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Chicken feathers are the most abundant keratinous biomass in the world. Disposal of thehuge and increasing volume of waste feathers presents as a major concern for poultryindustry. On the other hand, energy and material recovery of this valuable protein sourceis an important issue for organic solid waste treatment and bioenergy generation.Anaerobic digestion is an environmentally and economically promising alternativeprocess for biogas production of waste feathers.In this study in order to enhance the methane potential of batch anaerobic digestion ofchicken feathers this waste was treated by various kinds of pretreatments includingthermal, thermo-chemical, enzymatic, thermo-enzymatic and chemo-enzymatic methods.Also the effect of different treatment conditions on the methane yield was investigated.As a whole, thermo-chemical pretreatment with lime (Ca(OH)2) rendered the mostsignificant effect on enhancement of the chicken feathers methane potential. In particularlime treated triplicate samples under treatment condition of 40g TS feather/l water, 0.1gCa (OH)2 /g TS feather, 100°C and 30 min produced the highest amount of methane (anaverage maximum volume of 480 Nml/g VS, which is about 96.8% of the theoreticalmethane potential of protein), during 50 days of anaerobic incubation. Increasing theoperational parameters such as feather concentration, lime loading, temperature andreaction time improved the feathers solublisation resulting in a higher soluble chemicaloxygen demand (SCOD) concentration of the samples but inserted negative impacts onthe anaerobic digestion performance. Although other pretreatment methods improved theSCOD concentrations of the feathers too, compared to the lime treatment those methodsdidn’t show considerable effects on the enhancement of methane yield from the chickenfeathers. Thermo-enzymatic, enzymatic, and thermal pretreated triplicate samplesproduced an average maximum of 185 Nml/g VS, 154 Nml/g VS, and 143 Nml/g VS(37.3%, 31%, 28.8% of the theoretical methane potential) respectively, during 33 days of50 days of anaerobic incubation. Especially, chemo-enzymatic pretreated sample showednegative methane potential of only 41 Nml/g VS, i.e. 8% of the theoretical methanepotential. Consequently, lime pretreatment under the above recommended conditions canbe suggested for hydrolysis of chicken feathers to achieve significant enhancement of itsmethane potential.

Ces travaux de thèse portent sur la conception par voie chimio-enzymatique de polymères amphiphiles issus de glycolipides, capables de s’auto-assembler en phase aqueuse et susceptibles de répondre à des applications de vectorisation de principes actifs. Après une étude préalable des paramètres influents lors de la synthèse enzymatique, huit monomères glycolipidiques porteurs de fonctions esters vinyliques,méthacrylate ou [alpha]-méthylstyrène ont été synthétisés à partir de dérivés d’huile de ricin et de glucose. Les monomères porteurs d’une fonction ester vinylique comme groupement polymérisable ont été copolymérisés en présence d’acétate de vinyle mais les copolymères ainsi formés n’ont pas montré de capacité à s’autoassembler. Les monomères fonctionnalisés par un groupement méthacrylate, ont été copolymérisés en présence de méthacrylate de méthyle ; trois gammes de copolymères ont ainsi été synthétisées par polymérisation radicalaire, les deux premières selon un mécanisme non contrôlé en présence d’un agent de transfert thiolé ou pas et la troisième selon la méthodologie RAFT. Dans tous les cas, des nanoparticules bien définies et stables pendant plusieurs mois ont été obtenues par auto-assemblage de ces trois gammes de copolymères en phase aqueuse. Le Rouge de Nil a été piégé au sein de ces nanoparticules puis relargué par ajout de chlorure de sodium, laissant entrevoir des applications de stabilisation et de vectorisation de principes actifs pour ces nouveaux copolymères. / The aim of this thesis was the conception of amphiphilic polymers able to self-assembly in water forpotential drug delivery applications, from glycolipidic monomers synthesized by a chemo-enzymatic pathway.After a preliminary study of the influent parameters on glycolipid synthesis via enzymatic catalysis, eightmonomers bearing either vinyl ester, methacrylate or a-methylstyrene groups have been synthesized fromglucose and castor oil derivatives. The vinyl ester-bearing monomers have been copolymerized with vinylacetate. Unfortunately, the resulting copolymers did not show interesting self-assembly properties in water.Three families of copolymers were synthesized from the methacrylate-bearing monomers and methylmethacrylate, either by free radical polymerization in the presence or not of a transfer agent or by reversibleaddition-fragmentation polymerization (RAFT). Well-defined and stablenanoparticles were obtained from allthose copolymers. Nile Red was successfully trapped into those nanoparticles and released by adding sodiumchloride, allowing perspectives as potential drug delivery applications for those new copolymers.

