La dosimetria biològica és un camp que s’ha desenvolupat dins la radioprotecció i permet estimar la dosi d’una exposició a radiacions ionitzants en casos en que no es coneix o no és prou fiable la dosimetria física. En dosimetria biològica, la metodologia més establerta per estimar la dosi d’una exposició a radiacions es basa en obtenir la freqüència d’una determinada alteració cromosòmica i, extrapolar‐la a una corba dosi‐efecte prèviament elaborada. Hi ha diversos factors que poden fer variar la freqüència de les alteracions cromosòmiques, entre aquests hi ha el cas de les irradiacions parcials, que es dona quan una irradiació només afecta una part del cos, i no la seva totalitat. En aquests casos si és realitza dosimetria biològica l’estimació de la dosi serà menor de la que en realitat és. Per tal de simular irradiacions parcials és va irradiar sang perifèrica a 2, 3, 4 i 5 Gy amb raigs X, i es va barrejar amb sang no irradiada per tal de tenir diferents percentatges de sang irradiada (87,5, 75, 50, 25 i 12,5%). Es va realitzar l’anàlisi mitjançant tècniques de FISH, pintant els cromosomes 1, 4 i 11 conjuntament amb tots els centròmers. Les alteracions cromosòmiques detectades es van expressar en nomenclatura PAINT, PAINT modificada i convencional. Es van utilitzar el test u i el test s (basat en el model de Poisson inflat en el zero) per avaluar la sobredispersió causada per les cèl∙lules no irradiades. Es va estimar la dosi per a cada tipus d’alteració considerada amb el mètode Dolphin i les corbes dosi‐efecte prèviament elaborades (usant les mateixes sondes cromosòmiques). Només es va detectar sobredispersió a dosis altes i a percentatges de sang irradiada baixos. Els dos mètodes usats per detectar desviacions de la distribució de Poisson van mostrar resultats molt similars. El total d’alteracions aparentment simples van ser el tipus d’alteració que l’estimació de la dosi va ser més propera a la dosi real que es va irradiar. Les tècniques de FISH utilitzades van tenir la mateixa eficiència detectant dicèntrics com translocacions. Comparant els resultats obtinguts amb tècniques de FISH amb els obtinguts analitzant dicèntrics amb tinció uniforme, amb aquest últim mètode s’obtenen millors resultats tant en la detecció de d’irradiacions parcials com en l’estimació de la dosi. Un altre factor que influeix en l’estimació d’una dosi és el temps transcorregut després d’una irradiació, ja que no totes les alteracions cromosòmiques presenten la mateixa estabilitat al llarg del temps. Per avaluar quines alteracions són més útils alhora d’estimar la dosi d’una exposició anterior (dosimetria biològica retrospectiva) es va fer un estudi utilitzant com a model la línia cel∙lular limfoblastoide Jurkat de cariotip normal i estable. Es van irradiar cèl∙lules Jurkat en G0 a dosis de 0,2, 2 i 2Gy amb raigs X, un cop irradiades es van mantenir en cultiu durant tres setmanes i es van extreure alíquotes a diferents temps. Les alteracions cromosòmiques induïdes es van analitzar mitjançant tècniques de pintat dels cromosomes 1, 4 i 11 conjuntament amb tots els centròmers per avaluar la persistència de translocacions i dicèntrics, i la tècnica d’mFISH per avaluar la freqüència, la complexitat, la participació de cada cromosoma de les alteracions radioinduïdes i les associacions cromosòmiques preferencials en les mostres inicials i finals en el cultiu control i en els irradiats a 2 i 4 Gy. En l’estudi realitzat amb pintat cromosòmic a totes les dosis la freqüència (x100) de dicèntrics i d’alteracions complexes van disminuir de forma ràpida fins arribar a valors popers a 0. La freqüència (x100) de translocacions es va mantenir força constant als cultius irradiats a 0,2 i 2 Gy mentre que als cultius irradiats a 4 Gy es va observar un descens que en les mostres inicials era pronunciat i en les finals era suau. La tècnica d’mFISH va mostrar que són les alteracions simples incompletes les que desapareixen al llarg del temps i que el grau de complexitat de les alteracions cromosòmiques augmenta amb la dosi i disminueix amb el temps post‐irradiació. No es van detectar desviacions respecte a la participació a l’atzar de cada cromosoma quan es van considerar les alteracions tipus intercanvi, però si que es van detectar quan es van considerar el total de alteracions cromosòmiques radioinduïdes. Es van detectar diferencies significatives en associacions cromosòmiques preferencials en la mostra inicial i en la final del cultiu de cèl∙lules Jurkat. / Biological dosimetry is is a field that has developed within the radioprotection to estimate the dose of ionizing radiation exposure in cases that physical dosimetry is not enough reliable or is unkown. In biological dosymetry, the more established methodology for estimating the dose of radiation exposure is based on extrapolate the frequency of a specific chromosomal alteration in a dose‐effect curve previously prepared. There are several factors that can vary the frequency of chromosome aberrations among these is the case of partial body irradiations, which occurs when radiation affects only a part of the body. In those cases the dose will be underestimated. In order to simulate partial body dose irradiations peripheral blood samples were irradiated at 2, 3, 4 and 5 Gy of X‐rays, and mixed with non‐irradiated blood to obtain the following percentages of irradiated blood: 87.5, 75, 50, 25 and 12.5. FISH painting was performed using whole chromosome painting probes for chromosomes 1, 4, and 11 in combination with a pancentromeric probe. Chromosome aberrations were recorded using the PAINT nomenclature, and later converted to the modified PAINT and conventional nomenclature. The u‐test was initially used to evaluate the expected overdispersion due to the presence of unexposed cells, but a test based on the zero‐inflated Poisson model (s‐test) is also proposed. Dose‐estimations for the different types of chromosome aberrations were calculated by Dolphin’s method and using the FISH dose‐effect curves previously obtained using the same whole‐chromosome probes. The expected overdispersion due to the