Les Ribonucleotidil reductases (RNRs) són un grup d'enzims que catalitzen la reducció de ribonucleòtids (NTPs) a desoxiribonucleòtids (dNTPs), proporcionant a tots els organismes vius la quantitat necessària de monòmers per a la síntesis i la reparació del DNA. S'han caracteritzat tres classes diferents de RNRs en funció dels mecanismes de generació del radical, diferències estructurals, regulació al·lostèrica i dependència envers l'oxigen, però totes elles tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical orgànic lliure per a iniciar la catàlisi.El genoma de Streptococcus pyogenes (Grup A Streptococcus [GAS]), un patògen humà responsable de diverses malalties, conté els gens per a sintetitzar dues RNRs completes de classe Ib (nrdHEF/nrdI2 i nrdFIE*, respectivament), mentre que la majoria d'estreptococs tan sols conté els gens nrdHEF/nrdI2. Aquest treball intenta determinar si la presencia de una segona reductasa de classe Ib en aquest microorganisme és conseqüència d'una necessitat biològica o si senzillament és el resultat del procés evolutiu. S. pyogenes és el primer organisme procariota on s'han estudiat dues riboucleotidil reductases de la mateixa classe.L'estudi per RT-PCR de lligament ha demostrat que tots dos agrupaments es transcriuen de manera simultània i que constitueixen dues unitats policistròniques independents. Les subunitats ? i ? d'aquests dos sistemes s'han purificat i caracteritzat bioquímicament. El primer sistema (nrdHEF) ha resultat ser bioquímicament actiu i presenta una senyal d'EPR que coincideix amb la d'altres radicals tirosil de classe Ib. L'activitat del sistema depèn de l'adició de magnesi i DTT i utilitza NDPs, però no NTPs, com a substrat. Tanmateix, es veu estimulada per el dATP com a efector al·lostèric però no per l'ATP, tal i com correspon a un enzim de classe Ib. No obstant, no s'ha pogut detectar activitat ni un radical tirosil en l'operó nrdFIE*. L'alineament de la subunitat ? d'aquest operó ha mostrat que tres dels sis residus d'unió a ferro no estan conservats. El contingut de ferro de les dues proteïnes NrdF mostra clarament que, a diferència del que succeeix en la proteïna NrdF, la proteïna NrdF* no és capaç de coordinar un centre difèrric in vitro en les condicions de l'assaig, impedint-se així la generació d'un radical tirosil.L'assaig de complementació heteròloga, no obstant, indica que l'operó nrdFIE* és funcional in vivo si tots tres gens estan presents. D'una manera similar, l'operó nrdHEF no presenta complementació si no s'afegeix una proteïna NrdI funcional a l'assaig. En presència de les proteïnes NrdI* i NrdI2 de S. pyogenes, l'operó nrdHEF no és funcional in vivo, però si s'assaja en combinació amb la proteïna NrdI2 de S. pneumoniae. La presencia d'un agrupament nrdFIE quasi idèntic en totes les espècies del gènera Mycoplasma ens permet suggerir que l'operó nrdFIE ha estat adquirit per S. pyogenes mitjançant transferència genètica lateral per a compensar la pèrdua de funcionalitat de la proteïna NrdI*.També hem estudiat el promotor que regula l'expressió transcripcional de la ribonucleotidil reductasa anaeròbica d'Escherichia coli (nrdDG). S'ha demostrat que aquest promotor està activat per el regulador transcripcional FNR (fumarate and nitrate reduction), i s'han identificat dues regions que presenten un nivell de similitud significatiu amb la seqüència consens d'unió a FNR. En aquest treball hem investigat la interacció de FNR a la regió promotora dels gens nrdDG així com l'efecte d'aquesta interacció en la transcripció. Els assaigs de mobilitat electroforètica amb la proteïna FNR* purificada han demostrat la interacció de FNR amb totes dues regions, i els estudis amb les caixes FNR mutagenitzades indiquen que la regió FNR-2 és essencial per a la activació anaeròbica del promotor nrdDG. La regió FNR-1, no obstant, és necessària per a la màxima expressió d'aquest promotor. Els nostres resultats suggereixen que totes dues regions actuen de forma sinèrgica per a coordinar l'expressió en resposta a concentracions canviants d'oxigen. / Ribonucleotide reductases (RNRs) are a group of enzymes that catalyze the reduction of ribonucleotides (NTPs) to deoxyribonucleotides (dNTPs), thus providing all organisms with optimal amounts of the necessary buildings blocks for DNA replication and repair. Three classes of RNRs have been characterized up to date according to their different mechanisms for radical generation, structural differences, allosteric regulation and oxygen dependence, all of them having in common the reaction mechanism and the use of an organic free radical to initiate catalysis.The genome of Streptococcus pyogenes (Group A Streptococcus [GAS]), a human pathogen responsible for many diverse infections, harbours the genes to synthesize two complete class Ib RNRs (nrdHEF/nrdI2 and nrdFIE* respectively), while most streptococci only bear the nrdHEF/nrdI2 genes. This work attempts to determine whether the presence of a second class Ib RNR in S. pyogenes accounts for a biological need or if it is simply the result of a vestigial burden. S. pyogenes is the first prokaryotic organism where two distinct and complete ribonucleotide reductases of the same class are studied.Linkage RT-PCR showed that both clusters are simultaneously transcribed and constitute two independent polycistronic units. The ? and ? subunits for these two systems were purified and biochemically characterized. The first system (nrdHEF) proved active and presented an EPR signal that matched that of other class Ib tyrosyl radicals. Activity was dependent on the addition of magnesium and DTT and required NDPs but not NTPs as a substrate. It was also stimulated by dATP as an allosteric effector but not by ATP, as expected in a class Ib enzyme. However, neither activity nor tyrosyl radical signal were ever detected from the nrdFIE* cluster. When aligned together with other class Ib enzymes, three out of the six iron binding residues within the ? subunit of the nrdFIE* cluster were found not to be conserved. The iron contents of the two NrdF proteins clearly showed that, contrary to the ? subunit from nrdHEF, the ? subunit from nrdFIE* was not capable of coordinating an iron centre in vitro under the conditions tested, which, in turn, impaired the generation of a tyrosyl radical.Heterologous complementation assays, however, showed that the nrdFIE* operon is fully functional in vivo when all three genes are present. In a similar manner, the nrdHEF system showed no complementation unless a functional NrdI protein was provided. Neither NrdI* nor NrdI2 from S. pyogenes rendered nrdHEF active, but it did addition of the NrdI2 protein form S. pneumoniae. The presence of an almost identical nrdFIE cluster in all Mycoplasma species leads us to suggest that the nrdFIE* operon was acquired by S. pyogenes through a lateral gene transfer event to compensate for the loss of a functional NrdI*.We have also studied the promoter regulating the transcriptional expression of the anaerobic ribonucleotide reductase of Escherichia coli (nrdDG). This promoter has been shown to be up-regulated by the pleiotropic transcriptional regulator FNR (fumarate and nitrate reduction), and two regions with significant similarity to the FNR consensus sequence were also found. In this work we have investigated the binding of FNR to the nrdDG promoter region and the effects of such binding on transcription. Gel retardation analysis with purified FNR* demonstrated FNR interaction at both sites, and studies with altered FNR boxes indicated that the upstream FNR-2 site is essential for the anaerobic activation of the nrdDG promoter. The FNR-1 site, however, is needed for the maximal expression of this promoter. Our results suggest that both sites act synergistically to coordinate expression in response to shifting oxygen concentrations.

Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) és un patògen intracel·lular gram negatiu que provoca gastroenteritis en humans però que en ratolins provoca una infecció sistèmica similar a la febre tifoidea humana (provocada en aquest cas per S. Typhi). Una de les característiques principals de la infecció per S. enterica és la capacitat que presenta per envair activament cèl·lules epitelials i sobreviure i proliferar a l'interior dels macròfags.S. Typhimurium presenta codificades en el seu genoma tres tipus de ribonucleotidil reductases (RNRs): classe Ia, Ib i III. Les RNRs són enzims essencials ja que són els responsables de la síntesi de novo dels desoxirribonucleòtids (dNTPs), necessaris per a la síntesi i reparació del DNA, a partir de la reducció dels ribonucleòtids (NTPs). Fins ara s'han descrit tres classes de RNRs que es diferencien pel mecanisme de generació del radical que utilitzen, l'estructura que presenten, la seva regulació al·lostèrica i la seva dependència de l'oxigen. Tot i així, totes tenen en comú el mecanisme de reacció i la utilització d'un radical lliure orgànic per a iniciar la catàlisi.En aquest treball s'ha estudiat la regulació transcripcional de les tres classes de RNRs presents en S. Typhimurium, centrant-nos en dos reguladors: NrdR i Fur. S'ha estudiat l'efecte de la deleció de NrdR sobre l'expressió gènica de les tres classes de RNRs. NrdR és un repressor de les tres classes de RNRs i presenta un major efecte sobre l'expressió de l'operó nrdHIEF. També s'han descrit les seves caixes d'unió i s'han obtingut proteïnes mutants en determinats residus que afecten la funcionalitat de NrdR in vivo, possiblement degut a la participació d'aquests residus en la unió de dATP/ATP. La mutació de Fur provoca un agument de l'expressió de l'operó nrdHIEF de fins a cinc vegades respecte la soca salvatge. A la regió promotora de l'operó nrdHIEF hi hem detectat una possible caixa d'unió de Fur, la mutació de la qual provoca un augment en l'expressió similar a l'observat en la soca amb Fur delecionat. Mitjançant assajos de retardament electroforètic hem confirmat la unió de Fur a la regió promotora de l'operó nrdHIEF.En condicions normals, S. Typhimurium utilitza la RNR de la classe Ia per a la síntesi de novo de desoxirribonucleòtids en presència d'oxígen. La classe Ia és essencial per al seu creixement i la classe Ib no és capaç de complementar-ne la seva mutació a no ser que se li introdueixi una còpia extra. La presència de dues RNRs amb activitats redundants en un mateix microorganisme, el fet que en altres espècies bacterianes la síntesi de desoxirribonucleòtids en presència d'oxigen la dugui a terme la classe Ib, i que tant en E. coli com S. Typhimurium la classe Ib s'hagi conservat al llarg de l'evolució fa pensar que aquesta classe de RNR ha d'expressar-se en algunes condicions molt concretes de creixement.En aquest treball s'ha estudiat la participació de les RNRs en la virulència de S. Typhimurium SL1344 mitjançant la construcció de mutants de cada una de les tres classes així com de dobles mutants i mutants en els seus reguladors (Fur, NrdR). Mitjançant assajos d'infecció de línies cel·lulars de macròfags i també de cèl·lules epitelials hem intentat desvetllar quina de les RNRs és la responsable del creixement de S. Typhimurium durant el procés d'infecció. Els resultats obtinguts indiquen que la RNR responsable de la invasió i de la proliferació a l'interior de macròfags és la classe Ia, mentre que les classes Ib i III no semblen ser essencials. No obstant, observant el comportament de la soca mutant en la classe Ia que presenta la classe Ib sobreexpressada, durant les primeres hores d'infecció (2-6 h) sí que és capaç de sobreviure. Creiem que en aquesta etapa inicial de la infecció, quan es produeix l'explosió respiratoria, es generen unes condicions que activen l'expressió de l'operó nrdHIEF, possiblement la concentració de peròxid d'hidrogen és capaç d'inhibir l'activitat repressora de Fur. La gran demanda de dNTPs a causa del dany al DNA que s'està produint fa necessari un subministrament extra de dNTPs que aportarà la reductasa NrdEF. / Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is a gram negative intracellular human pathogen causing gastroenteritis in humans as well as a systemic infection in mice similar to human typhoid fever (which is caused by S. Typhi). One of the main features of S. enterica infection is its capacity to actively invade epithelial cells and proliferate inside macrophages.S. Typhimurium presents three classes of ribonucleotide reductases (RNRs) in its genome: class Ia, class Ib and class III. RNRs are essential enzymes because they carry out the de novo synthesis of deoxyribonucleotides (dNTPs), needed for DNA synthesis and repair, by reducing ribonucleotides (NTPs). Up to date, three different classes of RNRs have been described, differing in their mechanism of radical generation, their three-dimensional structure, allosteric regulation and their oxygen dependence. Nevertheless, they all have in common the mechanism of reaction and the use of an organic free radical to initiate catalysis.This work has studied the transcriptional regulation of the three RNR classes present in S. Typhimurium, giving importance to two main regulators: NrdR and Fur. We have studied the effects of NrdR deletion in each class of RNR gene expression. Our results indicate that NrdR is a repressor of all three classes, but it shows a stronger repression when regulating nrdHIEF expression. We have also described NrdR recognition sites (NrdR boxes) and we have obtained mutant proteins in some residues that affect NrdR functionality in vivo, possibly due to their participation in dATP/ATP union.Mutation of Fur causes an upregulation of nrdHIEF expression up to five fold compared to the wild type strain. We have detected a putative Fur recognition sequence within the nrdHIEF promoter region. Mutation of this recognition sequence causes an upshift in nrdHIEF expression similar to the level observed in the fur mutant. Using electrophoretic mobility shift assays (EMSA) we have confirmed that Fur interacts with the nrdHIEF promoter region.Under normal conditions, S. Typhimurium uses class Ia RNR to de novo synthesize dNTPs in the presence of oxygen. Class Ia is essential for normal growth and class Ib is not able to complement its mutation unless an extra copy of nrdHIEF is introduced. The presence of two RNRs with redundant