Natural products fulfill an important role in the development of new drugs due to their diverse biological activities. Two prominent examples of pharmaceutically attractive classes of natural products are the fungal sorbicillinoids and the cyanobacterial ambigols. The sorbicillinoids are a polyketide family with over 100 members possessing complex molecular architectures and various bioactivities, ranging from antibiotic and antiviral properties to cytotoxicity. The group of ambigols isolated from the terrestrial cyanophyte Fischerella ambigua, comprises only five representatives that exhibit an analogous diversity of biomedically relevent activities. In order to exploit the great potential of these two classes of natural products, the focus of this work is set, on the one hand, on the targeted derivatization of the sorbicillinoids and, on the other hand, on the investigation of the biosynthesis of the ambigols and the development of an efficient synthetic strategy accessing this compound class. In the first part of this thesis, the previously established chemo-enzymatic one-pot approach, enabling the total synthesis of complex sorbicillinoids, was extended to the preparation of a focu- sed, antiviral sorbicatechol-like compound library. Furthermore, the antiviral evaluation of the library led to five derivatives exhibiting anti-HIV activity with IC50 values in the range of 32–77 μM. Besides, the natural substrate spectrum of the monooxygenase SorbC, playing the key role in the chemo-enzymatic approach, was expanded by a substrate mimicking strategy and by stepwise sorbicillin modification. Flexible long-chain ester functionalities were introduced to imitate the sorbyl side chain in sorbicillin. The successful enzymatic conversion of these derivatives represented an important breakthrough in overcoming substrate limitations. The final completion of the substrate scope was achieved through the formation of backbone-modified sorbicillin substrates. The analysis of the biocatalytic oxidative dearomatization of these compounds demonstrated the high tolerance of SorbC, enabling the straightforward synthesis of altered Diels-Alder und Michael addition products. In total, the chemo-enzymatic methodology has thus been expanded to prepare several new sorbicillinoids, inlcuding the formation of unnatural derivatives through the comprehensive broadening of the natural substrate scope. In the second part of this work, the focus was placed on the elucidation of ambigol biosynthesis by heterologous expression in Synechococcus elongatus PCC 7942. In vitro and in vivo experiments with the two cytochrome P450 monooxygenases confirmed their participation in the selective construction of the biaryl and biaryl ether linkages between the dichlorophenolic subunits. Co- incubation of biaryl bond forming oxidoreductase Ab2 with appropriate mono- and dimeric precursors resulted in the first reported chemo-enzymatic formation of ambigol A. The further examination of the other genetic elements showed that ambigol biosynthesis starts from the shikimate pathway (Ab7) leading, via Claisen rearrangement, to 4-hydroxybenzoic acid (Ab5). The intermediate is regioselectively chlorinated by the FAD-dependent halogenase Ab10 after being activated with ATP and coenzyme A (Ab6). Catalyzed hydrolysis of the thioester by the NRPS module Ab9 is generating 3-chloro-4-hydroxybenzoic acid, which undergoes decarboxylative halogenation by Ab1, leading to the key substrate of the cytochrome P450 monooxygenases Ab2 and Ab3. In summary, the research on ambigol biosynthesis allowed important conclusions regarding the chlorination of the precursors and the selective assembly of the biaryl and biaryl ether linkages. In addition to the biosynthetic analysis, a total synthetic approach to this class of natural products was developed. The basis for this was the targeted synthesis of the central building blocks prepared by highly regioselective halogenation and reactivity-directing protecting groups. The subsequent implementation of the biaryl bonds was performed by an optimized Suzuki cross-coupling reaction using the corresponding boronic acids. The