presence of unirradiated cells was only detected at high doses and low percentages of irradiated blood. The two methods used to detect the deviation from the Poisson distribution showed a similar ability. Dose estimations for the irradiated fraction were closer to the real values for total apparently simple aberrations. In general, using FISH techniques similar results were obtained for dicentrics and translocations. In comparison to solid‐stain dicentric analysis, the use of FISH painting techniques is less suitable to detect partial irradiations, and for dose estimation assessment. Another factor in the estimation of a dose is the time elapsed after irradiation, as not all chromosome aberrations have the same stability over time. To evaluate which aberrations were more useful to estimate the dose for a retrospective exposure an irradiated cell line was studied. A follow‐up study on the persistence of the different types of chromosome aberrations was carried out. The lymphoblastoid cell line Jurkat was irradiated at 0.2, 2 and 4 Gy of X‐rays. After irradiation, the cultures were maintained for three weeks and samples were harvested at different times. Chromosome aberrations were detected using two FISH techniques: painting of chromosomes 1, 4 and 11, to assess the persistence of translocations and dicentrics, and mFISH to evaluate the frequency, the complexity, the chromosome involvement on the radiation‐induced chromosome aberrations and the preferential chromosome‐chromosome associations in the initial and final samples in the control and irradiated cultures at 2 and 4 Gy. In the study performed with painted technique, in all doses, the frequencies (x100) of dicentrics decreased clearly in the successive samples until values near zero. The frequencies (x100) of translocations, at 0.2 and 2Gy, were relatively constant until the last sample, whilst at 4Gy there was an initial steeped decrease in the first samples followed by a slight decrease in the last ones. The technique mFISH showed that simple incomplete aberrations disappear over time and the complexity of chromosome aberrations increases with dose and decreases with post‐irradiation time. The chromosome involvement was random for radiation‐induced exchange aberrations and non‐random for total aberrations. Preferential chromosome‐chromosome associations were observed in the initial and final samples in the Jurkat cell line.

Vegeu rfgresum1de1.pdf

No description available.

Els contaminants orgànics persistents (COPs) són compostos tòxics, persistents, bioacumulables i capaços de ser transportats per l'atmosfera a tot el planeta, incloses aquelles zones remotes on mai s'han produït ni emprat. Aquesta tesi estudia la contaminació dels ecosistemes aquàtics mediterranis per una selecció de COPs: els bifenils policlorats (PCBs), el diclorodifeniltricloroetà (DDT) i els seus derivats (DDE i DDD), els hexaclorociclohexans (HCHs) i l'hexaclorobenzè (HCB). Els resultats d'aquesta tesi s'han organitzat en tres capítols. En el primer d'ells s'estudia l'estat de la contaminació i la dinàmica dels COPs en el delta de l'Ebre. L'anàlisi de les mostres recollides (novembre de 2002 - octubre de 2003) mostrà com encara es produeixen aportacions no controlades de DDT al delta. Aquestes entrades poden ser la conseqüència de l'arrossegament de partícules enriquides mobilitzades des de diferents indrets de la conca i/o el resultat de les activitats agrícoles. La variabilitat estacional i geogràfica del lindà també indica l'existència d'aportacions recents. D'altra banda, les crescudes del riu provoquen un important augment de la descàrrega de COPs, bàsicament a la fase particulada, a causa de l'augment de l'escolament, la lixiviació, l'arrossegament de sòls i la remobilització dels sediments (ex. material dipositat als embassaments). Així, els períodes d'avinguda són claus en el còmput total de la descàrrega de COPs a la Mediterrània. En el segon dels capítols s'estudià el perfil vertical estratificat del riu a la seva desembocadura com un exemple dels estuaris de falca salina desenvolupats a la Mediterrània. La falca salina a l'Ebre provoca un canvi en la dinàmica vertical de diferents variables fisicoquímiques, de la matèria orgànica i dels COPs. La floculació induïda pel canvi salí vertical provoca un augment de la quantitat de partícules en suspensió a la falca salina i la barreja de partícules de diversos orígens (orgànic i mineral). Aquest material es barreja a la vegada amb el material marí i les partícules suspeses pateixen una disminució general de les concentracions de COPs. Tanmateix, la falca salina actua com una zona de retenció dels COPs ja que el seu moviment lent i la baixa renovació de l'aigua fan que els contaminants es mantinguin a l'estuari. D'altra banda, tot i que la interfície vertical entre l'aigua dolça - falca salina juga un paper molt important en la transformació i l'acumulació de la matèria orgànica, no s'han detectat màxims molts evidents de COPs en aquesta zona. Finalment, l'últim capítol presenta una visió més global i s'analitza l'abast i el risc ecològic de la utilització dels COPs a tota la conca mediterrània. Es realitzà una recopilació i valoració de la informació existent sobre COPs als sediments marins superficials com a indicadors i integradors del nivell de contaminació de la conca. Tot i les limitacions trobades en el recull d'informació (manca de dades per les costes est i sud de la conca, inexistència de procediments de mostreig i d'anàlisi normalitzats i manca de guies de qualitat ecotoxicològica) es van observar algunes tendències. Des del punt de vista geogràfic, s'ha demostrat com la contaminació per COPs als sediments mediterranis és un problema localment important en algunes zones urbanes/industrials, àrees de descàrrega de rius i zones semitancades (ports i llacs costaners). Malgrat això, les concentracions i el seu risc ecològic associat decreixen ràpidament en les zones de mar obert. Temporalment, tot i la gran variabilitat, s'observa una disminució general de les concentracions de COPs des dels anys setanta fins a