activities in the same organism, the fact that other bacterial species use class Ib for dNTP synthesis in then presence of oxygen, and that both E. coli and S. Typhimurium have retained class Ib enzymes during evolution, suggest that this class might be expressed under specific growth conditions.We have studied the role of RNRs in the virulence of S. Typhimurium SL1344 by means of different mutants and double mutants in each RNR class as well as mutants in their transcriptional regulators (Fur, NrdR). Infection assays performed in macrophage cell lines and epithelial cell lines have allowed to elucidate which RNR is responsible for S. Typhimurium growth during infection. Our results indicate that class Ia is the RNR responsible for invasion and proliferation inside macrophages, while class Ib and class III do not seem to be essential. However, class Ia mutants overexpressing class Ib are capable of surviving the first hours of infection (2-6 h). We think that is in this first stage of the infection process (when the oxidative burst takes place), specific conditions generate and activate nrdHIEF expression. It is possible that hydrogen peroxide concentrations are responsible for the inhibition of the Fur repressor activity. The highest demand of dNTPs due to DNA lesions makes it necessary for an extra dNTP supply that will be provided by the NrdEF enzyme.

No description available.

La majoria de les proteïnes d'interès biomèdic com hormones, enzims, factors de creixement o antígens s'obtenen en proporcions molt petites de les seves fonts naturals i fa que la seva comercialització no sigui viable. Per això la producció de proteïnes heteròlogues en bacteris ha estat un gran avenç i actualment és un procés molt utilitzat per la indústria farmacològica, ja que és un procés ràpid i de baix cost. El bacteri Escherichia coli ha estat l'organisme productor més usat com a fàbrica cel·lular degut a l'exhaustiu coneixement que se'n té, la seva fàcil i econòmica manipulació i la gran varietat de sistemes i vectors d'expressió que s'han dissenyat específicament per aquest. Un dels principals obstacles que ens trobem quan utilitzem E.coli com a organisme productor és la dificultat de plegar la proteïna correctament, el que implica la seva degradació o la seva agregació en forma de cossos d'inclusió. La formació de cossos d'inclusió és un dels majors problemes d'aquests processos i per això es té un gran interès en evitar que es formin i en buscar estratègies per a millorar l'expressió de la proteïna soluble. En aquest treball s'ha estudiat profundament els mecanismes involucrats en la formació dels cossos d'inclusió amb l'objectiu de buscar solucions a la problemàtica que representa i d' entendre millor les bases moleculars que porten a l'agregació de proteïnes. Per això, s'ha estudiat la naturalesa dels agregats des de diferents punts de vista, des de l'anàlisi del seu creixement dins del citoplasma d'E. coli, l'estudi dels factors cel·lulars que hi estan implicats, com s'estructura la proteïna agregada a nivell molecular i com es pot recuperar la proteïna dels agregats en el seu estat natiu.Els resultats obtinguts ens han portat a proposar un model de construcció dels cossos d'inclusió, que ens demostra que l'agregació proteica és reversible i no irreversible com es creia prèviament. La formació dels cossos d'inclusió és el resultat d'un equilibri dinàmic entre l'agregació i la solubilització, que està desplaçat cap a l'agregació durant la sobreproducció d'una proteïna recombinant, però que és invertit quan aquesta s'atura. Per altra banda, també s'ha detectat que els agregats presenten plasticitat molecular, que es correspon amb un estat d'agregació reversible. El procés de formació i solubilització dels cossos d'inclusió és un mecanisme íntimament associat amb el sistema de control de qualitat proteic, on proteases i xaperones s'encarreguen d'assegurar el correcte estat conformacional de les noves cadenes polipeptídiques sintetitzades. Aquesta vinculació ens suggereix que l'agregació proteica pot representar un mecanisme de resposta a l'estrés desenvolupat per a reduir la toxicitat produïda per la presència d'estructures proteiques mal plegades en el citoplasma d'E. coli. Les xaperones DnaK i GroEL tenen un paper rellevant en la formació dels cossos d'inclusió. Mentre que DnaK evita la seva formació, sembla que GroEL indueix l'aglutinació dels petits preagregats que interaccionen per a formar un únic cos d'inclusió. La solubilització dels agregats in vivo és un procés multifactorial, en el que hi intervenen una gran part de les proteïnes de xoc tèrmic. En un àmbit més aplicat, hem estudiat possibles maneres de recuperar la proteïna acumulada en els cossos d'inclusió. Per una banda, hem desenvolupat un procediment que mimetitza la solubilització dels agregats que es dóna in vivo, basat en la incubació d'aquests amb extractes cel·lulars i per altra l'ús de la pressió hidrostàtica. Els dos casos ofereixen avantatges respecte els utilitzats fins ara, com que són més ecològics perquè s'evita l'ús d'agents químics, són més econòmics i fàcilment escalables i en el primer cas, és més genèric. / Most of the proteins of relevant biomedical value are found at very low concentrations in their natural sources. Nowadays, the production of recombinant proteins in host cells has became a novel technology extensively used because it offers the possibility to obtain any protein at high concentrations. However, the production of recombinant proteins in host cells, especially Escherichia coli, often results in the formation of insoluble aggregates known as inclusion bodies (IBs). Since insoluble polypeptides are not useful for biotechnological purposes, the formation of inclusion bodies is regarded as an obstacle for the use of bacterial cell factories. For this, there is a big effort in improving the solubility of the protein produced and on finding a general strategy to recover purified active proteins from IBs. In this study, we analysed the mechanisms involved in the inclusion body formation in order to overcome the problems they cause and for a better understanding of the molecular basis that leads to protein aggregation. For this, we studied the nature of inclusion bodies from different points of view, such as analysing their growing in the E.coli cytoplasm, studying the cellular factors that participate in this process, the molecular organisation of the aggregated protein and the ways