Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Introduction: Des résultats récents indiquent que l’acétylcholine joue un rôle protecteur contre les insuffisances cardiaques et les fibrillations atriales ou ventriculaires. Les cholinestérases (ChE) contrôlent le niveau d’acétylcholine et jouent donc un rôle important pour le système cholinergique du cœur. Cependant, ces enzymes dans le cœur sont peu connues. L'objectif de cette thèse est d’étudier l'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE) dans le cœur, de quantifier ces enzymes et leurs formes moléculaires et localiser au niveau cellulaire. Méthodes : Nous avons utilisé des souris sans AChE ou BChE et sans ColQ et PRiMA leur protéines d’ancrage. Les activités de l’AChE et de la BChE ont été déterminées par la méthode d’Ellman, que nous avons adaptée pour la faible quantité de ChE dans un extrait brut. Les formes moléculaires des ChE ont été séparées en gradient de saccharose 5-20% et localisées dans des cœurs gonflés par la gélatine et sur coupe à froid. La morphologie globale du cœur a été étudiée en coupes transversales colorées avec l’hématoxyline et l’éosine. Résultats et conclusions : La plus forte activité en AChE a été mesurée dans les oreillettes, la plus faible activité dans le ventricule gauche et le septum. Dans tous les compartiments, PRiMA AChE et ColQ AChE ont été observés. Chacune des formes ancrées est distribuée sur l’épicarde à la base du cœur, et sont co-localisées avec des neurones intracardiaques. PRiMA AChE forme des branches fines à proximité des neurones intracardiaques. L’absence d’ancrage de l’AChE aboutit à une diminution significative du diamètre des cardiomyocytes. L’activité de la BChE est plus élevée que celle de l’AChE. La plus haute activité en BChE a été détectée dans le ventricule gauche et le septum. Le monomère amphiphilic constitue la forme prédominante dans le cœur. Dans le myocarde, le marquage de l’activité BChE est diffus, alors que dans l’épicarde il colocalise avec un seul neurone intracardiaque. Dans ce travail, nous avons réalisé une étude complète des ChE dans le cœur. Nos résultats peuvent aider à définir de nouvelles thérapies pharmacologiques plus efficaces. / Introduction: The results of current research suggest that acetylcholine has a protective role during heart failure and atrial or ventricular fibrillation. Cholinesterases (ChE) control the level of acetylcholine and thus play an important role in the cholinergic system of the heart. However, detail information about these enzymes in the heart is still missing. The aim of this thesis was to provide a complex study of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) in the heart, specifically of their activities, molecular forms and precise localization. Methods: Mutant mice with lack of ChE or their anchoring proteins, ColQ and PRiMA, were used. AChE and BChE activities in heart compartments were determined by 2-step Ellman’s method, developed by us. Molecular forms of ChE were determined in 5-20 % sucrose gradients and localized in the hearts filled with gelatin and in the cryosections by activity staining method and by immunohistochemistry. Nerve and endothelial cells were identified using specific markers. Basic heart morphology was studied in the transversal sections stained with hematoxyline and eosine. Results and conclusion: The highest AChE activity was determined in the atria, the lowest activity in the left ventricle and septum. In all compartments, PRiMA AChE and ColQ AChE were observed. Both anchored forms were distributed epicardially on the heart base, co-localized with intracardiac neurons. PRiMA AChE formed a subtle branching in the proximity of intracardiac neurons. The lack of AChE anchored forms led to significantly lower cardiomyocyte diameter. The BChE activity was higher than that of AChE. The highest BChE activity was detected in the left ventricle and septum. Amphiphilic monomers were the predominant form of BChE in the heart. In myocardium, the staining of BChE activity was diffused, while in epicardium it co-localized with a single intracardiac neuron. In this work, we have provided a complex study of ChE in heart. Our results could help in the design of new, more effective