l'actualitat. / Persistent Organic Pollutants (POPs) are compounds which have shown to be toxic, persistent, bioaccumulable and susceptible to atmospheric transport to remote areas where they have never been produced or used. This Thesis deals with the contamination of the Mediterranean Sea by a selection of POPs: hexachlorobenzene (HCB), hexachlorocyclohexanes (HCHs), dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) and its derivatives (DDE and DDD) and polychlorinated biphenyls (PCBs). Results of this Thesis have been organized in three different chapters. The first chapter is focused on the contamination by POPs and their dynamics in the Ebro Delta. The analysis of collected samples (November 2002 - October 2003) have shown that even today, some DDT inputs are occurring in the Ebro Delta. These inputs can be related to the mobilization of enriched particles from several places in the basin and/or to agricultural activities. In the case of lindane, the seasonal and spatial variability also seems to indicate the existence of recent inputs of this pesticide in the area. On the other hand, the rises of the river flow leads to a significant increase in POP transport downstream, basically in the particulate phase, as a result of the increase in runoff, lixiviation, dragging of soils and the mobilization of sediments (ex. sediment stored in the dams). Flood episodes are thus contributing greatly to the total amounts of POPs annually discharged by the river into the Mediterranean. In the second chapter, the stratified vertical profile of the river in the mouth was studied as an example of the salt wedge estuaries developed in the Mediterranean. The salt wedge in the Ebro produces a great change in the vertical profiles of various physicochemical variables, as well as the concentrations of organic matter and POPs. Flocculation caused by the salinity gradient leads to an increase of suspended organic matter in the salt wedge and the mixing of particles from different sources (organic and mineral). In the salt wedge, this material is also mixed with marine suspended particulate matter and the concentrations of POPs in the suspended solids decrease. However, the salt wedge entraps a large amount of POPs due to the low renewal levels and lack of movement and, thus, keeps the pollutants in the estuary. Although the interface between fresh and salty waters has a crucial role in the transformation and accumulation of organic matter, the results do not show important maxima of POPs in this region. Finally, in the last chapter, from a more general standpoint, an assessment of POPs contamination and ecological risk in the Mediterranean was conducted, using the superficial sediments as indicators. In spite of all the limitations on gathering the existing information (lack of data in the eastern and southern Mediterranean, non-existence of standardised sampling and analytical procedures and ecotoxicological quality standards), some trends can be discerned. Geographically, it has been proved that POPs pollution in the Mediterranean sediments is a local problem and important in some urban and industrial locations, river discharge areas and semi-enclosed zones (harbours and coastal lagoons). In spite of this, the concentrations and their ecological risk are falling rapidly in open sea areas. Temporally, despite the great variability of data, a general decrease of POPs concentrations since the 1970s can be seen.

Las Inmunodeficiencias Primarias (IDPs) son enfermedades congénitas del sistema inmune que tienen en común una susceptibilidad incrementada a las infecciones. Se han descrito más de 200 entidades englobadas bajo esta definición. Algunas de ellas tienen una herencia ligada al X, lo que les confiere ciertas peculiaridades. En esta Tesis presentamos los resultados concernientes a 28 pacientes, casi todos varones, con sospecha de IDP en base a una elevada frecuencia y severidad de infecciones. A cada uno de ellos se les evaluó inmunológicamente, lo que permitió, junto con las manifestaciones clínicas y los antecedentes familiares, establecer un diagnóstico presuntivo de IDP. A partir de aquí, realizamos estudios funcionales, moleculares y genéticos específicos para la IDP sospechada. Estos análisis permitieron identificar la causa genética de la enfermedad, así como ver el grado de afectación de la proteína mutada. Además, se estudió la presencia de la mutación en la familia para determinar portadoras de la patología y posibles pacientes no diagnosticados. En paralelo a estos estudios, los pacientes fueron tratados, siendo muchos de ellos sometidos a un trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH). En este trabajo también se evaluó la recuperación post-TPH repitiendo algunas de las pruebas realizadas durante el diagnóstico. En primer lugar, se estudiaron 6 pacientes con sospecha de Inmunodeficiencia Severa Combinada (SCID). Tras el análisis inmunológico y funcional se analizaron los genes candidatos y se establecieron las mutaciones responsables. Dos de ellos presentaban la forma ligada al X (X-SCID), con alteraciones en IL-2GR: p.Lys120fsX46 y p.Arg222Cys. El caso clínico 3 resultó tener una deficiencia en JAK-3 con una mutación no descrita (p.Thr456fsX520). El caso clínico 4 se diagnosticó de Disgenesia Reticular tras encontrar una mutación en AK2 (c.A1T). Aunque los casos clínicos 5 y 6 presentaban manifestaciones clínicas bastante diferentes, establecimos que ambos hermanos padecían un SCID-Omenn causado por la mutación c.631delT en RAG-2. En el análisis de los dos hermanos con sospecha de Síndrome de hiper-IgM ligado al X encontramos una gran deleción que impedía la expresión de CD40L. Asimismo, estudiamos dos pacientes con Agammaglobulinemia ligada al X: el caso clínico 9 mostró la mutación c.557dupA, mientras que el caso clínico 10, la p.Arg288Gln. A los 4 pacientes con sospecha de Síndrome de Wiskott-Aldrich se les encontró una mutación en el gen WAS: IVS6+5G>A, IVS3+2-3insT, p.Arg34STOP y IVS8+1G>A. El estudio del gen WAS también nos permitió establecer el diagnóstico de Neutropenia ligada al X en el caso