to recover native protein from IBs. Since current days, inclusion bodies were believed to be compact protein aggregates, that being unreachable by proteases and chaperones remain inert once produced in the cell. However, the investigations carried out during this project demonstrate that Ibs are more labile structures, formed during a dynamic process that involves protein precipitation but also solubilisation and proteolytic degradation. IB particles are then formed because of the equilibrium between these antagonic processes, that is displaced towards precipitation when the recombinant protein is produced at high rates. In agreement with this finding, we have detected that polypeptides embedded in Ibs present molecular plasticity.In addition, our observations prove that IB protein is accessible to chaperones and other components of the cell quality control system that control IB formation and solubilisation. This observation suggest that the IB construction and deconstruction is a process included in the stress response, which might be developed to reduce the toxicity produced by the presence of unfolded proteins in the cytoplasm of E. coli. We have seen that chaperones DnaK and GroEL have a relevant function in the IB formation. While DnaK has a preventive role in the protein aggregation, GroEL seems to induce the precipitation of the small preaggregates that interact to form a big inclusion body. On the other hand, we detected that different chaperones participate in the IB solubilisation process, in a co-ordinate way. In a more applicable area, we explored new strategies to recover native protein from IBs. The first method proposed is based on the in vitro mimics of IB protein solubilisation that we observed in vivo, by using crude cell extracts to solubilise purified inclusion bodies. We have also analysed the application of a high hydrostatic pressure to dissociate IBs and refold recombinant protein. Both methods offer advantages from the actual strategies used up to now, such as they are more ecological since they skip the use of chemical agents, they are more economical and easy to adapt to industrial scale and in the first case, it is more generic.

All the processes that take place in a cell require one or more proteins, meaning that they are essential components of life. Proteins are macromolecules consisting of amino acid units, all of them being constructed with combinations of only 20 amino acids. The primary structure of a protein molecule is determined by the sequence of amino acids connected by peptide bonds forming a polypeptide chain. Once the amino acid chain is synthesized, the protein folds by a physical process that might be eventually assisted by other proteins, reaching its characteristic three‐dimensional structure that is the final, functional conformation. However, although it is known that all the proteins must properly fold into their correct native conformation to be functional, their final conformation cannot be predicted from their primary amino acid sequence, being protein folding mechanisms one of the most challenging problems in biology today. Many proteins of relevant industrial or medical value are produced in low amounts in their natural sources. However, at the end of the seventies, the development of recombinant DNA technologies opened a new promising era for protein production in high amounts for both research and industrial applications. This had a tremendous impact, for example, in many areas of medicine as a tool to produce new drugs for the treatment of diseases and genetic disorders. Genetic engineering permits the introduction of the encoding genes of the protein of interest into recipient cells, where these genes are positioned downstream of regulable promoters in movable genetic elements, mainly plasmids. Under suitable conditions, these transgenic cells acting as protein production bio‐factories would be expected to act as unlimited and inexpensive source of rare, highly valuable proteins not only for proteomics and structural functional genomics1 but also for large‐scale preparative purposes. The quality as well as the quantity of the produced recombinant protein is greatly influenced by the chosen biological cell system. Bacteria have been the most commonly used organisms for protein production, specially the enterobacteria Escherichia coli, not only for the low cost of the used processes, but also for its fast growth. Generally, in Escherichia coli, the rather small host cell proteins can fold properly, adopting a native, biological active conformation. However, when producing heterologous proteins, specially those with eukaryotic or viral origin, important obstacles appear during the protein production process: a) in most cases, the protein is produced in a non functional conformation; b) sometimes the formed product is toxic for the cell; c) the protein often results proteolytically degraded2; d) the product is accumulated as an insoluble, non‐functional protein aggregates, known as inclusion bodies3. Therefore, even though the important advantages of the use of bacteria as a expression system, Escherichia coli also presents some drawbacks, such as its inability to carry most of the post‐transcriptional modifications, often required for eukaryotic protein function, the lack of a secretion mechanism to release the protein to the medium, and the inability to create an oxidative environment to facilitate disulfide bond formation required to achieve the final, functional structure of some proteins. Therefore, this leads to the production of proteins which are not always suitable for immediate use. This means that, to date, many proteins have been excluded from the biotechnological and pharmaceutical market because they cannot be produced in high yields as soluble and active products. To avoid protein folding problems encountered in bacteria under overexpression conditions, mainly secretion and post‐transcriptional modifications, alternative host cells, such as yeast, filamentous fungi, mammalian or insect cells, have been explored. Nevertheless, an enormous number of deficiencies in these systems such as difficulty of genetic manipulation, low productivity and high costs, shows that these organisms are not ideal for this aim and that, even when bacteria show some obstacles in the production process and often this system has to be optimized for specific products, it is, in most of the cases, the best choice.