key step of the synthetic strategy was the generation of mono- and bis-iodonium salts to install the required biaryl ether structural elements. The aryl transfer reaction with λ3-iodanes in combination with Suzuki cross-coupling accomplished a straightforward synthetic methodology accessing all known ambigols and unnatural derivatives bearing special biaryl coupling sites or consisting exclusively of 2,4-dichlorophenol units. / Naturstoffe spielen aufgrund ihrer diversen biologischen Aktivitäten eine wichtige Rolle in der Entwicklung neuer Medikamente. Zwei bedeutende Beispiele für pharmazeutisch wertvolle Naturstoffklassen sind die Sorbicillinoide aus Pilzen und die cyanobakteriellen Ambigole. Die Sorbicillinoide sind eine Polyketidfamilie mit über 100 Mitgliedern, die eine komplexe molekulare Architektur und verschiedene Bioaktivitäten besitzen, welche wiederum von antibiotischen und antiviralen Eigenschaften bis zu Cytotoxizität reichen. Die Gruppe der Ambigole, isoliert aus dem terrestrischen Cyanophyten Fischerella ambigua, umfasst nur fünf Vertreter, die aber eine vergleichbare Vielfalt an biomedizinisch relevanten Aktivitäten aufweisen. Um das große Potenzial der beiden Naturstoffklassen zu nutzen, liegt der Fokus dieser Arbeit einerseits auf der gezielten Derivatisierung der Sorbicillinoide und andererseits auf der Untersuchung der Biosynthese der Ambigole und der Entwicklung einer effizienten Synthesestrategie als Zugang zu dieser Verbindungsklasse. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der zuvor etablierte, chemo-enzymatische Ein-Topf-Ansatz, der zur Totalsynthese komplexer Sorbicillinoide führte, zum Aufbau einer fokussierten, antiviralen Bibliothek an Sorbicatechol-Derivaten erweitert. Darüber hinaus zeigte die Auswertung des antiviralen Potentials der Bibliothek fünf Derivate, die eine anti-HIV Aktivität mit IC50-Werten im Bereich von 32-77 μM besitzen. Außerdem wurde das natürliche Substratspektrum der Schlüsselmonooxygenase SorbC für den chemo-enzymatischen Ansatz durch Substratnachahmung und schrittweiser Sorbicillin-Modifikation erweitert. Zur Imitation der Sorbyl-Seitenkette in Sorbicillin wurden flexible, langkettige Esterfunktionalitäten eingeführt. Deren erfolgreiche enzymatische Umsetzung stellt einen wichtigen Durchbruch bei der Überwindung der Substratlimitationen von SorbC dar. Zur Vervollständigung des Substratspektrums wurde eine Synthesestrategie zum Aufbau von Sorbicllin-Derivaten mit modifizierten, aromatischen Substituenten entwicklet. Die Analyse der biokatalytischen oxidativen Dearomatisierung dieser Verbindungen verdeutlichte die hohe Promiskuität von SorbC, was die unkomplizierte Totalsynthese von abgewandelten Diels-Alder- und Michael-Additionsprodukten ermöglicht. Insgesamt wurden mit der chemo- enzymatischen Methode mehrere neue Sorbicillinoide hergestellt, einschließlich der Bildung von unnatürlichen Derivaten durch die umfassende Ausweitung des natürlichen Substratspektrums. Im zweiten Teil dieser Arbeit lag der Fokus auf der Aufklärung der Biosynthese der Ambigole durch heterologe Expression in Synechococcus elongatus PCC 7942. In vitro- und in vivo-Experimente mit den beiden Cytochrom P450 Monooxygenasen bestätigten deren Beteiligung an der selektiven Bildung der Biaryl- und Biarylether-Bindungen zwischen den Dichlorphenol-Untereinheiten. Die Co-Inkubation der biarylbildenden Oxidoreduktase Ab2 mit geeigneten mono- und dimeren Vorstufen führte zur ersten chemo-enzymatischen Synthese von Ambigol A. Weitere Untersu- chungen der anderen genetischen Elemente zeigten, dass die Ambigol Biosynthese mit dem Shikimat-Stoffwechselweg (Ab7) beginnt, der über eine Claisen-Umlagerung (Ab5) zu 4-Hydroxybenzoesäure führt. Das Intermediat wird durch die FAD-abhängige Halogenase Ab10 regioselektiv chloriert, nachdem es mit ATP und Coenzym A aktiviert wurde (Ab6). Durch katalysierte Hydro- lyse des Thioesters durch das NRPS-Modul Ab9 entsteht 3-Chlor-4-hydroxybenzoesäure. Die Carbonsäure wird mittels decarboxylativer Halogenierung (Ab1) in das Schlüsselsubstrat der Cytochrom P450-Monooxygenasen Ab2 und Ab3 umgewandelt. Zusammenfassend ergab die Erforschung