clínico 15 (p.Ile294Thr). Se estudiaron 4 pacientes de 2 familias distintas con posible Síndrome Linfoproliferativo ligado al X. Una de las familias presentaba la mutación p.Val102Gly en el gen SH2D1A en los tres hermanos, a pesar de que el menor no había presentado sintomatología. En el otro paciente hallamos una deleción completa del gen. La prueba para la determinación de la capacidad oxidativa de los granulocitos nos permitió diagnosticar a 8 pacientes de Enfermedad Granulomatosa Crónica. Posteriormente, analizamos los genes responsables hasta encontrar el defecto genético. Los casos clínicos 20 y 21 presentaron mutaciones en el gen CYBB: p.Cys59Arg y p.Lys247fsX7, respectivamente. Los casos clínicos 22, 23 y 24 son 3 hermanos a los que les determinamos la presencia de la recombinación homóloga entre el gen NCF1 y su pseudogen. El análisis del caso clínico 25 mostró que era un heterocigoto compuesto para dos mutaciones en NCF2: p.Lys161STOP y una duplicación génica que incluye los exones 9 y 10. Mientras que los casos clínicos 26 y 27 también revelaron una alteración en NCF2, pero en este caso en homocigosis (p.Arg77STOP). Por último, el estudio del caso clínico 28 mostró la mutación más prevalente responsable de Incontinencia Pigmenti. / Primary Immunodeficiencies (PIDs) are congenital disorders of immune system characterized by increased susceptibility to infections. More than 200 entities have been included under this definition. Some of them have an X-linked inheritance, giving them certain peculiarities. In this Thesis, we presented the results of 28 patients, almost all males, with a suspicion of PID due to the higher frequency and severity of infections. First, we evaluated them immunologically. These data together with clinical manifestations and familial antecedents allowed us to establish a presumptive diagnosis of PID. Consequently, we performed specific functional, molecular and genetic studies to the suspected PID. These analyses allowed identifying the genetic cause of the disease and also establish the degree of affectation of the mutant protein. Moreover, we studied the presence of the mutation in their families to identify carriers of the disease and not diagnosed possible patients. In parallel to these studies, the patients were treated and most of them with a Haematopoietic stem cell transplantation (HSCT). During this work, we also evaluated the immune recovery after HSCT repeating some tests performed during the diagnosis. We studied six patients with a suspicion of Severe Combined Immunodeficiency (SCID). After immunological and functional analyses, we studied candidate genes to identify responsible mutations. Two of them presented X-linked SCID (X-SCID) with alterations in the IL-2GR gene: p.Lys120fsX46 and p.Arg222Cys. Patient 3 was deficient in JAK3 with a non described mutation (p.Thr456fsX520). Patient 4 was diagnosed with Reticular Disgenesia after finding a mutation in the AK2 gene (c.A1T). Although patients 5 and 6 presented different clinical manifestations, we established that both siblings had an SCID-Omenn syndrome caused by the mutation c.631delT in the RAG-2 gene. In the analysis of two siblings with suspicion of X-linked Hyper-IgM syndrome, we found a large deletion that prevented CD40L expression. We also studied two patients with X-linked Agammaglobulinemia: patient 9 showed the mutation c.557dupA and patient 10 showed the p.Arg288Gln in the BTK gene. We found a mutation in the WAS gene in the four patients of Wiskott-Aldrich syndrome analyzed: IVS6+5G>A, IVS3+2-3insT, p.Arg34STOP and IVS8+1G>A. The study of the WAS gene allowed also to establish the diagnosis of X-linked Neutropenia in patient 15 (p.Ile294Thr). We studied four patients from two different families with a possible Xlinked Lymphoproliferative syndrome. The three siblings of one of these families presented the mutation p.Val102Gly in the SH2D1A gene, although the youngest had not presented yet symptomatology. In the other patient, we found a complete deletion of the gene. Neutrophil oxidative assay allowed us to diagnose eight patients with Chronic Granulomatous Disease. Afterwards, we analyzed responsible genes until reaching the genetic defect. Patients 20 and 21 presented mutations in the CYBB gene: p.Cys59Arg and p.Lys247fsX7. Patients 22, 23 and 24 were three siblings with the homologue recombination between the NCF1 gene and its pseudogene. Analyses in Patient 25 showed that she was a compound heterozygous of two mutations in the NCF2 gene: p.Lys161STOP and a genetic duplication that included exons 9 and 10. Patients 26 and 27 also showed an alteration in NCF2, but in these cases in homozygosis (p.Arg77STOP). Finally, the study in Patient 28 showed the most prevalent mutation responsible for Incontinentia Pigmenti.

ANTECEDENTS: Alguns pacients infèrtils amb cariotip somàtic normal presenten alteracions en el procés de l’espermatogènesi i increments d’anomalies cromosòmiques numèriques en les cèl·lules germinals. S'ha proposat que les aneuploïdies activen els sistemes de control cel·lular i desencadenen en processos de mort cel·lular programada. OBJECTIUS: 1) Desenvolupar una metodologia seqüencial que permeti la detecció, l’aïllament i l’anàlisi citogenètica de cèl·lules testiculars apoptòtiques. 2) Avaluar la relació entre la presència d’anomalies cromosòmiques i la inducció de processos apoptòtics en cèl·lules germinals prereduccionals, postreduccionals, fases meiòtiques, espermatozoides i cèl·lules de Sertoli procedents de biòpsies testiculars d'individus infèrtils. 