<p>The interaction of human tumor viruses with host growth suppressive pathways is a fine balance between controlled latent infection and virus-induced oncogenesis. This dissertation elucidates how Epstein-Barr virus interacts with the host growth suppressive DNA damage response signaling pathways (DDR) in order to transform infected human B lymphocytes. </p><p> Here I report that the activation of the ATM/Chk2 branch of the DDR in hyper-proliferating infected B cells results in G1/S cell cycle arrest and limits viral-mediated transformation. Similar growth arrest was found in mitogen-driven proliferating of B cells that sets the DDR as a default growth suppressive mechanism in human B cells. Hence, the viral protein EBNA3C functions to attenuate the host DDR and to promote immortalization of a small portion of infected B cells. Additionally, the pharmacological inhibition of the DDR in vitro increases viral immortalization of memory B cells that facilitates the isolation of broadly neutralizing antibodies to various infectious agents. Overall, this work defines early EBV-infected hyper-proliferating B cells as a new stage in viral infection that determines subsequent viral-mediated tumorigenesis.</p> / Dissertation

Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2 a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les cellules U2OS. / Centrosomes function primarily as microtubule-organizing centres and play a crucial role during mitosis by organizing the bipolar spindle. In addition to this function, centrosomes act as reaction centers where numerous key regulators meet to control cell cycle progression. One of these factors involved in genome stability, the checkpoint kinase CHK2, was shown to localize at centrosomes throughout the cell cycle. Here, we clarify that CHK2 only localized at centrosomes during mitosis. Using wild-type and CHK2-/- HCT116 human colon cancer cells, or human osteosarcoma U2OS cells depleted for CHK2 with small hairpin RNAs, we show that several CHK2 antibodies are non-specific for immunofluorescence and cross-react with an unknown centrosomal protein(s). To analyse further CHK2 localization, we established cells expressing inducible GFP-CHK2 and Flag-CHK2 fusion proteins. We show that CHK2 localizes to the nucleus in interphase cells but that a fraction of CHK2 associates with centrosomes in mitotic cells, from early mitotic stages until cytokinesis. In contrast to previous data obtained by A. Stolz and colleagues with the human colon carcinoma HCT116 cell line, our experiments exploring the possible functions for CHK2 during mitosis did not support a role for CHK2 in the bipolar spindle formation and the timely progression of mitosis in human osteosarcoma U2OS cells.

An intact cellular response to DNA damage is important for the maintenance of genomic stability and tumour prevention. EDD, the human orthologue of Drosophila melanogaster ???hyperplastic discs???, is over-expressed or mutated in a number of common human cancers. EDD is a progestin regulated gene that encodes an E3 ubiquitin ligase involved in cell communication and cell adhesion, and although it has also been implicated in the DNA damage response through its association with DNA damage proteins, a definitive role has yet to be demonstrated. The work presented herein shows that EDD is necessary for an adequate cellular response to double-strand DNA breaks. Cells depleted of EDD exhibit reduced survival, radio-resistant DNA synthesis and failure to maintain G2/M arrest following DNA damage induced by phleomycin exposure. Furthermore, EDD-depleted cells display impaired activating phosphorylation and kinase activity of the checkpoint kinase CHK2 after DNA damage. These effects appear to be largely modulated through a phospho-dependent interaction involving the CHK2 FHA domain and a region of EDD spanning a number of putative FHA-binding threonines. These results identify EDD as a novel mediator in DNA damage signal transduction via CHK2 and emphasise the potential importance of EDD in cancer.

Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/- ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2 a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2, nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les cellules U2OS. / Centrosomes function primarily as microtubule-organizing centres and play a crucial role during mitosis by organizing the bipolar spindle. In addition to this function, centrosomes act as reaction centers where numerous key regulators meet to control cell cycle progression. One of these factors involved in genome stability, the checkpoint kinase CHK2, was shown to localize at centrosomes throughout the cell cycle. Here, we clarify that CHK2 only localized at centrosomes during mitosis. Using wild-type and CHK2-/- HCT116 human colon cancer cells, or human osteosarcoma U2OS cells depleted for CHK2 with small hairpin RNAs, we show that several CHK2 antibodies are non-specific for immunofluorescence and cross-react with an unknown centrosomal protein(s). To analyse further CHK2 localization, we established cells expressing inducible GFP-CHK2 and Flag-CHK2 fusion proteins. We show that CHK2 localizes to the nucleus in interphase cells but that a fraction of CHK2 associates with centrosomes in mitotic cells, from early mitotic stages until cytokinesis. In contrast to previous data obtained by A. Stolz and colleagues with the human colon carcinoma HCT116 cell line, our experiments exploring the possible functions for CHK2 during mitosis did not support a role for CHK2 in the bipolar spindle formation and the timely progression of mitosis in human osteosarcoma U2OS cells.