der Ambigol Biosynthese wichtige Rückschlüsse auf die Chlorierungsmethoden der entsprechenden Vorstufen und den selektiven Aufbau der Biaryl- und Biarylether-Bindungen in der Natur. Neben der Analyse der Biosynthese wurde auch eine Totalsynthese zu dieser Naturstoffklasse entwickelt. Grundlage hierfür war der gezielte Aufbau der Kernbausteine, die mithilfe hoch regioselektiver Halogenierungen und reaktivitätslenkenden Schutzgruppen dargestellt wurden. Die anschließende Einführung der Biarylbindungen erfolgte durch eine optimierte Suzuki- Kreuzkupplung unter Verwendung der entsprechenden Boronsäuren. Der Schlüsselschritt der Synthesestrategie war die Synthese von Mono- und Bis-Iodoniumsalzen, über welche die benötigten Biarylether-Strukturelemente eingebaut werden konnten. Die Aryltransfer-Reaktion mit λ3-Iodanen in Kombination mit einer Suzuki-Kreuzkupplung ermöglichte den direkten Aufbau aller bekannten Ambigole sowie unnatürlicher Derivate mit speziellen Biarylkupplungsstellen oder Analoga, die ausschließlich aus 2,4-Dichlorphenol-Bausteinen bestehen.

The three main components of wood, namely, cellulose, hemicellulose, and lignin, can be used in various areas. However, since lignin covalently crosslinks with wood polysaccharides creating networks that is an obstacle for extraction, direct extraction of different wood components in high yield is not an easy matter. One potential approach to overcome such obstacles is to treat the wood with specific enzymes that degrade the networks by specific catalysis. However, the structure of wood is so compact that the penetration of the wood fibers by large enzyme molecules is hindered. Thus, the pretreatment of wood prior to the application of enzymes is necessary, for “opening” the structure. One pretreatment method that was performed in this thesis is based on kraft pulping, which is a well-established and industrialized technique. For untreated wood, the wood fibers cannot be attacked by the enzymes. A relatively mild pretreatment was sufficient for wood polysaccharides hydrolyzed by a culture filtrate. A methanol-alkali mixture extraction was subsequently applied to the samples that were pretreated with two types of hemicellulases, Gamanase and Pulpzyme HC, respectively. The extraction yield increased after enzymatic treatment, and the polymers that were extracted from monocomponent enzyme-treated wood had a higher degree of polymerization. Experiments with in vitro prepared lignin polysaccharide networks suggested that the increased extraction was due to the enzymatic untying. However, the relatively large loss of hemicellulose, particularly including (galacto)glucomannan (GGM), represents a problem with this technique. To improve the carbohydrate yield, sodium borohydride (NaBH4), polysulfide and anthraquinone were used, which increased the yields from 76.6% to 89.6%, 81.3% and 80.0%, respectively, after extended impregnation (EI). The additives also increased the extraction yield from approximately 9 to 12% w/w wood. Gamanase treatment prior to the extraction increased the extraction yield to 14% w/w wood. Sodium dithionite (Na2S2O4) is an alternative reducing agent for the preservation of hemicelluloses because it is less expensive than metal hydrides and only contains sodium and sulfur, which will not introduce new elements to the recovery system. Moreover, Na2S2O4has the potential to be generated from black liquor. Na2S2O4 has some preservation effect on hemicelluloses, and the presence of Na2S2O4 also contributed to delignification. The extraction yield increased to approximately 15% w/w wood. Furthermore, Na2S2O4 has been applied in the kraft pulping process of spruce. The yield and viscosity increased, while the Klason lignin content and kappa number decreased, which represents a beneficial characteristic for kraft pulp. The brightness and tensile strength of the resulting sheets also improved. However, the direct addition of Na2S2O4 to white liquor led to greater reject content. This problem was solved by pre-impregnation with Na2S2O4 and/or mild steam explosion (STEX) prior to the kraft pulping process. Following Na2S2O4 pre-impregnation and