La tesis titulada “Plastic and paper platforms for nanoparticle based immunosensors” presentada como compendio de publicaciones, muestra avances significativos en el campo de los biosensores ópticos y electroquímicos. En la introducción (Capítulo 1) se presenta la importancia que tienen tanto los sensores inmunológicos basados en nanopartículas como los biosensores basados en plataformas de papel y nanomateriales para aplicaciones en diagnóstico. Ambas plataformas destacan por la versatilidad y facilidad de uso, bajo coste y tamaño reducido, lo que hace que sean unos dispositivos excelentes para aplicaciones en países en vías de desarrollo así como para el diagnóstico en casa por el propio paciente o en el consultorio médico. En el Capítulo 2 los objetivos de la tesis están presentados. En la primera parte del Capítulo 3, se explica cómo el tamaño de las nanopartículas de oro afecta a sus propiedades electroquímicas y, por consiguiente, a su detección. Se ha demostrado que para nanopartículas inferiores a 20 nm de diámetro, los efectos Brownianos disminuyen la velocidad de deposición de las nanopartículas en solución, lo que debe ser tenido muy en cuenta para aplicaciones en las que las nanopartículas de oro actúen como marcadores en biosensores. En la segunda parte, se trata sobre el desarrollo de un novedoso método de funcionalización de nanopartículas de oro con anticuerpos. Este método está basado en la interacción entre las cargas positivas que tienen los anticuerpos a pH inferior al de su punto isoeléctrico y las cargas negativas de la superficie de las nanopartículas de oro. Con este método es posible controlar la orientación de los anticuerpos y esto implica poder detectar una menor cantidad de analito (en este caso se uso la inmunoglobulina humana G como proteína modelo). Comparando este método con otro en donde no se controla la orientación, se ha obtenido un límite de detección un orden de magnitud mejor y se ha podido detectar la proteína modelo en una muestra real. En cuanto a la aportación en el campo de los biosensores ópticos, se ha desarrollado un sensor inmunológico basado en inmunoensayos de flujo lateral (LFIA) en papel, aplicado para la detección de inmunoglobulina G humana como se recoge en el Capítulo 4. Esta tecnología destaca por su aplicabilidad y bajo coste (similares a los populares test de embarazo). En esta tesis se han desarrollado dos modificaciones de la tecnología que, sin implicar pérdida en su simplicidad de uso y bajo coste, han aumentado los límites de detección en un orden de magnitud. Una de las modificaciones consiste en unos cambios de la geometría de las tiras que permiten la pre-concentración del complejo analito-marcador en la zona de detección. Esto implica que se puede detectar menor concentración de analito. La otra estrategia consiste en el desarrollo de un doble marcador, donde las nanopartículas de oro están acopladas a un enzima. De esta manera en el LFIA se puede obtener como señal el color rojo de las nanopartículas de oro, como se usa comúnmente, o es posible añadir el substrato del enzima para que catalice una reacción que genere un producto coloreado, que se suma al color rojo de las nanopartículas de oro, aumentando la intensidad del color y mejorando los límites de detección de analito. Ambas modificaciones permiten el uso de este tipo de sensores en una mayor variedad de campos, donde un límite de detección más bajo es necesario. Finalmente, en el Capítulo 5, se presenta también la integración de un transductor electroquímico en soporte de papel. Esta novedosa plataforma, presentada en la tesis como instrumento para la detección de nanopartículas, permite una fácil integración en sistemas ópticos como los LFIAs añadiendo la posibilidad de una cuantificación más precisa. / The thesis entitled “Plastic and paper platforms for nanoparticle based immunosensors” is presented as a compendium of publications and shows important improvements in the field of biosensors. In the Introduction (Chapter 1) the importance of immunosensors based on nanoparticles and on paper platforms is discussed. The resulting systems are versatile, easy-to-use, cheap and of small size, making them excellent devices for their use in third world countries as well as for home-diagnostics. The objectives of the thesis are presented in Chapter 2. Chapter 3 is divided into two main parts; in the first one it is explained that the size of gold nanoparticles (AuNPs) affects their electrochemical properties, and so their detection. It is shown that for AuNPs with a diameter smaller than 20 nm, the Brownian effects make the deposition of AuNPs in solution slower. This must be carefully considered for those biosensors in which the AuNPs are used as labels. In the second a new method to functionalize AuNPs with an oriented antibody is explained. The method is based on the interaction between the positive charges of the antibody, when the pH of the solution is lower than the isoelectric point, and the negative charges of the AuNP surface. In this way it is possible to control the antibody orientation so more antigen molecules can be captured. In this work the human immunoglobulin G (HIgG) was used as model protein. Comparing this method with one that does not control the orientation, an improvement of one order of magnitude in the limit of detection was achieved. Furthermore, the HIgG was detected in real human serum. Regarding the optical biosensors, the development of a lateral flow immunoassay (LFIA) that was used for the detection of HIgG is explained in Chapter 4. This technology stands out for its applicability in several fields and low cost (consider pregnancy tests strips). In this thesis two modifications of the technology are presented improving the limit of detection up to one order of magnitude, without losing the simplicity in the use and the low cost of the analysis. The first modification changes the geometry of the strip allowing the pre-concentration of the antigen-label conjugates on the test zone. In this way less concentrations of analyte are detectable. The second strategy uses as label an AuNPs-enzyme conjugate. In this way it is possible to consider as signal the red color of the AuNPs (as commonly used in the LFIA) or, adding the substrate of the enzyme, the color produced by the catalyzed reaction. The colored product adds intensity to the red of the AuNPs improving the limit of detection of the LFIA. The proposed modifications expand the applicability of this platform to fields, where better limits of detection are required. Finally, in Chapter 5, the integration of a screen printed electrode onto a paper platform is presented. This new platform, used for the detection of nanoparticles, allows an easy integration in paper-based optical sensors, such as LFIA, adding the possibility to a more precise quantification.