pharmacotherapy, which may reduce morbidity and mortality of the patients with various heart diseases. / Úvod: Výsledky súčasného výskumu nasvedčujú protektívnemu vplyvu acetylcholínu pri srdcovom zlyhávaní, či pri predsieňovej a komorovej fibrilácií. Cholínesterázy (ChE) regulujú hladinu acetylcholínu a tak zohrávajú dôležitú úlohu v cholinergickom systéme srdca. Avšak, hlbšie informácie o týchto enzýmoch v srdci chýbajú. Cieľom tejto práce bolo komplexné štúdium acetylcholínesterázy (AChE) a butyrylcholínesterázy (BChE) v srdci, konkrétne ich aktivít, molekulových foriem a presnej lokalizácie. Metódy: V projekte sme používali mutantné myši s chýbaním ChE alebo ich kotviacich proteínov, ColQ a PRiMA. Aktivity AChE a BChE sme v jednotlivých častiach srdca stanovili nami vyvinutou modifikovanou dvoj-krokovou Ellmanovou metódou. Molekulové formy ChE sme študovali v 5-20 % sacharózových gradientoch. ChE sme lokalizovali v srdciach vyplnených želatínou a v kryostatických rezoch, a to pomocou aktivitného farbenia a imunohistochémiou. Nervové a endotelové bunky sme identifikovali na základe špecifických markerov. Základnú morfológiu tkaniva sme študovali v priečnych rezoch srdca nafarbených hematoxylínom a eozínom. Výsledky a záver: V predsieňach sme pozorovali najvyššiu a v ľavej komore a septe najnižšiu aktivitu AChE, kotvenú pomocou PRiMA aj ColQ proteínov. PRiMA AChE aj ColQ AChE boli v epikarde distribuované na báze srdca a ko-lokalizované s intrakardiálnymi neurónmi. PRiMA AChE vytvárala jemnú spleť v blízkosti intrakardiálnych neurónov. Chýbanie kotvených foriem AChE viedlo ku signifikantne menším priemerom kardiomyocytov. Aktivita BChE v srdci bola vyššia ako aktivita AChE, s najvyššou aktivitou v ľavej komore a septe. Predominatnou formou BChE v srdci boli amfifilné monoméry. BChE aktivita bola v myokarde lokalizovaná difúzne a v epikarde ko-lokalizovala s jedným intrakardiálnym neurónom. V predloženej práci sme poskytli komplexný obraz o ChE v srdci. Naše výsledky môžu vo významnej miere napomôcť v dizajne novej, efektívnejšej farmakoterapie, ktorá by mohla znížiť morbiditu a mortalitu pacientov s vybranými chorobami srdca.

Introduction: Des résultats récents indiquent que l’acétylcholine joue un rôle protecteur contre les insuffisances cardiaques et les fibrillations atriales ou ventriculaires. Les cholinestérases (ChE) contrôlent le niveau d’acétylcholine et jouent donc un rôle important pour le système cholinergique du cœur. Cependant, ces enzymes dans le cœur sont peu connues. L'objectif de cette thèse est d’étudier l'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE) dans le cœur, de quantifier ces enzymes et leurs formes moléculaires et localiser au niveau cellulaire. Méthodes : Nous avons utilisé des souris sans AChE ou BChE et sans ColQ et PRiMA leur protéines d’ancrage. Les activités de l’AChE et de la BChE ont été déterminées par la méthode d’Ellman, que nous avons adaptée pour la faible quantité de ChE dans un extrait brut. Les formes moléculaires des ChE ont été séparées en gradient de saccharose 5-20% et localisées dans des cœurs gonflés par la gélatine et sur coupe à froid. La morphologie globale du cœur a été étudiée en coupes transversales colorées avec l’hématoxyline et l’éosine. Résultats et conclusions : La plus forte activité en AChE a été mesurée dans les oreillettes, la plus faible activité dans le ventricule gauche et le septum. Dans tous les compartiments, PRiMA AChE et ColQ AChE ont été observés. Chacune des formes ancrées est distribuée sur l’épicarde à la base du cœur, et sont co-localisées avec des neurones intracardiaques. PRiMA AChE forme des branches fines à proximité des neurones intracardiaques. L’absence d’ancrage de l’AChE aboutit à une diminution significative du diamètre des cardiomyocytes. L’activité de la BChE est plus élevée que celle de l’AChE. La plus haute activité en BChE a été détectée dans le ventricule gauche et le septum. Le monomère amphiphilic constitue la forme prédominante dans le cœur. Dans le myocarde, le marquage de l’activité BChE est diffus, alors que dans l’épicarde il colocalise avec un seul neurone intracardiaque. Dans ce travail, nous avons réalisé une étude complète des ChE dans le cœur. Nos résultats peuvent aider à définir