, indicando que uma disfunção mitochondrial pode estar envolvida na fisiopatogenia desta doença. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisobutírico (0,1; 0,5 e 1,0 mM) sobre a atividade de enzimas essenciais para o metabolismo energético, tais como os complexos I-V da cadeia respiratória, creatina quinase total, citosólica e mitocondrial e Na+, K+-ATPase em homogeneizados de córtex cerebral de ratos de 30 dias de idade. Também medimos o consumo de oxigênio em preparações mitocondriais de cérebro total na presença de ácido 3-hidroxiisobutírico. O ácido 3-hidroxiisobutírico inibiu significativamente o complexo I-III (20%), sem afetar as outras atividades da cadeia respiratória Além disso, o ácido 3-hidroxiisobutírico não alterou o estado III, estado IV e o índice de controle respiratório na presença de glutamato/malato ou sucinato, sugerindo que seu efeito sobre a respiração celular foi de pequena intensidade. Por outro lado as atividades da creatina quinase total e mitocondrial, mas não citosólica, foram inibidas (30%) pelo ácido 3- hidroxiisobutírico. Também verificamos que a inibição provocada por esse ácido sobre a atividade mitocondrial da creatina quinase foi completamente prevenida por pré-incubação dos homogeneizados com glutationa reduzida, α-tocoferol ou a combinação de superóxido desmutase com catalase, indicando que esta inibição foi mediada por oxidações de grupos tióis essenciais para a enzima e provavelmente pelos radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e/ou peroxilas. Também demonstramos que a atividade da Na+, K+-ATPase da membrana plasmática sináptica foi marcadamente reduzida (37%) pelo ácido 3-hidroxiisobutírico e que esse efeito foi prevenido pela co-incubação com α-tocoferol, sugerindo que radicais peroxilas estavam provavelmente envolvidos nesta ação. Considerando a importância das atividades enzimáticas afetadas pelo ácido 3-hidroxiisobutírico para o metabolismo cerebral e para a neurotransmissão, sugerimos que os aumentos teciduais das concentrações desse ácido possam contribuir para a neurodegeneração dos pacientes afetados pela acidúria 3-hidroxiisobutírica, e possivelmente expliquem achados prévios de elevada produção e excreção de lactato. / 3-Hydroxyisobutyric aciduria is an inherited metabolic disease caused by 3- hydroxyisobutyryl-CoA dehydrogenase deficiency. Tissue accumulation and high urinary excretion of 3-hydroxyisobutyric acid is the biochemical hallmark of this disorder. Clinical phenotype is heterogeneous and generally includes dysmorphic features, delayed motor development, profound mental impairment, and acute encephalopathy. Lactic acidemia is also found in the affected patients, indicating that mitochondrial dysfunction may be involved in the pathophysiology of this disorder. Therefore, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of 3-hydroxyisobutyric acid (0.1, 0.5 and 1mM) on essential enzymes of energy metabolism, namely the activities of the respiratory chain complexes I-V, total, cytosolic and mitochondrial creatine kinase and Na+, K+-ATPase in cerebral cortex homogenates of 30-day-old rats. We also measured the rate of oxygen consumption in brain mitochondrial preparations in the presence of 3- hydroxyisobutyric acid. 3-Hydroxyisobutyric acid significantly reduced complex I-III (20%), without affecting the other activities of the electron transport chain. Furthermore, 3-hydroxyisobutyric acid did not change state III, state IV and the respiratory control ratio in the presence of glutamate/malate or succinate, suggesting that its effect on cellular respiration was weak. On the other hand, the activities of total and mitochondrial creatine kinase, but not cytosolic creatine kinase, were inhibited (30%) by 3-hydroxyisobutyric acid. We also observed that 3- hydroxyisobutyric acid-induced inhibition of mitochondrial creatine kinase activity was fully prevented by pre-incubation of the homogenates with reduced glutathione, α-tocopherol or the combination of superoxide dismutase plus catalase, suggesting that this inhibition was mediated by oxidation of essential thiol groups of the enzyme probably by superoxide, hydrogen peroxide and/or peroxyl radicals. It was also demonstrated that Na+, K+-ATPase activity from synaptic plasma membranes was markedly suppressed (37 %) by 3-hydroxyisobutyric acid and that this effect was prevented by α-tocopherol co-incubation implying that peroxyl radicals were probably involved in this action. Considering the importance of the affected enzyme activities for brain metabolism homeostasis and neurotransmision, it is suggested that increased tissue levels of 3- hydroxyisobutyric acid may contribute to the neurodegeneration of patients affected by 3-hydroxyisobutyric aciduria and possibly explain previous reports describing elevated production and excretion of lactate.