mild STEX, the obtained kraft pulp had substantially better properties compared with the properties exhibited after direct addition of Na2S2O4 to the white liquor. The wood structure opening efficiency of mild STEX alone was also tested. The accessibility of the wood structure to enzymes was obtained even at very modest STEX conditions, according to a reducing sugar analysis, and was not observed in untreated wood chips, which were used as a reference. The mechanical effect of STEX appears to be of great importance at lower temperatures, and both chemical and mechanical effects occur at higher STEX temperatures. / <p>QC 20140903</p>

Le but du projet est de mettre au point de nouveaux outils enzymatiques permettant la production de chitinoligosaccharides de taille et de degré d'acétylation parfaitement contrôlés pour l'étude d'enzymes impliquées dans la biosynthèse, la biodégradation et la modification de la chitine, et pour l'étude de récepteurs protéiques d'origine animale ou végétale. Des études récentes ont montré que les oligomères de la chitine et leurs dérivés sont des molécules qui interviennent dans les phénomènes symbiotiques et de reconnaissance hôte-pathogène dans le règne végétal. Ces molécules sont utilisées en agrochimie comme biofertilisants, et potentiellement en phytosanitaire. Ils sont connus également pour posséder de nombreuses activités biologiques dans le domaine de la santé (effets antimicrobiens, anticancéreux, anti-inflammatoires, immunostimulants...). Si les activités de cette classe d'oligosaccharides sont parfaitement reconnues, leurs modes d'actions restent encore à éclaircir, ce qui nécessite de disposer de molécules pures aux structures chimiques parfaitement contrôlées. La production d'oligomères de la chitine nécessite traditionnellement la mise en œuvre d'une chimie fastidieuse, qui peut être facilitée par une approche chimio-enzymatique.Dans le cadre de cette thèse, nous souhaitons donc développer des outils enzymatiques permettant la synthèse d'une bibliothèque de molécules de taille et de degré d'acétylation contrôlés en vue d'études structure-activité biologique. Pour cela, nous chercherons à produire des N-désacétylases et des chitinases dans différents systèmes d'expression et à caractériser leur activité afin de générer une panoplie de molécules de structure moléculaire parfaitement définie à partir de fragments saccharidiques issus de la biomasse. Les molécules ainsi préparées pourront ensuite être modifiées de façon chimio-sélective afin d'obtenir des sondes photoactivables et/ou biotinylées pour la caractérisation de récepteurs, des substrats fluoro- ou chromogéniques pour le dosage spécifique d'activités enzymatiques ou encore des lipochitinoligosaccharides capables de favoriser la croissance des plantes. Les approches utilisées pour mener à bien ce projet pluridisciplinaire seront : l'ingénierie et la production de protéines recombinantes, la caractérisation biochimique d'activités enzymatiques ainsi que la synthèse chimio-enzymatique et la modification chimique d'oligosaccharides qui devront être caractérisés d'un point de vue physicochimique. Il s'agit d'un projet intégré dans une collaboration nationale financée par l'ANR réunissant des équipes de l'Université de Grenoble, de Lyon, d'Orsay, et l'entreprise Bayer CropScience. / The aim of the project is to develop new tools for enzymatic production of chitooligosaccharides size and degree of acetylation perfectly controlled for the study of enzymes involved in biosynthesis, biodegradation and modification of chitin and for the study of protein receptors of animal or vegetable origin. Recent studies have shown that oligomers of chitin and its derivatives are molecules involved in the phenomena of symbiotic and host-pathogen recognition in plants. These molecules are used as agrochemicals biofertilizers. They are also known to possess numerous biological activities in the field of health (anti-microbial, anti-cancer, anti-inflammatory, immunostimulant ...). If the activities of this class of oligosaccharides are well recognized, their modes of action remain to be clarified, which requires having pure