Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

En cas de crise nucléaire impliquant des actinides, il est nécessaire de disposer de méthodes d’analyses rapides afin d’identifier les personnes contaminées. Elles sont réalisées dans les excreta (urines et selles). Les méthodes usuelles d’analyse de ces émetteurs alpha sont performantes, mais elles sont longues et difficiles à mettre en œuvre et, de fait inadaptées à une situation de crise. Ce travail de thèse a donc consisté à développer une méthode d’analyse rapide des actinides dans l’urine par couplage entre une colonne à base de dérivés de calix[6]arène hydroxamique imprégné et un spectromètre de masse couplé à un plasma induit (ICP-MS). L’étude de la spéciation des actinides dans l’urine minéralisée a permis de mieux comprendre les réactions mises en jeu et de maîtriser leur extraction sur la colonne calix[6] arène. Un protocole a pu être élaboré, aboutissant à l’extraction simultanée des trois actinides à pH ≈ 5 puis à leur co-élution avec H3PO4 à 0,25 mol.L-1 avec des rendements de récupération moyens de 56 %, 74 % et 85 % pour U, Pu et Am respectivement. La colonne calix[6]arène a ensuite été couplée l’ICP-MS quadripolaire et les paramètres chromatographiques (diamètre de colonne, débit d’extraction et d’élution) optimisés. Ce système de couplage permet d’atteindre des limites de détection dans l’urine inférieures à 0,5 mBq.L-1 pour 238U et 243Am et inférieure à 5 mBq.L-1pour le 239Pu et 241Am, pour une durée totale d’analyse d’environ 6 heures. Ces performances ont démontré que cette méthode de couplage pourrait être utilisée en situation de crise. / In the event of a nuclear crisis, involving actinides (U, Pu, Am) it is important to have fast analysis methods available in order to identify people that could be contaminated. Usually, they are performed in urine or faeces. Even though, analytical methods used with alpha detection are reliable they are lengthy and tedious to set up. This work consisted in developing an on-line coupling method between a calix[6]arene-based chromatography column and an inductively coupled plasma mass spectrometer (ICP-MS). To do so, a speciation study of actinides in mineralised urine was developed to understand the chemical equilibria happening during the actinides extraction. A protocol was elaborated to extract simultaneously all three actinides at pH ≈ 5, then co-elute them with 0.25 mol.L1 H3PO4. Recovery was 56 %, 74 % and 85 % for U, Pu and Am respectively. The column was then coupled to the ICP-MS. A parameter study helped defining mineralisation duration, extraction and elution flow-rates. It was then possible to propose an on-line coupling system allowing reaching detection limits lower than 0.5 mBq.L-1 for 238U and 243Am and lower than 5 mBq.L-1 for 239Pu and 241Am, for analysis duration lower than 6 hours. These analytical performances show the interest of this technique for a use in a nuclear crisis situation.

Le médicament prophylactique qui a drastiquement réduit l’impact et la sévérité du tétanos sur les populations humaines est le vaccin antitétanique. Son principe actif appelé anatoxine tétanique résulte de l’inactivation au formaldéhyde de la toxine tétanique. Cette détoxification chimique est une étape critique qui détermine la sécurité, l’antigénicité et l’immunogénicité du vaccin. Pour une meilleure compréhension de ce processus chimique, à l’échelle moléculaire, nous avons dans un premier temps caractérisé l’anatoxine tétanique par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem haute résolution (LC-MS/MS) afin d’identifier et de localiser exhaustivement l’ensemble des modifications induites par le formaldéhyde sur la structure tridimensionnelle de la protéine vaccinale. Dans un second lieu, pour un meilleur suivi qualité du procédé industriel de fabrication de l’anatoxine tétanique, nous avons développé des méthodes uniques d’expertise in vitro par LC-MS/MS pour réaliser la quantification relative et/ou absolue de la toxine tétanique, de l’anatoxine tétanique, ainsi que pour effectuer la quantification relative des fragments de toxine chimiquement modifiés par le formaldéhyde. Ces outils de caractérisation sont complémentaires aux méthodes de contrôles qualités existantes et contribuent actuellement à un meilleur suivi de la reproductibilité des lots de vaccins antitétaniques / The prophylactic drug, which has drastically reduced the impact and severity of tetanus on human populations, is the tetanus vaccine. Its active ingredient called tetanus toxoid results from the inactivation of tetanus toxin with formaldehyde. This chemical detoxification is a critical step, which determines the safety, antigenicity and immunogenicity of the vaccine. For a better understanding of this chemical process, at the molecular level, we first characterized tetanus toxoid by liquid chromatography coupled with high-resolution tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in order to fully identify and map all the modifications induced by formaldehyde on the three-dimensional structure of the vaccine protein. In a second step, for a better quality control of the industrial process of manufacturing tetanus toxoid, we developed in vitro expertise methods by LC-MS/MS to perform the relative and/or absolute quantification of tetanus toxin, tetanus toxoid, and to carry out the relative quantification of the toxin fragments chemically modified with formaldehyde. These characterization tools are complementary to existing quality control methods and currently contribute to better monitoring the reproducibility of tetanus vaccine batches