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The nitric oxide (NO) constitutes one of the most important mediators of the processes intra and extracellular. Amongst its biological functions, there is a role of neuromodulador. In Podarcis hispanica, diverse research had described the citoarchitecture of the cerebral cortex of this animal, however, there isn't data published about neurons that producers neuronal nitric oxide synthetase (nNOS). The aim of this work was to identify the positive NADPHd/nNOS neurons in the cerebral cortex of P. hispanica. For such, it was used the histochemistry technique NADPHd and imunochemistry to nNOS and soluble Guanylyl Cyclase (sGC α1). The results showed that the cerebral cortex of P. hispanica has a population of 1897 diaphorase positive neurons, being, 1090 (57,5%) in young animals, 528 (27,8%) in adults and 279 (14,7%) in age. Among the telencephalics levels, pre-comisural, comisural and post-comisural showed 423 (22,3%); 459 (24,2%) and 1015 (53,5%) neurons, respectively. In relation the cortical areas, the medial cortex (CM), dorsomedial (CDM), dorsal (CD) and lateral (CL) showed 86 (4,5%), 530 (27,9%), 1243 (65,5%) and 38 (2%) neurons, respectively. Inner and outer plexiforme layers showed, respectively, 1264 (66,6%), 533 (28,1%) and 100 (5.3%) neurons. 1737 (91,5%) NADPHd positive neurons had been found in the regions Timm-positive and 160 (8,5%) in the Timm-negative. 15 types of morphological NOS positive neurons were identified: piramidal, bouquet double, deep stellate, sarmentous, polymorphous, ectopic vertical multipolar, coral, granular unipolar, large radial, horizontal bipolar, horizontal unipolar, smooth vertical, spheroidal and fusiforme. In conclusion, the cerebral cortex of Podarcis hispanica showed neurons with NADPHd activity, as well as immunoreactive to the anti-nNOS and sGC α1 antibodies; NADPHd positive neurons are of three types: Type I, II and III; There is a significant difference in the number of NADPHd positive neurons among animals of different ages and among the cortical areas and layers and were found mainly in the Timm-positive regions. / O óxido nítrico (NO) constitui um dos mais importantes mediadores dos processos intra e extracelulares. Dentre suas funções biológicas, destaca-se seu papel de neuromodulador. Em Podarcis hispanica, diversos trabalhos descreveram a citoarquitetura do córtex cerebral desse animal, no entanto, nenhuma informação referente aos neurônios produtores da isoforma óxido nítrico neuronal (nNOS) nessa região telencefálica foi publicada até o presente momento. Neste trabalho, objetivou-se identificar os neurônios NADPHd/nNOS positivos no córtex cerebral do referido animal. Para tal, utilizou-se a técnica histoquímica NADPHd e imunohistoquímica frente a nNOS e Guanilil Ciclase Solúvel (sGC α1). Os resultados demonstraram que o córtex cerebral de P. hispanica apresenta uma população de 1897 neurônios diaforase positivos, sendo, 1090 (57,5%) em animais jovens, 528 (27,8%) em adultos e 279 (14,7%) em senis. Entre os níveis telencefálicos, o pré-comissural, o comissural e o pós-comissural apresentaram 423 (22,3%); 459 (24,2%) e 1015 (53,5%) neurônios, respectivamente. Em relação as áreas corticais, o córtex medial (CM), dorsomedial (CDM), dorsal (CD) e lateral (CL) apresentaram 86 (4,5%), 530 (27,9%), 1243 (65,5%) e 38 (2%) neurônios, respectivamente. Nas camadas plexiformes interna e externa e camada celular foi verificado, respectivamente, 1264 (66,6%), 533 (28,1%) e 100 (5,3%) neurônios. 1737 (91,5%) neurônios NADPHd positivos foram encontrados nas regiões Timm-positivas e 160 (8,5%) nas Timm-negativas. 15 tipos morfológicos de neurônios NOS positivos foram identificados, são eles: piramidal, buquê duplo, estrelado, sarmentoso, polimorfo, ectópico vertical, multipolar, coral, granular unipolar, radial grande, horizontal bipolar, horizontal unipolar, vertical liso, esferoidal e fusiforme. Então, concluiu-se que: o córtex cerebral de Podarcis hispanica apresenta neurônios com atividade NADPHd, como também imunorreativos aos anticorpos anti-nNOS e sGC α1; os neurônios NADPHd positivos são de três tipos: Tipo I, II e III; há uma diferença significativa na expressão do número de neurônios NADPHd positivos entre animais de diferentes faixas etárias e entre as áreas e camadas corticais; córtex cerebral de P. hispanica apresenta uma variedade de 15 morfologias de neurônios NADPHd positivos; os neurônios NADPHd positivos foram encontrados principalmente nas zonas Timm-positivas.