de nouvelles thérapies pharmacologiques plus efficaces. / Introduction: The results of current research suggest that acetylcholine has a protective role during heart failure and atrial or ventricular fibrillation. Cholinesterases (ChE) control the level of acetylcholine and thus play an important role in the cholinergic system of the heart. However, detail information about these enzymes in the heart is still missing. The aim of this thesis was to provide a complex study of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) in the heart, specifically of their activities, molecular forms and precise localization. Methods: Mutant mice with lack of ChE or their anchoring proteins, ColQ and PRiMA, were used. AChE and BChE activities in heart compartments were determined by 2-step Ellman’s method, developed by us. Molecular forms of ChE were determined in 5-20 % sucrose gradients and localized in the hearts filled with gelatin and in the cryosections by activity staining method and by immunohistochemistry. Nerve and endothelial cells were identified using specific markers. Basic heart morphology was studied in the transversal sections stained with hematoxyline and eosine. Results and conclusion: The highest AChE activity was determined in the atria, the lowest activity in the left ventricle and septum. In all compartments, PRiMA AChE and ColQ AChE were observed. Both anchored forms were distributed epicardially on the heart base, co-localized with intracardiac neurons. PRiMA AChE formed a subtle branching in the proximity of intracardiac neurons. The lack of AChE anchored forms led to significantly lower cardiomyocyte diameter. The BChE activity was higher than that of AChE. The highest BChE activity was detected in the left ventricle and septum. Amphiphilic monomers were the predominant form of BChE in the heart. In myocardium, the staining of BChE activity was diffused, while in epicardium it co-localized with a single intracardiac neuron. In this work, we have provided a complex study of ChE in heart. Our results could help in the design of new, more effective pharmacotherapy, which may reduce morbidity and mortality of the patients with various heart diseases. / Úvod: Výsledky súčasného výskumu nasvedčujú protektívnemu vplyvu acetylcholínu pri srdcovom zlyhávaní, či pri predsieňovej a komorovej fibrilácií. Cholínesterázy (ChE) regulujú hladinu acetylcholínu a tak zohrávajú dôležitú úlohu v cholinergickom systéme srdca. Avšak, hlbšie informácie o týchto enzýmoch v srdci chýbajú. Cieľom tejto práce bolo komplexné štúdium acetylcholínesterázy (AChE) a butyrylcholínesterázy (BChE) v srdci, konkrétne ich aktivít, molekulových foriem a presnej lokalizácie. Metódy: V projekte sme používali mutantné myši s chýbaním ChE alebo ich kotviacich proteínov, ColQ a PRiMA. Aktivity AChE a BChE sme v jednotlivých častiach srdca stanovili nami vyvinutou modifikovanou dvoj-krokovou Ellmanovou metódou. Molekulové formy ChE sme študovali v 5-20 % sacharózových gradientoch. ChE sme lokalizovali v srdciach vyplnených želatínou a v kryostatických rezoch, a to pomocou aktivitného farbenia a imunohistochémiou. Nervové a endotelové bunky sme identifikovali na základe špecifických markerov. Základnú morfológiu tkaniva sme študovali v priečnych rezoch srdca nafarbených hematoxylínom a eozínom. Výsledky a záver: V predsieňach sme pozorovali najvyššiu a v ľavej komore a septe najnižšiu aktivitu AChE, kotvenú pomocou PRiMA aj ColQ proteínov. PRiMA AChE aj ColQ AChE boli v epikarde distribuované na báze srdca a ko-lokalizované s intrakardiálnymi neurónmi. PRiMA AChE vytvárala jemnú spleť v blízkosti intrakardiálnych neurónov. Chýbanie kotvených foriem AChE viedlo ku signifikantne menším priemerom kardiomyocytov. Aktivita BChE v srdci bola vyššia ako aktivita AChE, s najvyššou aktivitou v ľavej komore a septe. Predominatnou formou BChE v srdci boli amfifilné monoméry. BChE aktivita bola v myokarde lokalizovaná difúzne a v epikarde ko-lokalizovala s jedným intrakardiálnym neurónom. V predloženej práci sme poskytli komplexný obraz o ChE v srdci. Naše výsledky môžu vo významnej miere napomôcť v dizajne novej, efektívnejšej farmakoterapie, ktorá by mohla znížiť morbiditu a mortalitu pacientov s vybranými chorobami srdca.