Ce travail consistait à caractériser et suivre les changements de la composition chimique des cidres à distiller durant leur élaboration. Pour répondre à cet objectif, pendant deux campagnes de production (2007/2008 et 2008/2009), une centaine d'échantillons de cidre a été prélevée sur 4 cuves différentes se déclinant sous deux AOC et trois savoirs faire (industriel, artisanal et fermier). Les teneurs en sucres ont été déterminées par dosage enzymatique, les acides malique et lactique ont été dosés par CLHP/UV et les composés volatils ont été suivis par CPG/SM après SPE et concentration. De manière générale, les sucres sont consommés rapidement dans le cas de cuves industrielles contrairement aux cuves artisanale et fermière, au frais et de plus petit volume. Des fermentations malolactiques (FML) ont été repérées seulement pour les cuves industrielles et pour la cuve artisanale sur une année. Quand elle a lieu, la FML se déroule très rapidement (moins d'un mois) et de façon simultanée avec la fermentation alcoolique. L'apparition d'une FML se caractérise par l'apparition d'acétates (acétate de 2-phényléthyle et de 3-méthylbutyle) en début de procédé et une présence importante d'acide carboxyliques et de dérivés volatils des acides lactique et succinique plutôt en fin. In fine, des composés comme l'acétoïne, le butanol et l'hexanol sont présents de manière plus importante dans les cidres où une FML n'a pas lieu. En revanche, peu de différences ont été observées pour l'évolution régulière des alcools supérieurs. Un contrôle systématique des pommes et de la température des cuves permettrait d'obtenir une meilleure répétabilité du cidre à distiller.

La séparation d'énantiomères suscite un vif intérêt pour les industries pharmaceutiques, chimiques et agroalimentaires. Les dérivés lipophiles de la néamine ont été utilisés en tant que nouveaux ligands en chromatographie chirale par échange de ligands. Ce travail s'est attaché à étudier les propriétés énantiosélectives des dérivés lipophiles de la néamine en CLHP et en EC. Des dérivés de la néamine (néamine 4'-mono C18, néamine 5-mono C18, néamine 6-mono C18, néamine 3',6-di C18, néamine 4',5-di C18, ou néamine 3′,6-di méthylnaphthalène), ont été synthétisés au sein de notre laboratoire et immobilisés de manière non covalente sur des supports chromatographiques de type C18 et graphite poreux et utilisés avec succès en CCEL pour séparer divers couples d'énantiomères d'acides aminés, de nucléosides et de dipeptides. Néanmoins, certaines molécules hydrophobes, comme le tryptophane, sont éluées trop tardivement et par conséquent, ne sont pas détectables. Pour remédier à ce problème, nous avons considéré la propriété de la néamine 4'-mono C18 à former des micelles, et avons envisagé son utilisation en MEKC. Les énantiomères du tryptophane sont séparés en moins de cinq minutes. Les effets de différentes conditions (concentration du sélecteur chiral, addition de méthanol dans le tampon de migration) sur le temps de migration ont été évalués. Cette méthode d'analyse a ensuite été testée avec succès sur d'autres analytes hydrophobes tels que le 1-méthyl-tryptophane, la 3,5-diiodo-tyrosine et la 1-naphtyl-alanine.

Les acides aminés sont des éléments chiraux essentiels de la vie, ils ont des effets biologiques et pharmacologiques très importants. La séparation chirale des énantiomères des acides aminés est indispensable dans de nombreux domaines tels que l'industrie pharmaceutique, l'agroalimentaire, l'archéologie et la médecine légale. La chromatographie liquide haute performance (CLHP) avec l'utilisation d'une phase stationnaire chirale constitue à l'heure actuelle la méthode de choix pour séparer des énantiomères. Ce travail a permis d'étudier les mécanismes d'interactions mis en jeu dans la fixation et la séparation des énantiomères du tryptophane sur des phases stationnaires chirales (PSCs) de type teicoplanine et teicoplanine aglycone (TAG). Une étude thermodynamique comparative entre ces deux PSCs a permis de déterminer le rôle négatif joué par les trois unités saccharidiques de la teicoplanine dans le processus de discrimination chirale du tryptophane. Ainsi, nous avons montré que cet acide aminé interagit considérablement avec la poche aglycone de la teicoplanine. L'utilisation d'une nouvelle PSC de type teicoplanine, immobilisée de manière non-covalente sur des supports chromatographiques de type C8 et C18, a permis de séparer quelques acides aminés aromatiques et d'inverser leur ordre d'élution énantiomérique (L>D) par rapport à celui classiquement obtenu avec une immobilisation covalente sur gel de silice (D>L). Par ailleurs, nous avons développé une nouvelle classe de sélecteurs chiraux à base d'aminoglycosides en chromatographie chirale d'échange de ligands. Plusieurs énantiomères d'acides aminés et de nucléosides ont été séparés avec succès sur ce nouveau type de PSCs.