La presente tesis doctoral está centrada en el diseño y aplicación de nuevas metodologías de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), con especial interés en (i) la obtención de espectros de RMN de protón homonuclearmente desacoplados (denominados “pure shift”) y (ii) la determinación de las constantes de acoplamiento homo- y heteronucleares en medio isotrópico y anisotrópico a través de nuevos experimentos HSQC y HSQMBC. La tesis se presenta como compendio de artículos, los cuales han sido ya publicados en revistas científicas internacionales de reconocido prestigio, de modo que todos los resultados aquí expuestos han sido previamente evaluados y analizados por investigadores expertos en el campo de la RMN y de la química. Durante esta tesis doctoral se han diseñado una gran variedad de nuevos experimentos “pure shift”. La mayoría de ellos están basados en la técnica HOBS (Homodecoupled Band-Selective) mediante la cual es posible obtener espectros “pure shift” con una elevadísima resolución espectral manteniendo la máxima sensibilidad. El método HOBS ha sido incorporado en una gran variedad de experimentos 1D/2D convencionales los cuales han sido aplicados con éxito en la medida simple y precisa de tiempos de relajación T1 y T2 en áreas congestionadas, en la medida de contantes de acoplamiento heteronuclear a partir de multipletes simplificados, en la determinación de pequeñas diferencias de desplazamiento químico en estudios de enantiodiferenciación y en el análisis de mezclas complejas. Por otro lado, la medición y el uso práctico de las constantes de acoplamiento ha sido un importante tema de estudio en el campo de la RMN durante muchos años, pero todavía hay una serie de problemas sin resolver. Durante esta tesis doctoral se han desarrollado nuevos experimentos HSQC y HSQMBC, que permiten llevar a cabo la medida precisa y exacta de las constantes de acoplamientos a través del análisis simple y directo de los picos y sin la necesidad de utilizar complejos post-procesamientos. / The present doctoral thesis is framed within the Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy field, more specifically in the design of modern NMR methodologies. The research work carried out is focused on the design and application of new and modern NMR methodologies (i) to perform efficient broadband 1H homodecoupling in 1D/2D NMR experiments and (ii) to accurately determine homo- and heteronuclear coupling constants in isotropic and anisotropic conditions through improved HSQC and HSQMBC-type experiments. The thesis is presented as a compendium of publications, which have been published in prestigious peer-reviewed international scientific journals. Therefore, all the results here exposed have been previously evaluated by expert researchers in the fields of the NMR spectroscopy and chemistry. Several 1H homodecoupled NMR experiments have been developed along this doctoral thesis. Most of them are based on the Homodecoupled Band-Selective (HOBS) experiment through which it is possible to obtain homodecoupled NMR spectra with full sensitivity. HOBS methods offer a powerful and simple way to obtain high-resolved 1D and 2D NMR spectra, as efficiently demonstrated for the accurate, simple and direct measurement of T1/T2 relaxation times in overlapped regions, the determination of heteronuclear coupling constants from simplified multiplets, the determination of very small chemical shift differences with success application in enantiodifferentation studies or the analysis of highly complex mixtures. In addition, the concept of ultra-high-resolution NMR spectroscopy has been tested by combining several resolution-enhanced techniques into a single NMR experiment. On the other hand, for many years the measurement and practical use of coupling constants have been a timely topic but there are still a number of unresolved issues. Along this doctoral thesis a suite of robust HSQC and HSQMBC experiments have been developed which provide accurate and precise measurements of couplings constants through simple and direct analysis of cross-peaks without involving complex post-processing data manipulation.

El fenomen de la refracció cònica en cristalls biaxials és conegut des del 1832, quan William Hamilton va predir matemàticament que un feix de llum idealment col·limat travessant un cristall biaxial paral·lelament a un dels eixos òptics del cristall, es refracta com un conus asimètric i emergeix del cristall com un cilindre de llum, la secció transversal del qual forma un anell de llum. La posterior observació del fenomen només uns mesos després per part de Humphrey Lloyd, va convertir la refracció cònica en un dels primers fenòmens observats després de la seva predicció, així com va donar el triomf de la teoria ondulatòria de la llum sobre la teoria corpuscular. A finals dels anys 70 del segle passat, Belsky i Khapalyuk van presentar la formulació difractiva del fenomen per a feixos amb simetria cil·líndrica, la qual va estar re-formulada per Berry durant la passada dècada. En aquesta tesi, explorem la refracció cònica d’una manera àmplia, alhora que profunda. Primerament, demostrem que, després d’un cert desenvolupament, la teoria de Berry pot ser utilitzada per estudiar la propagació de qualsevol feix, independentment del seu estat de polarització o perfil transversal, tant al llarg de l’eix òptic com a fora del mateix i per a qualsevol nombre de cristalls biaxials en cascada. Aquesta teoria difractiva també és utilitzada per a demostrar que, només ajustant la raó entre el radi de l’anell de refracció cònica i l’amplada del feix d’entrada, es poden aconseguir feixos molt dispars i que donen lloc a singularitats òptiques i vector beams molt interessants. Seguidament, demostrem que la refracció cònica pot ser entesa com la transformació de les ones incidents en dues ones còniques, la interferència de les quals dóna lloc als típics anells dobles al pla focal. A més a més, proposem una teoria alternativa que permet calcular el patró final després del cristall de qualsevol tipus de feix d’entrada, només tenint en compte refracció de vectors d’ona incidents i ho apliquem al cas particular de tenir múltiples cristalls en cascada. En particular, demostrem un sistema de multiplexació i de-multiplexació de senyals monocromàtiques per a aplicacions en les comunicacions òptiques en espai lliure basat en tres cristalls biaxials en cascada. Tot l’estudi anterior serveix per a la realització de noves propostes per a trampes òptiques per a àtoms neutres i partícules absorbents. En aquest sentit, demostrem tant teòricament com experimental que les estructures fosques que es generen amb refracció cònica són de gran utilitat per a atrapar àtoms ultra-freds, en col·laboració amb el grup del Prof. Gerhard Birkl a la Technische Universität Darmstadt. Tanmateix, utilitzem la particular distribució de polarització dels anells de refracció cònica per a construir una ampolla òptica re-configurable en temps real i que permet carregar i descarregar partícules macroscòpiques absorbents. També ens endinsem en