molecules with chemical structures perfectly controlled. The production of chitin oligomers traditionally requires the implementation of a tedious chemistry, which can be facilitated by a chemoenzymatic approach.As part of this thesis, we want to develop enzymatic tools for the synthesis of a library of molecules of size and degree of acetylation controlled studies for structure-biological activity. For this, we will seek to produce N-deacetylase and chitinases in different expression systems and characterize their activity to generate a variety of molecules well-defined molecular structure from saccharide fragments derived from biomass. The molecules thus prepared can then be modified so as to achieve chemoselective photoactivatable probes and / or biotinylated for the characterization of receptors, substrates or fluoro-chromogenic assay for specific enzyme activities or lipo-chitooligosaccharides can promote plant growth. The approaches used to complete this multidisciplinary project are: engineering and production of recombinant proteins, the biochemical characterization of enzymatic activities and chemoenzymatic synthesis and chemical modification of oligosaccharides to be characterized from the point of physicochemical view. This is an integrated project in a national collaboration funded by the ANR with teams from the University of Grenoble, Lyon, Orsay, and Bayer CropScience.

La pomme de terre produit des glycoalcaloïdes comme la plupart des Solanacées. Deux composés, en particulier, l’α-solanine et l’α-chaconine, sont produits en plus grande quantité lorsque le tubercule est exposé à la lumière et subit des dégradations. Ces molécules sont toxiques et peuvent représenter un danger pour le consommateur et des nuisances pour l’environnement. Dans le cadre de cette thèse, les teneurs en α-solanine et α-chaconine dans la chaire de pomme de terre verdie, en germination ou en décomposition retrouvées sur les marchés d’Abidjan (Côte d'Ivoire) ont été analysées. Les résultats ont montré que la chaire de ces pommes de terre contient des quantités élevées de ces deux composés, dépassant 2 à 5 fois la limite recommandée. Pour des raisons de sécurité sanitaire, ces pommes de terre doivent être proscrites de l’alimentation humaine. En revanche, la teneur élevée en glycoalcaloïdes dans ces pommes de terre représente une source de solanidine, un précurseur pour la synthèse d'hormones et de composés pharmacologiquement actifs, qui mérite d’être exploitée. Dans cet objectif, nous avons développé une méthode chimio-enzymatique simple, comprenant un traitement acide partiel suivi d’une hydrolyse enzymatique par la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana dont le gène a été isolé à partir d’une librairie génomique de cDNA afin de détoxifier ces composés et produire la solanidine. / Potato produce glycoalkaloids as most plants of Solanaceae family. The principal glycoalkaloids, α-chaconine and α-solanine are produced in greater quantities when potato tubers are exposed to light and are subject to deteriorations. These compounds are toxic and can represent a real danger for the consumer and the environment where they are discharged during their degradation. In this work, the estimation of glycoalkaloids in the flesh of different types of decayed potatoes usually found in different market places of Abidjan (Ivory Coast) was evaluated. The results showed that turned green and also sprouting or rotting potato flesh contain high amounts of toxic solanine and chaconine, exceeding by 2 to 5-fold the recommended limit. For safety consideration, these decayed potatoes should be systematically set aside. The accumulation of α-chaconine and solanine in potatoes can be seen as an attractive source of solanidine that is an important precursor for hormone synthesis and some pharmacologically active compounds. To this end, we proposed herein a simple chemo-enzymatic protocol comprising a partial acidic hydrolysis followed by an enzymatic treatment with the β-glycosidase from Periplaneta americana whose gene was isolated from a cDNA genomic library in order to detoxify these compounds and produce solanidine.