3) Analitzar la freqüència d’anomalies cromosòmiques observades en les diferents etapes de l’espermatogènesi i contrastar aquesta informació amb les característiques seminals, l’estudi meiòtic i l’anàlisi de FISH en espermatozoides a fi d’identificar pacients amb un comportament similar. MATERIAL I MÈTODES: Per assolir aquests objectius es van utilitzar 31 biòpsies testiculars de pacients que van consultar per problemes de fertilitat. A partir del protocol desenvolupat es va dur a terme l'anàlisi de les anomalies cromosòmiques numèriques i dels processos apoptòtics. Es va analitzar la constitució cromosòmica de les cèl·lules germinals (pre-reduccionals, figures meiòtiques, cèl·lules post-reduccionals i espermatozoides) i de cèl·lules de Sertoli presents en les poblacions cel·lulars viable, apoptòtica i no seleccionada. Es va comparar la freqüència poblacional d’anomalies cromosòmiques entre les diferents fraccions cel·lulars. Finalment, es va realitzar un anàlisi d'agrupació basant-nos en els resultats obtinguts per cada individu. RESULTATS: Els resultats obtinguts demostren que la metodologia d’anàlisi és eficient per detectar l’associació de processos apoptòtics i anomalies cromosòmiques en cèl·lules testiculars. L’anàlisi dels resultats ha posat de manifest una selecció de les anomalies cromosòmiques cap a les fraccions apoptòtiques en les cèl·lules germinals pre-reduccionals i en els espermatozoides. En les cèl·lules germinals post-reduccionals, cèl·lules en profase I i cèl·lules de Sertoli ambdós processos són independents. CONCLUSIONS: 1) La metodologia desenvolupada permet la detecció, l'aïllament i l’anàlisi citogenètica de cèl·lules apoptòtiques en les diferents fases de l’espermatogènesi i en les cèl·lules de Sertoli de biòpsies testiculars diagnòstiques. 2) Les aneuploïdies observades en cèl·lules prereduccionals s’originen per errors de segregació durant la proliferació mitòtica i són eficientment eliminades via apoptosi. 3) La població d’espermatòcits primaris en profase I és majoritàriament euploide i no s'observa una relació entre la presència d'aneuploïdies i els processos apoptòtics. 4) No s'ha trobat correlació entre la presència d’aneuploïdies i d'apoptosi a les cèl·lules de Sertoli. 5) El punt de control del SAC no és eficient, fet que es reflecteix en un increment d’aneuploïdies en cèl·lules postreduccionals. No s'ha observat correlació entre la presència d'aneuploïdies i processos apoptòtics en cèl·lules postreduccionals. Aquestes cèl·lules són eliminades per vies independents de processos apoptòtics. 6) S'ha observat una relació entre els processos apoptòtics i la presència d'anomalies cromosòmiques en els espermatozoides. 7) La població analitzada és molt heterogènia pel que fa als percentatges d'anomalies cromosòmiques i a les dades clíniques. La qual cosa no ha permès determinar característiques clíniques comunes en les agrupacions realitzades en funció dels percentatges d’anomalies cromosòmiques en els diferents etapes de l’espermatogènesi. Aquestes dades reflecteixen la diversitat citogenètica i fenotípica de les poblacions infèrtils. / BACKGROUND: Some infertile patient with normal somatic karyotype displays spermatogenic disorders and increased rates of numerical chromosome abnormalities in germ cells. It has been proposed that aneuploidies triggers cell cycle checkpoints leading to apoptosis. OBJECTIVES: 1) To develop a methodology allowing the sequential detection, isolation and cytogenetic analysis of apoptotic testicular cells. 2) To assess the relationship between the presence of chromosomal abnormalities and induction of apoptotic processes in testicular cells (pre- and post- reductional germ cells, meiotic stages, spermatozoa and in Sertoli cells) from infertile individuals. 3) To analyze the frequency of chromosome abnormalities observed in the different stages of spermatogenesis and to compare these data with seminogram, meiotic studies and sperm FISH analysis in order to identify patients with a common pattern. MATHERIAL AND METHOD: Thirty-one diagnostic testicular biopsies from patients who had sought consultation for fertility problems have been provided for this study. By using the developed methodology, we have analyzed the presence of numerical chromosome abnormalities and apoptotic processes. In these samples analyzed we have evaluated the chromosome constitution of germ cells (pre- and post-reductional germ cells, meiotic figures and spermatozoa) and Sertoli cells in the three cell populations (apoptotic, viable and non-sorted). Therefore, taken together all patient data, we have analysed the differences between the percentages of chromosome abnormalities in the three populations of germ cells and Sertoli cells. Finally, based on the results obtained, a cluster analysis of patients was build. RESULTATS: The methodology is efficient to detect apoptotic processes and chromosomal abnormalities association in testicular cells. The analysis of the results has revealed a selection of aneuploid cells to the apoptotic fraction in pre-reductional germ cells and in spermatozoa. However, in Sertoli cells, meiotic figures and post-reductional germ cells no relationship between apoptosis and aneuploidy was observed. CONCLUSIONS: 1) The developed methodology allows the detection, isolation and cytogenetic analysis of apoptotic cells at different stages of spermatogenesis and in Sertoli cells from testicular biopsies. 2) Chromosome abnormalities observed in pre-reductional germ cells arise from mitotic segregation errors and are efficiently eliminated through apoptotic processes. 3) Primary spermatocytes are mostly euploid and no relationship between aneuploidies and apoptosis is observed. 4) Aneuploidy in Sertoli cells do not trigger cell death through apoptosis. 5) The aneuploidy level observed in post-meiotic germ cells demonstrates that the spindle assembly checkpoint (SAC) is not efficiently enough to eliminate aneuploid cells through apoptosis. No relationship between apoptosi and aneuploidy are observed in post-meiotic germ cells. These findings together with the observed reduction of aneuploid spermatozoa suggest that aneuploid post-meiotic germ cells are eliminated by apoptotic-independent cell death processes. 6) Aneuploid spermatozoa are depleted from the seminiferous tubules by apoptosis. 7) Our population is very heterogeneous and thus no similar clinical characteristics could be indentified in patients clusters according to the frequency of chromosome abnormalities at different stages of spermatogenesis. This is explained by the cytogenetic and phenotypic diversity of the infertile populations.