el món de l’òptica quàntica a través de l’estudi de la generació de segon harmònic tant de tipus I com de tipus II a partir d’un feix de refracció cònica i demostrem que les propietats del feix de segon harmònic són pràcticament iguals a les del feix fonamental. Finalment, fem una proposta teòrica per a dissenyar un dispositiu capaç de detectar entrellaçament quàntic en moment lineal entre fotons bessons on l’element clau és un cristall biaxial. / The conical refraction phenomenon in biaxial crystals is known since 1832 when William Hamilton predicted mathematically that and ideally collimated light beam passing through a biaxial crystal parallel to one of the crystal optic axes would refract as an slanted cone within the crystal and emerge as a hollow light cylinder, whose transverse profiles forms a light ring. The afterwards observation of the phenomenon by Humphrey Lloyd made the conical refraction phenomenon to become one of the first phenomenon that were observed after their prediction, as well as the one who tip the scales towards the wave theory of light against the corpuscular theory. In the late 70s, Belsky and Khapalyuk presented the diffractive formulation of the phenomenon for cylindrically symmetric beams, this formalism being reformulated by Berry during the last decade. In this thesis, we explore conical refraction in deep and present some applications of this phenomenon. Firstly, we show that, after some theoretical development, Berry’s formalism can be used to predict the transformation of beams along any propagation direction, no matter the state of polarization or transverse profile they posses and the number of crystals in cascade used. The diffractive theory is also used to demonstrate that, by simply tuning the ratio between the conical refraction ring radius and the waist radius of the input beam, a rich variety of light beams and optical singularities can be generated. Then, we show that conical refraction can be understood as the transformation of the input plane waves into a pair of conical waves whose interference leads to the characteristic concentric bright rings at the focal plane. Additionally, we propose an alternative theory that allows calculating the resulting pattern beyond the biaxial crystal for any input light beam by considering splitting of input wave-vectors and we apply this simple formalism to predict the resulting pattern for a cascade of crystals. In particular, we demonstrate a multiplexing and de-multiplexing system for monochromatic signals for free space optical communications applications based on three biaxial crystals in cascade. The latter results are used to propose and realize different optical architectures for optical trapping of both ultra-cold atoms and absorbing particles. In this sense, show both theoretically and experimentally that dark optical geometries generated with conical refraction are of complete usefulness to trap Bose–Einstein condensates, in collaboration with the group of Prof. Gerhard Birkl at the Technische Universität Darmstadt. Additionally, we use the particular polarization distribution along the conical refraction rings to build a reconfigurable optical bottle capable to load and unload macroscopic absorbing particles at wish, in collaboration with the group of Prof. Wieslaw Krolikowski at the Australian National University. We also explore the world of quantum optics throughout the analysis of both type I and type II second harmonic generation of a conically refracted beam and we demonstrate that the second harmonic beam keeps most of the properties of the fundamental harmonic beam. Finally, we present a theoretical proposal to design an optical device able to detect linear momentum entanglement between twin photons, a biaxial crystal being the key element of the device.

La lesió de medul·la espinal és una de les principals causes de mortalitat entre pacients menors de 50 anys. Es dona en una taxa d’entre 20-­‐40 persones per milió d’habitants i amb una major prevalença en homes que en dones (amb una ratio de 4:1). A diferència del sistema nerviós perifèric (SNP), el sistema nerviós central (SNC) de mamífers adults presenta una limitada capacitat de regeneració espontània fet que porta a una pèrdua de dèficits funcionals permanents. Això és degut en part a: la escassa capacitat endògena de les neurones centrals per regenerar els seus propis axons després d’una lesió, la limitada capacitat del SNC per substituir neurones i oligodendròcits morts i la generació d’un ambient desfavorable en el SNC per promoure la regeneració axonal després de lesió. La fisiopatologia de les lesions de medul·la espinal inclou dues fases: la lesió primària i la lesió secundària. La lesió primària és conseqüència del trauma mecànic directe a la medul·la espinal que comporta el trencament d’axons, vasos sanguinis, membranes cel·lulars i mielina. La lesió primària es seguida per una segona onada de degeneració tissular que ocorre durant un període de varies setmanes i comporta una sèrie de processos cel·lulars i moleculars que tenen com a resultat l’increment del dany inicial en el parènquima medul·lar. Els mecanismes del dany secundari són diversos i no estan del tot ben definits, tot i així diversos estudis indiquen que la resposta inflamatòria n’és un dels principals components. La inflamació es un procés essencial després de lesió, un mecanisme per evitar infeccions i promoure reparació. En aquesta resposta, les citocines i les quimiocines juguen un paper essencial en el reclutament i l’activació de les cèl·lules immunes i les cèl·lules glials del SNC per iniciar i mantenir la resposta inflamatòria. A més, independentment del teixit en el qual es produeixi, la resposta immune es auto limitant i auto resolutiva. Encara que en lesions de medul·la espinal la resposta immune es necessària per retirar restes de mielina i les cèl·lules mortes e iniciar mecanismes de regeneració, les cèl·lules immunes secreten una sèrie de molècules que causen dany tissular. Aquest dany tissular és encara més pronunciat en el SNC que en altres degut a la limitada capacitat de regeneració i de reemplaçar cèl·lules mortes del SNC. Encara més, a diferència d’altres teixits, la resposta inflamatòria en el SNC no es auto resolutòria fet que porta a una cronificació de la inflamació incrementant la degeneració del parènquima medul·lar. La interleucina 37 és una citocina anti-­‐inflamatòria que es capaç de suprimir la resposta immune inhibint l’expressió de les citocines pro-­‐inflamatòries sense afectar a l’expressió de les anti-­‐inflamatòries. D’aquesta manera la IL-­‐37 es podria considerar com a un possible candidat per a reduir la resposta inflamatòria després de una lesió de medul·la espinal i d’aquesta manera promoure regeneració de recuperació funcional. També, la IL-­‐37 podria potencialment ser usada per a altres desordres tant del SNC com d’altres sistemes on la resposta inflamatòria té un efecte perjudicial com ara lesions traumàtiques al cervell, malaltia d’Alzheimer, arteriosclerosi, asma o artritis entre d’altres. / Spinal