La synthèse d’oligosides complexes reste difficilement réalisable par voie chimique. Le recours aux catalyseurs enzymatiques permettrait de pallier aux contraintes de la chimie mais les enzymes naturelles ne présentent pas toujours les propriétés adéquates et nécessitent d’être optimisées par ingénierie moléculaire. Le couplage de la chimie et de biocatalyseurs conçus « sur mesure », peut offrir une alternative prometteuse pour explorer de nouvelles voies de synthèse des sucres, notamment pour la mise au point de glycovaccins. L’objectif de cette thèse a ainsi visé à mettre en œuvre des stratégies d’ingénierie semi-rationnelles de l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (ASNp), une α-transglucosylase utilisant le saccharose comme substrat, afin de concevoir de nouvelles spécificités de substrats et d’étendre le potentiel de cette enzyme à catalyser de nouvelles réactions, permettant ainsi d’aller bien au-delà de ce que la Nature peut offrir. Dans une première étude, une approche assistée par ordinateur a été suivie afin de remodeler le site actif de l’enzyme (sous-sites +1, +2 et +3) pour la reconnaissance et la glucosylation en α-1,4 d’un accepteur disaccharidique non-naturel (l’allyl 2-deoxy-2-N-trichloroacetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranose). Le produit attendu, un trisaccharide, est un précurseur dans la synthèse chimio-enzymatique des oligosaccharides mimant les unités répétitives des lipopolysaccharides de Shigella flexneri, dont l’utilisation ultime est le développement de vaccins contre la Shigellose. Une approche computationnelle faisant appel à des outils dédiés au design automatisé de protéines et à une analyse des séquences a conduit au design d’une librairie d’environ 2.7x104 séquences, qui a ensuite été construite expérimentalement puis criblée. Au final, 55 variants actifs sur saccharose (le substrat donneur) ont été identifiés, et un mutant, appelé F3, a révélé sa capacité à glucosyler en α-1,4 le disaccharide cible. De manière étonnante, ce mutant possède 7 mutations au sein de son site actif, nécessaires au déploiement de sa nouvelle spécificité tout en maintenant son aptitude à utiliser le saccharose comme donneur d'unité glucosyle. Dans une deuxième étude, trois variants ont été identifiés lors du criblage de la librairie semi-rationnelle sur saccharose comme présentant de nouvelles spécificités de produits. Ces mutants ont été caractérisés plus en détails, ainsi que leurs produits, sur un plan biochimique et structural. Ces mutants, appelés 37G4, 39A8 et 47A10, contiennent entre 7 et 11 mutations dans leur site actif. Il a été montré qu’ils étaient capables de reconnaitre le saccharose et le maltose (un produit de la réaction avec le saccharose) comme donneur et accepteur pour synthétiser en quantités variables de l’erlose (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-Glucopyranosyl-(1→2)-β-D-Fructose) et du panose (α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucose), des molécules non produites par l’enzyme sauvage. Des taux de production relativement élevés ont été obtenus pour ces molécules, dont les propriétés acariogènes et le pouvoir sucrant pourraient présenter un intérêt applicatif pour l’industrie alimentaire. Dans une dernière partie, un autre mutant, appelé 30H3, a été isolé lors du criblage primaire de la librairie de par son activité élevée sur saccharose (une amélioration d’un facteur 6.5 comparé à l’enzyme sauvage). Après caractérisation, le mutant s’est avéré synthétiser un profil unique de produits en comparaison de l’enzyme sauvage ASNp. Il s’est ainsi montré très efficace pour la synthèse de maltooligosaccharides solubles, de taille de chaînes contrôlée allant d’un DP 3 à 21, et de faible polydispersité. Aucun polymère insoluble n’a été identifié. La structure 3D du mutant résolue par cristallographie des rayons X a révélé