Introduction: Des résultats récents indiquent que l’acétylcholine joue un rôle protecteur contre les insuffisances cardiaques et les fibrillations atriales ou ventriculaires. Les cholinestérases (ChE) contrôlent le niveau d’acétylcholine et jouent donc un rôle important pour le système cholinergique du cœur. Cependant, ces enzymes dans le cœur sont peu connues. L'objectif de cette thèse est d’étudier l'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE) dans le cœur, de quantifier ces enzymes et leurs formes moléculaires et localiser au niveau cellulaire. Méthodes : Nous avons utilisé des souris sans AChE ou BChE et sans ColQ et PRiMA leur protéines d’ancrage. Les activités de l’AChE et de la BChE ont été déterminées par la méthode d’Ellman, que nous avons adaptée pour la faible quantité de ChE dans un extrait brut. Les formes moléculaires des ChE ont été séparées en gradient de saccharose 5-20% et localisées dans des cœurs gonflés par la gélatine et sur coupe à froid. La morphologie globale du cœur a été étudiée en coupes transversales colorées avec l’hématoxyline et l’éosine. Résultats et conclusions : La plus forte activité en AChE a été mesurée dans les oreillettes, la plus faible activité dans le ventricule gauche et le septum. Dans tous les compartiments, PRiMA AChE et ColQ AChE ont été observés. Chacune des formes ancrées est distribuée sur l’épicarde à la base du cœur, et sont co-localisées avec des neurones intracardiaques. PRiMA AChE forme des branches fines à proximité des neurones intracardiaques. L’absence d’ancrage de l’AChE aboutit à une diminution significative du diamètre des cardiomyocytes. L’activité de la BChE est plus élevée que celle de l’AChE. La plus haute activité en BChE a été détectée dans le ventricule gauche et le septum. Le monomère amphiphilic constitue la forme prédominante dans le cœur. Dans le myocarde, le marquage de l’activité BChE est diffus, alors que dans l’épicarde il colocalise avec un seul neurone intracardiaque. Dans ce travail, nous avons réalisé une étude complète des ChE dans le cœur. Nos résultats peuvent aider à définir de nouvelles thérapies pharmacologiques plus efficaces. / Introduction: The results of current research suggest that acetylcholine has a protective role during heart failure and atrial or ventricular fibrillation. Cholinesterases (ChE) control the level of acetylcholine and thus play an important role in the cholinergic system of the heart. However, detail information about these enzymes in the heart is still missing. The aim of this thesis was to provide a complex study of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) in the heart, specifically of their activities, molecular forms and precise localization. Methods: Mutant mice with lack of ChE or their anchoring proteins, ColQ and PRiMA, were used. AChE and BChE activities in heart compartments were determined by 2-step Ellman’s method, developed by us. Molecular forms of ChE were determined in 5-20 % sucrose gradients and localized in the hearts filled with gelatin and in the cryosections by activity staining method and by immunohistochemistry. Nerve and endothelial cells were identified using specific