O presente trabalho objetivou explorar a eventual variação da expressão do mRNA e da proteína S100b no hipocampo, cerebelo e córtex cerebral de ratos neonatos em condições de anóxia, comparativamente à condições controle. Este estudo foi desenvolvido em ratos albinos, divididos em dois grupos: o grupo Experimental Anóxia (EA) e o grupo Experimental Controle (EC), que por sua vez foram subdivididos em tempos de 2, 4, 6, 12 e 24 horas no que se refere à coleta de amostras após a aplicação dos estímulos pré-estabelecidos para cada grupo. Dos períodos avaliados, nossos resultados indicaram que a anóxia proporcionou um pico na expressão gênica de S100b após duas horas e proteica após 4 horas nas áreas do hipocampo e cerebelo. O córtex cerebral do grupo EA quando comparado ao grupo EC, não apresentou nenhum aumento significante de S100b nos períodos avaliados. Os resultados obtidos contribuem de forma crucial para elucidação do papel da proteína S100b como biomarcadora na EHI, bem como no esclarecimento parcial da função deste gene com relação à fisiopatologia da doença. / The aim of the present study was to investigate the temporal variation in the expression of S100b mRNA and protein in the hippocampus, cerebellum, and cerebral cortex of newborn rats under conditions of anoxia compared with control rats. The study was performed using two groups albino rats: Experimental Anoxia (EA) and Experimental Control (EC). The animals in both EA and EC were distributed in the following subgroups relative to the time elapsed since the application of the stimuli predefined for each group: two, four, six, 12, and 24 hours. Anoxia induced a peak in the S100b gene expression after two hours and protein expression after 4 hours in the hippocampus and cerebellum. With respect to the cerebral cortex, S100b never exhibited a significant increase in the EA group compared with the EC group. The results of the present study represent a crucial contribution to the elucidation of the role protein S100b plays as a biomarker in HIE, as well as a contribution to the elucidation of the role the corresponding gene plays in the physiopathology of the disease.

Le cerveau génère spontanément des activités électriques enregistrables à toutes les échelles spatiales, de l'électroencéphalogramme (EEG) jusqu'à la membrane neuronale. La fréquence et l'amplitude de ces activités varient en fonction des états de vigilance. Afin de comprendre comment cette activité synaptique endogène sculpte à chaque instant l'intégration des événements exogènes, j'ai mis au point une nouvelle stratégie expérimentale in vivo visant à comparer les réponses neuronales à divers stimuli, en présence et en absence d'activité endogène. J'ai généré, chez le rat, une activité de type éveil ou sommeil puis, j'ai induit un état isoélectrique durant lequel toute activité spontanée était supprimée. J'ai montré que la suppression de l'activité synaptique dans les neurones du cortex somatosensoriel induisait une diminution de sensibilité neuronale et un accroissement de la régularité des réponses. La persistance d'une excitabilité neuronale dans cet état de coma profond m'a conduit à poursuivre mes recherches avec le service de réanimation neurologique afin d'explorer, chez des patients placés dans un tel coma, la réactivité corticale à des stimulations sensorielles. J'ai démontré chez l'homme et l'animal la persistance de potentiels évoqués sensoriels dans l'EEG et les neurones corticaux. Ces réponses apparaissaient plus tardivement, avec une amplitude plus importante et une plus grande fiabilité d'un essai à l'autre. Ainsi, il apparaît que l'activité synaptique spontanée, qui caractérise le fonctionnement " normal " du cerveau, a essentiellement comme effet d'augmenter la sensibilité des neurones ainsi que la variabilité statistique des réponses à l'environnement. / The brain spontaneously generates electrical activities, which can be recorded at all the spatial level, from the electroencephalogram (EEG) to the neuronal membrane. The frequency and the amplitude of these activities vary with the states of vigilance. To understand how this endogenous synaptic activity sculpts the integration of exogenous events, I developed a new in vivo experimental strategy to compare the cortical neuronal responses to various stimuli in the presence and absence of endogenous activity. I generated a waking-like or sleep-like synaptic activity in the rat. Then, I induced an isoelectric state in which spontaneous activity was completely suppressed. I showed that the suppression of synaptic activity in somatosensory cortex neurons resulted in a decrease in neuronal sensitivity and an increase in the regularity of responses to repeated identical stimuli. The persistence of neuronal excitability while the animal was immersed in a deep comatose led me to continue my research in collaboration with the neurological intensive care unit to explore the sensory-evoked cortical responses in patients exhibiting an isoelectric EEG. I demonstrated in humans and animals the persistence of sensory-evoked potentials in the EEG and individual cortical neurons. These cortical responses occurring in the absence of spontaneous brain activity had an augmented latency, a larger amplitude and a higher trial-to-trial reliability. It thus seems that the primary effect of the sustained background synaptic activity, the hallmark of a "normal" functioning of the brain, is to increase the sensitivity of neurons and the statistical variability of responses to the environment.