cord injury (SCI) is one of the main causes of mortality among patients under 50 years old. It occurs in most countries at an annual rate of 20–40 people per million of inhabitants, affecting more at men than women with a ratio of 4:1. Unlike peripheral nervous system (PNS), central nervous system (CNS) of adult mammals has limited abilities for spontaneous self-­‐repair which leads to permanent functional deficits. This is due, in part, by: the poor intrinsic capacity of central neurons to regenerate their axons following injury, the limited ability of the CNS to replace dead neurons and oligodendrocytes, the inappropriate environment of the CNS to support axonal growth. The pathophysiology of SCI involves two stages: the primary and the secondary injury. The first results from the mechanical trauma to the spinal cord that directly disrupts axons, blood vessels, membranes of neurons and glial cells, and myelin. This is followed by the secondary wave of tissue degeneration, which occurs over a period of several weeks, and encompasses a sequence of cellular and molecular events that are triggered in the spinal cord parenchyma as a result of the primary trauma. The mechanisms of secondary injury are multiple and not well defined, however a large number of studies indicates that inflammation is the main contributor to secondary injury. Inflammation is an essential aspect of the injury response and a means to curb infections and initiate wound healing. Chemokines and cytokines play an important role in the recruitment and activation of peripheral immune and CNS glial cells to initiate and maintain the inflammatory response. Regardless of the tissue in which it occurs, the inflammatory response is normally self-­‐limiting and undergoes resolution in a timely fashion. Although the inflammatory response is required for the clearance of cell and myelin debris and for wound healing in SCI, immune cells secrete several factors that cause damage to tissue. The damaging effects of inflammation are more pronounced in the CNS than other tissues because of the limited capacity of the CNS for axon regeneration and replenishment of damaged neurons and glial cells. Moreover, and in contrast to host tissues, inflammation does not terminate in a timely manner following SCI, leading to the development of chronic inflammation that further increase the degeneration of the spinal cord tissue. IL-­‐37, also known as IL-­‐1 family 7b (IL-­‐1F7) is an anti-­‐inflammatory cytokine. IL-­‐37 suppresses innate immune response by silencing the expression of pro-­‐inflammatory cytokines without altering those that are anti-­‐ inflammatory. IL-­‐37 might therefore be a suitable candidate to reduce inflammation and thus mediate protection and functional recovery after SCI. Moreover, IL-­‐37 could potentially be used for other CNS and non-­‐CNS disorders where the immune response plays a detrimental role such as acquired brain injury Alzheimer’s disease, atherosclerosis, asthma and arthritis, among others.

Los catecoles son compuestos aromáticos presentes en una gran variedad de sistemas naturales. Dada su gran versatilidad a nivel de propiedades fisicoquímicas, adquieren papeles clave en diferentes procesos naturales. Entre otros, los grupos catecol se encuentran en las proteínas adhesivas de los mejillones formando parte de aminoácido L-DOPA, que se considera responsable del extraordinario poder adhesivo de estos organismos en condiciones de extrema humedad. Este fenómeno ha fascinado a los científicos durante décadas y grandes esfuerzos se han destinado a entender e imitar estos sistemas. Otras propiedades de los catecoles, como su capacidad de formar complejos metálicos o su actividad redox, también han sido estudiadas tanto a nivel fundamental como en sistemas aplicados. En la presente tesis nos centramos en la obtención de sistemas de escala nanométrica basados en derivados de catecol y en el estudio de sus propiedades. Para ello, se llevó a cabo un trabajo multidisciplinar que incluye la síntesis de nuevos compuestos orgánicos, la obtención de nanoestructuras y el uso de microscopías y técnicas litográficas. En primer lugar se estudió la influencia de la densidad y orientación de los grupos catecol en las propiedades interfaciales de monocapas autoensambladas (SAMs) con unidades de catecol en el exterior; usando una punta de AFM o mediante la adsorción de nanopartículas magnéticas. Además, se estudió el efecto de la unidad de catecol en el proceso de formación y la estructura final de las monocapas. Por otro lado se llevó a cabo la síntesis de materiales poliméricos nanoestructurados basados en la funcionalidad catecol. Para ello se emplearon tanto metodologías clásicas como la síntesis confinada en pequeños volúmenes en superficie mediante el uso de litografía por escritura directa asistida por AFM. Esta técnica nos permitió fabricar estructuras de polidopamina y partículas de polímeros de coordinación mediante la deposición en superficie de los precursores de estos materiales en forma de gotas en la escala del femtolitro. De esta forma demostramos la viabilidad de la técnica para posicionar materiales funcionales en áreas concretas de una superficie. / Catechols are aromatic derivatives present in a variety of environments in nature. Due to their broad physicochemical versatility, they play pivotal roles in multiple natural processes. Probably their most popular appearance is in the adhesive proteins of mussels in the form of the rare aminoacid L-DOPA, which is considered to be essential for the strong adhesion of mussels to surfaces under high humidity conditions. This phenomenon has fascinated scientists for decades and intensive research has been carried out in order to understand and mimic these systems. Furthermore, other chemical properties of catechols, such as their metal-chelating and redox behaviour have also been addressed for both fundamental understanding and practical application. In this thesis we were interested in the obtention of nanoscale catechol-based systems and the study of their properties. For that, a multidisciplinary work was carried out which included the synthesis of new organic compounds, the preparation of nanostructures and the use of advanced microscopies and lithographic techniques. The role of packing density and orientation of catechol moieties in the interfacial properties of catechol-terminated SAMs was studied at the local scale using an AFM tip or, alternatively, magnetic nanoparticles. The influence that the presence of the catechol ring has on the formation and final structure of SAMs was also addressed. On the other hand, the synthesis of catechol-based polymers in confined volumes was performed using direct-write AFM-assisted lithography. Polydopamine and coordination polymer particles were fabricated directly on surfaces by controlled delivery of their molecular precursors in the shape of femtolitre-sized droplets. With that, we demonstrated the viability of using this technique to place functional amorphous materials on specific areas of surfaces.