markers. Basic heart morphology was studied in the transversal sections stained with hematoxyline and eosine. Results and conclusion: The highest AChE activity was determined in the atria, the lowest activity in the left ventricle and septum. In all compartments, PRiMA AChE and ColQ AChE were observed. Both anchored forms were distributed epicardially on the heart base, co-localized with intracardiac neurons. PRiMA AChE formed a subtle branching in the proximity of intracardiac neurons. The lack of AChE anchored forms led to significantly lower cardiomyocyte diameter. The BChE activity was higher than that of AChE. The highest BChE activity was detected in the left ventricle and septum. Amphiphilic monomers were the predominant form of BChE in the heart. In myocardium, the staining of BChE activity was diffused, while in epicardium it co-localized with a single intracardiac neuron. In this work, we have provided a complex study of ChE in heart. Our results could help in the design of new, more effective pharmacotherapy, which may reduce morbidity and mortality of the patients with various heart diseases. / Úvod: Výsledky súčasného výskumu nasvedčujú protektívnemu vplyvu acetylcholínu pri srdcovom zlyhávaní, či pri predsieňovej a komorovej fibrilácií. Cholínesterázy (ChE) regulujú hladinu acetylcholínu a tak zohrávajú dôležitú úlohu v cholinergickom systéme srdca. Avšak, hlbšie informácie o týchto enzýmoch v srdci chýbajú. Cieľom tejto práce bolo komplexné štúdium acetylcholínesterázy (AChE) a butyrylcholínesterázy (BChE) v srdci, konkrétne ich aktivít, molekulových foriem a presnej lokalizácie. Metódy: V projekte sme používali mutantné myši s chýbaním ChE alebo ich kotviacich proteínov, ColQ a PRiMA. Aktivity AChE a BChE sme v jednotlivých častiach srdca stanovili nami vyvinutou modifikovanou dvoj-krokovou Ellmanovou metódou. Molekulové formy ChE sme študovali v 5-20 % sacharózových gradientoch. ChE sme lokalizovali v srdciach vyplnených želatínou a v kryostatických rezoch, a to pomocou aktivitného farbenia a imunohistochémiou. Nervové a endotelové bunky sme identifikovali na základe špecifických markerov. Základnú morfológiu tkaniva sme študovali v priečnych rezoch srdca nafarbených hematoxylínom a eozínom. Výsledky a záver: V predsieňach sme pozorovali najvyššiu a v ľavej komore a septe najnižšiu aktivitu AChE, kotvenú pomocou PRiMA aj ColQ proteínov. PRiMA AChE aj ColQ AChE boli v epikarde distribuované na báze srdca a ko-lokalizované s intrakardiálnymi neurónmi. PRiMA AChE vytvárala jemnú spleť v blízkosti intrakardiálnych neurónov. Chýbanie kotvených foriem AChE viedlo ku signifikantne menším priemerom kardiomyocytov. Aktivita BChE v srdci bola vyššia ako aktivita AChE, s najvyššou aktivitou v ľavej komore a septe. Predominatnou formou BChE v srdci boli amfifilné monoméry. BChE aktivita bola v myokarde lokalizovaná difúzne a v epikarde ko-lokalizovala s jedným intrakardiálnym neurónom. V predloženej práci sme poskytli komplexný obraz o ChE v srdci. Naše výsledky môžu vo významnej miere napomôcť v dizajne novej, efektívnejšej farmakoterapie, ktorá by mohla znížiť morbiditu a mortalitu pacientov s vybranými chorobami srdca.