El bosque tropical seco es uno de los biomas más ricos en biodiversidad y a la vez el sistema forestal más amenazado del planeta. Tras la masiva transformación de estos bosques en sistemas silvo-pastoriles para uso ganadero, muy pocas son las especies forestales que consiguen colonizar y persistir en estos nuevos ambientes. Mejorar el conocimiento del efecto de los principales impactos resultantes de esta transformación puede ayudar a mejorar la gestión actual del sistema y a proponer alternativas de manejo, ecológicamente razonables, encaminadas a la recuperación forestal. Esta tesis tiene por objetivo investigar qué papel juegan el cambio en el régimen de perturbaciones y en el conjunto de interacciones bióticas sobre el éxito colonizador de Acacia pennatula, una especie común en sistemas silvo-pastoriles de toda Mesoamérica. En el primer capítulo se investiga su capacidad de persistencia por rebrote tras perturbaciones de diversa intensidad (corte y fuego) aplicadas antes y después de la época seca y de manera repetida. Los resultados muestran que los individuos quemados sobreviven y rebrotan menos que los cortados y que al final de la estación seca es más difícil la recuperación, probablemente por la falta de recursos (N y especialmente P) almacenados en la raíz principal. En el segundo capítulo se estudia el papel que puede jugar el ganado como agente dispersor de semillas y la posible interacción entre la endozoocória y el fuego como factores desencadenantes de la germinación. El ganado es un eficaz agente dispersor de las semillas de diversas especies forestales, no obstante el paso por el tracto digestivo no estimuló la germinación de las especies testadas a diferencia del fuego el cual de manera general liberó las semillas de su latencia. En el tercer capítulo se investiga la variación en los mecanismos de defensa de semillas ante la depredación pre-dispersiva por parte de insectos (Bruchidae) a lo largo del rango de distribución altitudinal de A. pennatula. El saciado del predador mediante producciones masivas de frutos y el aborto de semillas que aumenta la mortalidad de las larvas, son mecanismos de defensa que actúan simultáneamente aunque su contribución relativa varía a lo largo del gradiente. En el cuarto capítulo se explora el rol que los frugívoros pueden tener controlando las poblaciones de insectos depredadores de semillas. La presencia de frugívoros reduce la proporción de semillas depredadas e incluso podría promover la coexistencia de varias especies de depredadores sobre la misma planta huésped. En el quinto se estudia el potencial de interferencia alelopática de A. pennatula sobre otras especies competidoras. Esta especie muestra indicios de interferir el desarrollo de las raíces de las plántulas que se establecen bajo su copa poniendo así en duda su capacidad de nucleación de la sucesión tras un eventual abandono de los sistemas silvo-pastoriles en los cuales es dominante. En conjunto A. pennatula es capaz de colonizar y persistir tras la transformación del bosque tropical seco gracias a: i) es eficazmente dispersada por el ganado y germina rápidamente tras el fuego en los pastos, ii) persiste tras perturbaciones repetidas (corte y fuego) mediante sucesivos rebrotes, iii) tiene mecanismos de defensa eficaces ante la depredación pre-dispersiva de sus semillas y es favorecida por la aptitud frugívora del ganado, y iv) es capaz de invadir los pastos e interferir alelopáticamente el establecimiento de plántulas bajo su copa. En la última sección de la presente tesis se proponen diversas alternativas de manejo para mejorar la gestión actual de los sistemas silvo-pastoriles en los cuales esta especie es dominante, y a fin de promover la recuperación forestal y el valor de conservación de la biodiversidad de los mismos. / Tropical Dry Forest (TDF) is one of the most biodiversity-rich biome and the most threatened forest ecosystem of the world. After the pervasive transformation of these forests into wooded rangelands, there are very few species able to colonize and to persist in this new environment. Improving the knowledge of the major impacts resulting from this land-use change may aid the current management practices and may provide ecologically sound alternatives aimed to the forest recovery. The general objective of this thesis is then to investigate the role played by the new disturbance regime and biotic interactions in colonization and persistence of Acacia pennatula, a tree species common in wooded rangelands throughout Mesoamerica. In the first chapter it is investigated its ability to resprout after disturbances (clipping and fire) applied before and after the dry season and repeatedly. The results show that those individuals burned had lower survival and resprouting vigor than those individuals only clipped. Additionally, recovering from a disturbance applied after the dry season was more difficult, and this was likely due to the lack of resources (N and especially P) stored in the main root. In the second chapter it is studied the role that cattle may play as a seed dispersal agent and the potential interaction between endozoochory and fire as triggers of germination. Cattle is currently an effective dispersal agent of several forest species, however, gut passage did not stimulate germination unlike fire which generally broke seeds’ physical dormancy. In the third chapter it is investigated the variation in seed defense mechanisms against pre-dispersal seed predators by insects (Bruchidae) along the altitudinal range of A. pennatula. Predator satiation by means of massive fruit crops and seed abortion which increases larval mortality, are both defense mechanisms that act simultaneously although its relative contribution vary along the altitudinal gradient. In the fourth chapter it is examined the role that frugivores may have in controlling seed predator populations. Frugivores reduced the proportion of seeds preyed upon by seed beetles and the results suggest that frugivores may promote coexistence of different predator species on the same plant host. In the fifth chapter it is studied the allelopathic interference of A. pennatula over other competitor species. The results show that this species may impair seedling establishment under its canopy by reducing root development. This warns about the ability of this species as a succession nuclei after an eventual abandonment of the wooded rangelands in which dominate. Overall, A. pennatula is able to colonize and to persist after TDF transformation thanks to: i) is effectively dispersed by cattle and germinate after pasture fires, ii) persists after repeated disturbances by successive resprouting, iii) has defense mechanisms against pre-dispersal seed predation and moreover is favored by cattle frugivory, and iv) is able to encroach pastures impairing seedling establishment under its canopy by means of an allelopathic interference. In the last section management proposals are provided in order to ameliorate current practices and to promote forest recovery in those wooded rangelands in which this species dominate.