Les acides gras de la série n-3 et notamment l'acide docosahexaénoïque (DHA) jouent un rôle important dans la prévention des maladies cardiovasculaires. Un de ses métabolites, la protectine DX (PDX), qui est un isomère de la protectine D1 (PD1), inhibe l'agrégation des plaquettes sanguines. D'autres composés similaires appelés "poxytrins", qui possèdent aussi un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, ont également été synthétisés à partir d'autres acides gras polyinsaturés (AGPI) via la lipoxygénase de soja. Ces composés présentent des propriétés anti-agrégantes en inhibant la cyclo-oxygénase plaquettaire et le récepteur du thromboxane A2. Dans cette thèse, nous décrivons de nouveaux composés dihydroxylés synthétisés par la 15-lipoxygénase de soja à partir de l'acide alpha-linolénique (18:3n-3), un acide gras polyinsaturé indispensable consommé au niveau du gramme chez l'Homme adulte. Il est converti en acides gras monohydroxylés et dihydroxylés. Ces composés ont été séparés par HPLC en phase inverse et caractérisés par GC-MS après dérivation adéquate. Un acide gras monohydroxylé, majoritaire, l'acide 13(S)-octadécatriénoïque et quatre acides gras dihydroxylés ont été détectés. Ces derniers présentent tous un spectre UV caractéristique avec une absorption maximale à 270 nm et deux épaulements à 260 et 280 nm. Les spectres UV de deux d'entre eux sont superposables à celui de la PDX, ce qui suggère une géométrie E,Z,E des doubles liaisons de leur triène. La caractérisation complète de ces composés a été réalisée par RMN à haut champ et par GC-MS. Ce sont les acides 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12E,14E-triénoïque, 9(S),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque et 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïque. Ils sont également synthétisés par la 15 lipoxygénase recombinante humaine de type 2. Ces composés dihydroxylés 9,16-diHOTEs ont été testés sur les plaquettes isolées à partir du sang humain. Nous avons observé que seules les molécules ayant la géométrie E,Z,E du triène conjugué inhibent l'agrégation plaquettaire induite par le collagène et inhibent la cyclooxygénase-1 (COX-1) de mouton. Les propriétés anti-inflammatoires de ces produits ont également été étudiés. Tous les isomères 9,16-diHOTEs, possédant un triène conjugué avec une géométrie E,Z,E, inhibent la COX-2 recombinante humaine et seul l'acide 9(R),16(S)-dihydroxy-octadéca-10E,12Z,14E-triénoïques inhibe la 5-lipoxygénase des leucocytes, siège de la synthèse des leucotriènes issus de l'acide arachidonique. En conclusion, les composés dihydroxlés possédant un triène conjugué E,Z,E, issus du 18:3n-3, ainsi que la PDX, inhibent l'activité des COX-1 et 2, et seraient anti-agrégants et anti-inflammatoires. Ces résultats donnent des perspectives pharmacologiques aux recommandations nutritionnelles promouvant la consommation d'acide alpha linolénique.

Le glycérol est un coproduit de la filière des biocarburants obtenu par transestérification destriglycérides. Avec le développement des biocarburants, la production de glycérol est en pleine croissance.La consommation de glycérol comme additif dans les industries cosmétique, pharmaceutique et agroalimentairen'augmentant pas de manière aussi significative, l'excédent doit être valorisé. L'une des voies devalorisation est la synthèse du carbonate de glycérol qui est un intermédiaire intéressant pour la chimie fine.La méthode de synthèse utilisée au sein de l'industrie Novance est la carbonylation du glycérol par l'urée enprocédé discontinu. Cette réaction produit, en plus du carbonate de glycérol, une grande quantitéd'ammoniac gazeux extrait du milieu réactionnel par dépression. L'ampleur de ce dégagement gazeux ainsique son irrégularité au cours du temps représente la limitation de production du procédé discontinu. Le sujetde cette étude est de développer le procédé continu de cette synthèse afin de pallier ce problème. Pourréaliser le suivi de la réaction, des méthodes analytiques ont été développées dans un premier temps. Avecces outils, les connaissances du système discontinu ont été approfondies pour déterminer les critères dechoix du procédé continu. Une unité de désorption réactive a été ensuite conçue pour créer un systèmebiphasique gaz-liquide à contre-courant. Une série d'essais préliminaires a permis le développement duprocédé qui a été optimisé par un plan de Doehlert.