An intact cellular response to DNA damage is important for the maintenance of genomic stability and tumour prevention. EDD, the human orthologue of Drosophila melanogaster ???hyperplastic discs???, is over-expressed or mutated in a number of common human cancers. EDD is a progestin regulated gene that encodes an E3 ubiquitin ligase involved in cell communication and cell adhesion, and although it has also been implicated in the DNA damage response through its association with DNA damage proteins, a definitive role has yet to be demonstrated. The work presented herein shows that EDD is necessary for an adequate cellular response to double-strand DNA breaks. Cells depleted of EDD exhibit reduced survival, radio-resistant DNA synthesis and failure to maintain G2/M arrest following DNA damage induced by phleomycin exposure. Furthermore, EDD-depleted cells display impaired activating phosphorylation and kinase activity of the checkpoint kinase CHK2 after DNA damage. These effects appear to be largely modulated through a phospho-dependent interaction involving the CHK2 FHA domain and a region of EDD spanning a number of putative FHA-binding threonines. These results identify EDD as a novel mediator in DNA damage signal transduction via CHK2 and emphasise the potential importance of EDD in cancer.

La dérégulation du système de surveillance qui bloque la prolifération lorsque l'intégrité du génome est compromise fait partie intégrante de la cancérogenèse. Nous cherchons à décortiquer les mécanismes qui, en phase G2, orchestrent l'arrêt du cycle cellulaire, irréversible, en présence des lésions de l'ADN (sénescence) ou réversible (quiescence), en absence de signaux mitogéniques ou confluence. L'objectif du premier volet fut d'élucider les rôles respectifs de l'inhibiteur de CDK (CKI) p21Waf1 et des kinases Chk1 et Chk2 dans l'arrêt en G2 dû au stress génotoxique menant à la sénescence. Nous avons montré que dans les cellules humaines normales cet arrêt nécessite l'action de p21 et Chk1 tandis que Chk2 n'est pas requise. Au contraire, dans plusieurs lignées cancéreuses, malgré la présence de p53, ce rôle de p21 est compromis à cause d'une activation inefficace de la kinase ATM. Par conséquent, en dépit d'une forte activation de Chk1 bloquant la mitose, ces cellules ne parviennent pas à initier la sénescence (Lossaint et al., soumis). L'objectif du deuxième volet fut de mettre en évidence le programme déclenchant la quiescence lors de confluence ou en absence de sérum. Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que cette décision pouvait être prise avant la mitose même si l'arrêt du cycle n'a lieu qu'en phase G1 suivante. En étudiant les fibroblastes synchronisés nous avons trouvé que la quiescence est précédée par l'inhibition pré-mitotique de la phosphorylation de pRb due à une diminution de cycline D1 et une stabilisation du CKI p27Kip1 (Chassot et al., 2008). De plus, nos résultats récents montrent que la présence de sérum entre le point R et la mitose est requise pour initier la réplication de l'ADN au cycle suivant. Les travaux futurs devraient élucider comment différentes voies de signalisation, via la voie cycline D-pRb, affectent divers composants de l'appareil de réplication de l'ADN pour inhiber la progression du cycle de façon réversible ou irréversible. / Cancer is a multi-step process resulting from abrogation of several barriers to uncontrolled proliferation. They include inhibitory pathways with appropriate checkpoints that lead to reversible (quiescence) or irreversible (senescence, apoptosis) block of cell proliferation. We are especially interested in pathways orchestrating cell cycle exit that operate in the G2 phase. The first objective of this thesis was to decipher mechanisms that prevent mitosis in response to DNA damage. We found that Cdk inhibitor p21Waf1 plays a crucial role in blocking mitotic onset in normal cells; acting in tandem with checkpoint kinase Chk1, p21 inactivates mitotic Cdks and inhibits pRb phosphorylation, thereby irreversibly blocking mitotic entry. In contrast, in p53-proficient transformed cells, the induction of p21 in G2 is impaired, most likely because of deficient ATM activation. While, in some cases, Chk1 hyper-activation prevents mitosis, the absence of p21 compromises the senescence program from G2. Finally, we showed that Chk2 is dispensable for G2 arrest in both non-transformed and transformed cells (Lossaint et al., submitted). Our second objective was to elucidate the pathways that induce quiescence (G0). This reversible cell cycle exit occurs in G1, requires pRb family members and p27Kip1-dependent Cdk inactivation. Based on observations obtained in our team and the data in the literature, we hypothesized that reversible cell cycle exit program might be launched before mitosis. By using an in vitro wounding model, we showed that confluence-driven quiescence is preceded by pre-mitotic CDK inhibition by p27, cyclin D1 downregulation and reduced pre-mitotic pRb phosphorylation (Chassot et al., 2008). Moreover, our results obtained in synchronized fibroblasts that were serum-starved after release from G1/S block suggest that cyclin D1 might stimulate proliferation by keeping pocket proteins phosphorylated during G2/M progression (Lossaint et al., in preparation).