Les tècniques proteòmiques basades en l’espectrometria de masses (MS) permeten la caracterització de la complexa i dinàmica natura del proteoma. Aquestes eines han contribuit a entendre millor certes funcions biològiques i respostes cel·lulars i a obtenir biomarcadors específics per a l’estudi d’algunes malalties. En aquest treball, es van utilitzar tècniques proteòmiques de quantificació i validació, basades en l’espectrometria de masses (MS), en diferents estudis de recerca biomèdica. En el primer estudi es va comparar el perfil de proteïnes del fluid vitri de pacients diabètics amb retinopatia diabètica proliferativa (PDR) amb el de pacients no diabètics amb forat macular idiopàtic (MH). L’anàlisi proteòmica comparativa es va fer amb el sistema d’electroforesi diferencial en gel bidimensional basat en el marcatge fluorescent (2D-DIGE). Per MS es van identificar 11 proteïnes diferencials entre els pacients amb PDR i els individus no diabètics. Cinc de les proteïnes diferencials és van validar per western blot en fluids vitris i per RT-PCR en retines. L’anàlisi proteòmica 2D-DIGE va servir per a identificar potencials candidats involucrats en la patogènesis de la PDR. En el segon estudi es va estudiar l’efecte del gen REgulador AutoImmune (AIRE) mitjançant la comparació dels proteomes de cèl·lules epitelials transfectades o no amb AIRE. L’anàlisi comparativa es va realitzar combinant dues tècniques de proteòmica quantitativa: la 2D-DIGE i l’etiquetatge isotòpic codificat de proteïna (ICPL) en combinació amb cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS). Els resultats van mostrar un nivell incrementat de varies xaperones en les cèl·lules que expressaven AIRE, mentre que diferents proteïnes de interacció del citoesquelet es van trobar disminuïdes. A més, algunes proteïnes relacionades amb apoptosi tenien abundàncies diferencials entre unes cèl·lules i les altres. Aquests resultats es van confirmar per western blot i citometria de flux. Finalment, assajos d’apoptosi amb annexin V i etopòsid van demostrar que les cèl·lules positives en AIRE patien més apoptosi espontània i eren menys resistents a la inducció d’apoptosi. Els resultats obtinguts van corroborar el paper d’AIRE com a inductor d’apoptosi. En el tercer estudi, amb l’objectiu de identificar possibles proteïnes biomarcadores de l’activitat TGFβ en gliomes es van analitzar les proteïnes secretades en els cultius cel·lulars primaris derivats de tumors (PCTCs), tractats o no amb TGFβ, mitjançant experiments quantitatius de LC-MS sense marcatge i ICPL. Es van identificar varies proteïnes candidates per a les que es van desenvolupar mètodes d’anàlisi de seguiment d’una reacció seleccionada (SRM) per a poder validar-les en mostres de líquid cefaloraquidi (CSF) i plasma de pacients amb glioma. Per l’anàlisi dels CSFs els resultats van mostrar una clara correlació entre les proteïnes candidates i els nivells de TGFβ en aquestes mostres. Igualment, al analitzar les proteïnes candidates per SRM en mostres de plasma de pacients amb glioma en fases alternades de tractament amb un inhibidor de TGFβ es va observar que els nivells de les proteïnes d’interès eren modulades pel tractament. Aquestes proteïnes conformarien una firma proteica que podria ser útil per al diagnòstic i el seguiment del tractament dels pacients. En conjunt, els resultats obtinguts en cada un dels tres estudis demostren la utilitat de l’anàlisi proteòmica en diferents aspectes de la investigació biomèdica. / Proteomic techniques based on mass spectrometry (MS) allow the characterization of the complex and dynamic nature of the proteome. These tools have contributed to better understand certain biological functions and cellular responses and to obtain specific biomarkers useful for the management of some diseases. In this work, quantitative and validation proteomic techniques, based on mass spectrometry, were applied to different biomedical research projects. In the first study, the protein profile of the vitreous fluid of diabetic patients with proliferative diabetic retinopathy (PDR) and non diabetic patients with macular hole (MH) was compared. Comparative proteomic analysis was performed using differential in gel electrophoresis based on fluorescent labeling (2D_DIGE). Eleven differential proteins between PDR and non diabetic patients were identified by MS. Five differential proteins were validated by western blot analysis of vitreous fluid and by RT-PCR of retinas. 2D-DIGE proteomic analysis allowed the identification of potential candidates involved in the pathogenesis of PDR. In the second study, the effect of AutoImmune Regulator (AIRE) gen was studied by comparison of the proteomic profile of epithelial cells transfected or not with AIRE. The comparative analysis was done using to proteomic techniques: 2D-DIGE and Isotopic Coded Protein Labeling (ICPL) in combination with liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Results showed an increased level of some chaperons in the cells expressing AIRE, while some cytoskeleton interacting proteins were decreased. Moreover, proteins related wit apoptosis had differential abundances between samples. These results were confirmed by western blot and flow cytometry. Finally, apoptosis assays with annexin V and etoposide demonstrated that AIRE-positive cells suffer more spontaneous apoptosis and are less resistant to apoptosis induction. These results confirm the role of AIRE as an inducer of apoptosis. In the third study, the main objective was the identification of biomarker proteins of TGFβ activity in gliomas. Secreted proteins from primary cultures of tumor cells (PCTCs), treated or not with TGFβ, were analyzed by label free and ICPL LC-MS quantitative experiments. Some candidate proteins were identified. Selected reaction monitoring (SRM) methods were designed to analyze these candidate proteins in cerebrospinal fluid (CSF) and plasma of glioma patients. CSF analysis showed a clear relationship between the protein levels and the TGFβ concentration. When the SRM methods were applied to the plasma of glioma patients under alternate periods of treatment with a TGFβ inhibitor, the levels of proteins of interest were observed to be modulated by the treatment. These proteins can thus constitute a protein signature useful for diagnostic and treatment monitoring. Overall, the results obtained in each of the projects show the usefulness of the proteomic analysis in different aspects of de biomedical research