Pendant le développement postnatal du cortex cérébral visuel, l'homéoprotéine Otx2 est transférée préférentiellement dans les interneurones inhibiteurs à parvalbumine (cellules PV), induit leur maturation et régule la période critique de plasticité pour la dominance oculaire. Pendant cette période critique, les cellules PV sont progressivement entourées par une matrice extracellulaire riche en glycosaminoglycanes (GAGs), qui pourraient être impliqués dans la capture d'Otx2. Pour étudier comment l'interaction entre Otx2 et les GAGs à la surface des cellules PV régule la période critique, nous avons analysé une lignée de souris transgéniques Otx2-AA chez lesquelles cette interaction est perturbée. Ces souris présentent une spécificité réduite de l'Otx2 cortical pour les cellules PV et un retard dans l'ouverture et la fermeture de la période critique pour la dominance oculaire. Nous avons montré que la protéine Otx2 se lie aux chaines de chondroïtine sulfates à la surface des cellules PV et qu'elle a une forte affinité pour le chondroïtine sulfate CS-E. Chez l'adulte, le cortex est maintenu à l'état non plastique par un apport continuel d'Otx2. Afin de ré-ouvrir une fenêtre de plasticité chez l'adulte, nous avons développé deux modèles pour perturber le transfert d'Otx2 : un analogue synthétique de CS-E qui se lie à Otx2 et une souris knock-in inductible pour contrôler la sécrétion d'un anticorps simple chaine contre Otx2. Ces résultats confirment et précisent le rôle in vivo de l'interaction entre Otx2 et les GAGs, à la fois pour la mise en place des périodes critiques pendant le développement postnatal et pour le maintien de l'état non plastique du cortex chez l'adulte. / During postnatal development of the visual cerebral cortex, Otx2 homeoprotein is transferred preferentially into parvalbumin inhibitory interneurons (PV-cells), induces their maturation and regulates a critical period of plasticity for binocular vision. During the critical period, PV-cells are gradually enwrapped by perineuronal nets enriched in glycosaminoglycans (GAGs), which are likely involved in the capture of Otx2. To understand how Otx2 interacts with GAGs at the surface of PV-cells for critical period regulation, we have analyzed a transgenic Otx2-AA mouse line in which the interaction between Otx2 and GAGs is disrupted. These mice show a reduced specificity of cortical Otx2 for PV-cells with concomitant delayed onset and closure of critical period for ocular dominance. We have also identified that Otx2 protein binds chondroitin sulfate chains of the perineuronal nets and that it has a high affinity for the chondroitin sulfate CS-E. We have therefore developed a sugar-ase protection assay for identifying specific glycan sequences involved in homeoprotein recognition. Throughout adulthood, the cortex receives Otx2 to maintain a consolidated, non-plastic state. To interfere with Otx2 transfer in the adult and reopen a window of plasticity, we have developed two models: a synthetic hexasaccharide analogue of CS-E that binds to Otx2 and an inducible, knock-in mouse allowing spatio-temporal control of a secreted single chain antibody against Otx2. All these results confirm and clarify the in vivo role for Otx2-GAG interaction, both in the timing of critical periods during postnatal development and in the maintenance of the non-plastic state of the cortex in the adult.