La maladie d'Alzheimer est la pathologie neurodégénérative la plus courante affectant les personnes âgées. Cette neuropathologie se caractérise par une étiologie complexe dont le déficit en acétylcholine, les plaques amyloïdes, les dégénérescences neurofibrillaires ou le stress oxydant en sont les principaux acteurs.Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés à l'application des réactions multicomposants de Ugi et de Passerini, pour la synthèse de nouveaux adduits multi-cibles basées sur différents motifs antioxydants et anticholinestérasiques. Ces réactions permettent d'accéder à une vaste diversité chimique en une étape, ce qui les rend adaptées pour la synthèse rapide de molécules ayant plusieurs pharmacophores d'intérêt et ciblant ainsi différentes cause étiologiques de la maladie d'Alzheimer.Au total, 56 composés finaux, répartis dans cinq séries, ont été synthétisés :les alpha-acylaminocarboxamides prototypes (série A)les hybrides tacrine-acide férulique (série B)les hétérotrimères tacrine-mélatonine-acides antioxydant (série C)> les hybrides donépézil-acide férulique (série D)^ les dérivés chromone (série E)Toutes les séries ont été évaluées pour leur capacité à inhiber les enzymes cholinestérases et leur pouvoir antioxydant. L'hépatotoxicité des séries B et C. portant un motif tacrine, a été évaluée sur les cellules HepG2. Par ailleurs, l'étude de la série B a été complétée par d'autres tests pharmacologiques, physico-chimiques et toxicologiques.Ces différents travaux démontrent et valident l'utilisation des réactions de Ugi et de Passerini dans le développement de molécules multi-cibles pour le traitement potentiel de la maladie d'Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is thé most common type of dementia affecting elderly people. This neuropathology is characterized by a highiy complex and intricated etiology including cholinergic déficit, amyloid deposits, neurofibrillary tangles and oxidative stress.During this thesis, we sought to apply Ugi and Passerini multicomponent reactions for thé synthesis of new multi-target adducts based on différent antioxidant and anticholinergic scaffolds.Thèse réactions provides access to a broad range of chemical diversity in a one-pot fashion, which makes them suitable for thé expeditious synthesis of molécules having several pharmacophores of interest and hitting différent targets related to thé multifaceted etiology of Alzheimer's disease.A total of 56 final compounds, spread over 5 séries, hâve been synthesized:alpha-acylaminocarboxamides prototypes (A séries)tacrine-ferulic acid hybrids (B séries)tacrine-melatonin-antioxydant acids heterotrimers (C séries)donepezil-ferulic acid hybrids (D séries)Chromone derivatives (E séries)Ail thé séries were tested for their ability to inhibit thé cholinesterases enzymes and for their antioxidant power. Hepatotoxicity of thé B and C séries, bearing a tacrine fragment, was evaluated on HepG2 cells. Moreover, thé study of thé B séries was supplemented by further pharmacological, physicochemical and toxicological tests (NMR conformational study, neuroprotection on SH-SY5Y cells. self-induced Abetai.42 peptide aggregation inhibition, docking ADMET).Such work demonstrated and validated thé use of Ugi and Passerini reactions for thé development of new multi-target directed molécules for thé potential treatment of AD.

ColQ est un collagène spécifique ancrant l'acétylcholinestérase (AChE) dans la fente synaptique de la jonction neuromusculaire (JNM). L'importance du complexe AChE-ColQ dans le fonctionnement de cette synapse a été révélée par l'identification de mutations dans le gène humain codant pour ColQ qui sont à l'origine du syndrome myasthénique congénital avec déficience en AChE (SMC-1c). Les défauts présents chez les patients et le phénotype des souris ColQ-/- modèles pour le SMC-1c sont complexes, la déficience en AChE ne rendant probablement pas compte de tous les symptômes. Nous avons donc fait l'hypothèse que ColQ pourrait réguler la formation de la JNM afin d'expliquer certains des défauts observés. J'ai montré que ColQ régule l'expression des sous-unités du récepteur de l'acétylcholine (RACh) via le récepteur tyrosine kinase MuSK, molécule clé dans la formation de la synapse et cela indépendamment de l'AChE. La conséquence de cette régulation est que ColQ contrôle la formation des agrégats de RACh impliqués dans la transmission synaptique. Par ailleurs, mes résultats ont révélé que l'absence de ColQ entraîne une réduction de l'expression de MuSK à la membrane. Cette observation prend tout son intérêt dans un contexte clinique montrant que certains symptômes sont communs aux patients atteints du SMC-1c et du SMC lié à des mutations de MuSK. De plus, des signes d'atrophie musculaire ont été découverts chez la souris ColQ-/- pouvant laisser penser à une dénervation au moins partielle du muscle en absence de ColQ. Mes recherches ont ainsi permis de mettre en évidence des modifications pouvant être à l'origine des défauts fonctionnels observés lorsque ColQ est muté ou absent.