El plegament de la cromatina a l’interior dels cromosomes metafàsics segueix sent un dels problemes més difícils de resoldre de la biologia estructural. La majoria dels models de plegament més acceptats, que presenten la fibra de cromatina com a unitat bàsica, van ser proposats en condicions de molt baixa força iònica. Mitjançant múltiples tècniques microscòpiques, es va observar que els cromosomes metafàsics contenen un nou element bàsic de plegament: la placa de cromatina. Com a objectiu general, el treball experimental realitzat en aquesta tesi pretén ampliar el coneixement sobre l’estructura interna dels cromosomes metafàsics utilitzant condicions iòniques properes a les observades a la metafase. En primer lloc, s’ha estudiat l’estructura dels cromosomes dins les cèl·lules mitjançant microscòpia de polarització. Per altra banda, s’ha realitzat un ampli estudi de la capacitat d’autoassociació de fragments de cromatina de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes en condicions properes a la metafase. Mitjançant microscòpia de polarització, s’ha vist que els cromosomes metafàsics en medi aquós dins els sacs cel·lulars, són estructures òpticament isotròpiques. L’isotropia observada permet concloure que els cromosomes metafàsics no estan formats per piles paral·leles de nucleosomes. Aquesta possibilitat no exclou però l’associació de les cares laterals dels nucleosomes, que podrien donar lloc a piles amb diferents orientacions. Els resultats obtinguts mitjançant microscòpia electrònica de transmissió de fragments de cromatina obtinguts per digestió amb nucleasa micrococal de cromosomes metafàsics de cèl·lules humanes, mostren que únicament adopten una conformació estesa quan la concentració iònica del medi és molt baixa (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). En condicions iòniques properes a la metafase (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), els fragments de cromatina obtinguts tenen la capacitat intrínseca de formar estructures laminars per autoassociació. A més, no s’observen fibres de cromatina. Les plaques formades per autoassociació presenten les mateixes característiques que les emanades directament de cromosomes metafàsics: són estructures compactes, de superfície llisa i multilaminars. L’alçada de les plaques formades per autoassociació de fragments de cromatina metafàsica determinada a partir de mostres platinades unidireccionalment és de 6.8 ± 1.0 nm per làmina. Aquest valor coincideix amb l’alçada de les plaques emanades de cromosomes parcialment desnaturalitzants, observades al grup. L’aparició d’estructures laminars de gruix superior en mostres sotmeses a incubacions llargues a 25 i 37ºC, indica l’elevada tendència de les làmines de cromatina d’apilar-se i formar estructures multilaminars. Els cossos circulars compactes de 30 nm observats als voltants de les plaques obtingudes, sumat a la presència d’altres estructures circulars més petites sobre les plaques, suggereix que els cossos de 30 nm són estructures intermediàries durant el procés de formació de plaques. Tenint en compte que l’alçada d’un nucleosoma és de 11 nm i que no hi ha evidències que suggereixin una col·locació en columnes dels nucleosomes a les plaques, els resultats indiquen que els nucleosomes es distribueixen de forma parcialment inclinada a l’interior de les plaques. A partir dels resultats obtinguts, es pot suggerir que els nucleosomes a les plaques estan orientats irregularment. La interdigitació entre les làmines successives permet la interacció entre les cares laterals dels nucleosomes i dóna estabilitat a les plaques. La tendència a l’autoassociació de fragments de cromatina metafàsica per formar estructures multilaminars molt estables, suggereix que les cromàtides contenen cromatina plegada en una forma laminar al seu interior. / The three-dimensional organization of the chromatin filament in metaphase chromosomes is one of the most challenging problems of structural biology. The most accepted structural models for chromatin organization in the metaphase chromosome are those that present the chromatin fibber as a basic unit. However, they were proposed by the use of low ionic strength buffers. Through the use of several microscopy techniques, it was observed that metaphase chromosomes were built by a new structural element: the chromatin plate. The main goal of this thesis was to gain further insight on internal structure of metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Firstly, it was analysed the entire chromosome structure within the cell using polarizing microscopy; and secondly, it was analysed the assembly process of digested chromatin fragments from human metaphase chromosomes under metaphase ionic conditions. Through the use of polarizing microscopy, it was observed that metaphase chromosomes in aqueous solutions under different ionic conditions are optically isotropic. These results exclude the possibility that nucleosomes are oriented regularly forming parallel columns inside metaphase chromosomes. Despite of this, it does not exclude the face-to-face and lateral side-by-side interactions of different nucleosomes, that can already generate columns with several orientations. The results obtained in the self-assembly process of chromatin fragments obtained after the digestion of micrococcal nuclease of human metaphase chromosomes observed with transmission electron microscopy, showed that they appear to be in an extended conformation just under low ionic strength condition (10 mM Pipes, 10 mM EDTA). When fragments are treated under metaphase ionic conditions (10 mM Pipes, 120 mM K+, 20 mM Na+, 17 mM Mg2+), it was observed that chromatin filaments generate laminar structures. In addition, there is no presence of chromatin fibbers. Self assembled plates show the same structural properties than the ones that emanate directly from metaphase chromosomes (i.e., flat and smooth surface, well-defined edges, stacking of several layers). Furthermore, the height of the plates obtained by self-assembly determined in unidirectional shadowing experiments is 6.8 ± 1.0 nm. This value is equal to the height of the plates emanated from partially denatured chromosomes, which was observed previously in our group. The presence of thick plates in the experiments performed at 25 and 37ºC indicate that the self assembled plates can be formed by stacked layers. Circular structures of 30 nm were observed surrounding the plates but also closely associated with them. Their presence suggested that these structures are intermediates of the plate generation process. Taking into account that the nucleosome height is 11 nm and that there are no evidences that suggest the presence of nucleosome columns inside the plates, results indicate that nucleosomes are slightly inclined in the chromatin plates. In conclusion, the results obtained in this thesis suggest that there is an irregular orientation of the nucleosomes inside the chromatin plates. The interdigitation of adjacent layers allows face-to-face and lateral side-by-side interactions between nucleosomes of successive layers, which confers stability and compactness to the laminar structure. The metaphase chromatin tendency to generate multilayered stable structures after a self-assembly process suggests that chromatids are composed of chromatin folded in a laminar way

vegeu pdf