un agrandissement de la poche catalytique en raison de la présence de 9 mutations introduites dans la première sphère.... / Chemical synthesis of complex oligosaccharides still remains critical. Enzymes have emerged as powerful tools to circumvent chemical boundaries of glycochemistry. However, natural enzymes do not necessarily display the required properties and need to be optimized by molecular engineering. Combined use of chemistry and tailored biocatalysts may thus be attractive for exploring novel synthetic routes, especially for glyco-based vaccines development. The objective of this thesis was thus to apply semi-rational engineering strategies to Neisseria polysaccharea amylosucrase (NpAS), a sucrose-utilizing α-transglucosylase, in order to conceive novel substrate specificities and extend the potential of this enzyme to catalyze novel reactions, going beyond what nature has to offer. In a first study, a computer aided-approach was followed to reshape the active site of the enzyme (subsites +1, +2 and +3) for the recognition and α-1,4 glucosylation of a non-natural disaccharide acceptor molecule (allyl 2-deoxy-2-N-trichloroacetyl-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranose). The trisaccharide product is a building block for the chemo-enzymatic synthesis of oligosaccharides mimicking the repetitive units of the Shigella flexneri lipopolysaccharides, and ultimately, for the production of a vaccine against Shigellosis disease. Using computational tools dedicated to the automated protein design, combined with sequence analysis, a library of about 2.7x104 sequences was designed and experimentally constructed and screened. Altogether, 55 mutants were identified to be active on sucrose (the donor substrate), and one, called mutant F3, was subsequently found able to catalyze the α-1,4 glucosylation of the target disaccharide. Impressively, this mutant contained seven mutations in the first shell of the active site leading to a drastic reshaping of the catalytic pocket without significantly perturbing the original specificity for sucrose donor substrate. In a second study, three variants were identified from the screening of the semi-rational library on sole sucrose as displaying totally novel product specificities. They were further characterized, as well as their products, at both biochemical and structural level. These mutants, called 37G4, 39A8 and 47A10, contained between 7 and 11 mutations into their active site. They were found able to use sucrose and maltose (a reaction product from sucrose) as both donor and acceptor substrates to produce in varying amounts erlose (α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-Glucopyranosyl-(1→2)-β-D-Fructose) and panose (α-D-Glucopyranosyl-(1→6)-α-D-Glucopyranosyl-(1→4)-α-D-glucose) trisaccharides, which are not produced at all by parental wild-type enzyme. Relatively high yields were obtained for the production of these molecules, which are known to have acariogenic and sweetening properties and could be of interest for food applications. In a last part, another mutant 30H3 was isolated due to its high activity on sucrose (6.5-fold improvement compared to wild-type activity) from primary screening of the library. When characterized, the mutant revealed a singular product profile compared to that of wild-type NpAS. It appeared highly efficient for the synthesis of soluble maltooligosaccharides of controlled size chains, from DP 3 to 21, and with a low polydispersity. No formation of insoluble polymer was found. The X-ray structure of the mutant was determined and revealed the opening of the catalytic pocket due to the presence of 9 mutations in the first sphere. Molecular dynamics simulations suggested a role of mutations onto flexibility of domain B’ that might interfere with oligosaccharide binding and explain product specificity of the mutant.