Le glycérol est un coproduit de la filière des biocarburants obtenu par transestérification destriglycérides. Avec le développement des biocarburants, la production de glycérol est en pleine croissance.La consommation de glycérol comme additif dans les industries cosmétique, pharmaceutique et agroalimentairen’augmentant pas de manière aussi significative, l’excédent doit être valorisé. L’une des voies devalorisation est la synthèse du carbonate de glycérol qui est un intermédiaire intéressant pour la chimie fine.La méthode de synthèse utilisée au sein de l’industrie Novance est la carbonylation du glycérol par l’urée enprocédé discontinu. Cette réaction produit, en plus du carbonate de glycérol, une grande quantitéd’ammoniac gazeux extrait du milieu réactionnel par dépression. L’ampleur de ce dégagement gazeux ainsique son irrégularité au cours du temps représente la limitation de production du procédé discontinu. Le sujetde cette étude est de développer le procédé continu de cette synthèse afin de pallier ce problème. Pourréaliser le suivi de la réaction, des méthodes analytiques ont été développées dans un premier temps. Avecces outils, les connaissances du système discontinu ont été approfondies pour déterminer les critères dechoix du procédé continu. Une unité de désorption réactive a été ensuite conçue pour créer un systèmebiphasique gaz-liquide à contre-courant. Une série d’essais préliminaires a permis le développement duprocédé qui a été optimisé par un plan de Doehlert. / Glycerol is a by-product of biofuels obtained by transesterification of triglycerides. With developmentof biofuel, glycerol production is growing. The use of glycerol in cosmetic, pharmaceutical and food industriesis not increasing in the same way, so the surplus should be preferable to market. One way of development isthe synthesis of glycerol carbonate which is an interesting intermediate for fine chemistry. The synthesisused by Novance is carbonylation of glycerol by urea with a batch process. This reaction produces, as wellas glycerol carbonate, a high quantity of gaseous ammonia extracted from reactive mixture in a vacuum. Thescale of this gaseous emission and its irregularity during synthesis show the limits of production using abatch process. The aim of this study is to develop the continuous process of the synthesis to solve thisproblem. To carry out the monitoring of the reaction, at first, analytical methods were used. With suchmethods, knowledge of the batch process was improved in order to determine the best criteria for acontinuous process. A unit of reactive desorption was then elaborated to create a liquid-gas biphasic systemin a counter-flow configuration. A series of preliminary experiments were performed to develop the processwhich was optimised by a Doehlert plan.

La question des détritus marins de plastique et de leur impact sur l'environnement prend de l’ampleur. Il a été démontré que 80% des plastiques sont issus de sources terrestres, tandis que 20% viennent des côtes et mers. De nombreux auteurs soulignent un problème environnemental sérieux lié à l'absorption de POP (Polluants Organiques Persistants) par les débris plastiques, initiant ainsi une source potentielle de contamination de la chaîne alimentaire. Tous les auteurs attribuent la fragmentation en « microplastiques » (taille < 5mm) à des phénomènes liés à la dégradation, en particulier sous UV sans l’avoir jamais réellement ni démontré ni analysé. Les rivières constituant alors un vecteur privilégié de transport des déchets terrestres vers les mers et océans, nous avons décidé de mettre en évidence (et de quantifier) la présence de microplastiques dans une rivière réputée « sauvage » comme l’Allier. Au laboratoire, nous mettons au point des protocoles de simulation de la fragmentation des plastiques sous irradiations UV de différentes matières plastiques dans l'eau (douce). Nous analysons aussi bien les molécules chimiques issues de la dégradation des plastiques et transférées dans le milieu aqueux que les modifications moléculaires que peut subir le matériau. / The question of marine litter and their environmental impact gains importance. It was shown that 80% of plastics results from terrestrial sources, while 20% come from coastlines and seas. Many authors point to a serious environmental problem involved to the absorption of POPs (persistent organic pollutants) by plastic detritus, thus initiating a potential source of contamination of the food chain. All authors attribute the fragmentation to "microplastic" (size < 5mm) to phenomena related to degradation, under UV without ever having demonstrated or analysed it. The rivers constituting then a privileged vector of transport of the terrestrial waste towards the seas and oceans, we decided to highlight (and quantify) the presence of microplastics in a river known as "wild" as the Allier. At the laboratory, we develop simulation protocols for the fragmentation of plastics under UV irradiation of various plastic materials in fresh water. We analyse both the chemical molecules resulting from the degradation of plastics and transferred to the aqueous medium as well as the molecular changes that can undergo the material.