Les ectéinascidines (la trabectédine, la lurbinectédine) sont de nouveaux dérivés de produits naturels marins qui se lient de façon covalente à l'ADN, actifs contre les cancers chimio-résistants. L'objectif de ma thèse est 1) d'identifier les principales voies de transduction activées en réponse à l'apparition des lésions de l'ADN induites par les ETs 2) d'établir si l'abrogation pharmacologique de la réponse cellulaire induite par l'endommagement de l'ADN (ATM, ATR, Chk1, Chk2) peut moduler l'activité thérapeutique des ETs. Dans un premier temps, nous avons montré que la voie ATR/Chk1 activée principalement en réponse à l'apparition d'un stress réplicatif et la voie ATM/Chk2 qui initie la réponse cellulaire suite à la formation de lésions double-brins, sont activées en réponse aux adduits créés par les ETs. Dans un second temps, nous avons montré que les combinaisons des ETs avec les inhibiteurs Chk1/Chk2 ou les inhibiteurs ATR ou ATM seuls s'accompagnent d'une modeste potentialisation. Inversement, la combinaison simultanée des ETs avec les inhibiteurs ATR et ATM entraine une forte synergie dans les modèles du cancer de l'utérus et de l'ovaire sensibles ou résistants au cisplatine. Enfin, nous avons montré que cette potentialisation passe par l'inhibition du recrutement des protéines impliquées dans l'initiation et la réalisation des mécanismes de réparation par recombinaison homologue. Ces résultats suggèrent qu'en inhibant simultanément les vois initiés par ATR et ATM, l'activité thérapeutique des ETs pourrait être potentialisée en clinique. / Ecteinascidins (Trabectedin, Lurbinectedin) are novel marine derived natural products, DNA minor groove binders and active against chemo-resistant cancers. The purpose of my thesis was to 1) characterize the DNA damage response (DDR) to both trabectedin and lurbinectedin 2) to establish whether the pharmacological abrogation of cell response induced by DNA damage (ATM, ATR, Chk1, Chk2) can modulate the therapeutic activity of ETs. Our results show that both compounds activate the ATM/Chk2 (ataxia-telangiectasia mutated/checkpoint kinase 2) and ATR/Chk1 (ATM and RAD3-related/checkpoint kinase 1) pathways. Interestingly, the pharmacological inhibition of either Chk1/2, ATR or ATM kinases is not accompanied by a significant improvement of either trabectedin or lurbinectedin cytotoxic activity. However, the simultaneous inhibition of both ATM and ATR strongly potentiates the activity of both ETs. Importantly, these results are not restricted to HeLa cells but can also be extended to cisplatin-sensitive or -resistant ovarian carcinoma cell lines. Finally, we showed that the concomitant inhibition of both ATR and ATM is an absolute requirement to efficiently block the initiation and realization of homologous recombination repair mechanisms. Together, our data identify ATR and ATM as central coordinators of the DDR to trabectedin and lurbinectedin and provide a mechanistic rational for combinations of these compounds with both ATR and ATM inhibitors.