Les cèl·lules eucariotes estan constantment exposades a dany al DNA i a estrès replicatiu (estrès genotòxic), font d'inestabilitat genòmica. L'anomenat mecanisme de vigilància (checkpoint) de la fase S detecta la presència d'estrès genotòxic i genera una resposta que inclou l'aturada preventiva de la replicació i del cicle cel·lular, per tal de donar temps a la superació del problema, i la protecció de la replicació dels cromosomes. Quan els elements centrals d'aquest mecanisme de control estan mutants, les cèl·lules esdevenen genèticament inestables i, en humans, predisposa al càncer. Malgrat el seu paper crític en la preservació de la integritat del genoma, es desconeix la manera com el mecanisme de vigilància de la fase S executa bona part de la seva resposta. Els elements i vies que constitueixen el checkpoint estan conservats evolutivament. El nostre treball s'ha centrat en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae. En aquest organisme la proteïna quinasa efectora principal és Rad53. Amb l'objectiu de descobrir dianes a través de les quals Rad53 regula la fase S, s'han assajat en una reacció quinasa in vitro diferents proteïnes candidates a ser substrat de Rad53. Això ha permès la identificació de la ciclina de fase S Clb6 com a substrat de Rad53 in vitro.Les ciclines són les subunitats activadores de la quinasa dependent de ciclina Cdc28/Cdk1, que promou la progressió del cicle cel·lular. Cdc28/Cdk1 és activada per diferents ciclines específiques de les diferents fases del cicle cel·lular, que li confereixen especificitat de substrat. Clb6 és una de les dues ciclines de fase S (junt amb Clb5), que promouen la replicació del DNA. Mentre que Clb5 és present des del final de la fase G1 fins a anafase, Clb6 és eliminada durant la primera meitat de la fase S. Per tal d'estudiar si Clb6 és diana de Rad53 in vivo, s'ha estudiat el seu comportament en resposta a estrès genotòxic. Interessantment, en una fase S compromesa els nivells de Clb6 es mantenen estables, i aquesta estabilització és dependent de Rad53. Experiments amb l'inhibidor de la traducció proteica cicloheximida mostren que l'estabilització de Clb6 requereix síntesi de novo. Donat que en un cicle cel·lular no pertorbat Clb6 és expressada exclusivament en fase G1, sota el control del factor de transcripció MBF. Els nostres resultats indiquen que MBF es reactiva en una fase S compromesa: la subunitat transactivadora Swi6, exclosa del nucli en una fase S no pertorbada, és nuclear en una fase S compromesa; per altra banda, la sobreexpressió d'una forma hiperestable del repressor d'MBF Nrm1 dóna lloc a la desaparició de Clb6 malgrat la presència continuada d'estrès genotòxic i una resposta checkpoint funcional. Fins ara MBF era considerat un factor de transcripció exclusiu de la fase G1.Per últim hem explorat el paper de l'estabilització de Clb6 en una fase S compromesa. El mutant nul clb6 no presenta cap fenotip detectable, suggerint que Clb6 pot operar en forma redundant dins de la resposta a estrès genotòxic. Per aquest motiu hem optat pel plantejament complementari: estudiar l'efecte de mantenir la presència de Clb6 en una fase S no pertorbada (i per tant en absència de la resta de la resposta checkpoint). En aquestes condicions les cèl·lules repliquen el seu DNA amb aparent normalitat, però queden aturades en un estadi previ a anafase. Aquests resultats suggereixen que Clb6 pot ser un element efector de la branca S-M del mecanisme de vigilància de la fase S, que estaria constituïda per diversos punts de control solapat. Aquest paper justificaria que Clb6 hagi de ser eliminada de forma avançada respecte a Clb5. / Eukaryotic cells are permanently exposed to DNA damage and to replication stress (genotoxic stress), a source of genomic instability. A surveillance mechanism, the S phase checkpoint, detects and responds to genotoxic stress, and elicits a response that includes the arrest of cell cycle progression -to give time to overcome the insult- and the protection of chromosome replication. When the checkpoint central elements are mutated cells become genetically unstable, which in humans results in a high frequency of cancer.Despite such critical role to preserve genomic integrity, much remains unknown about the way how the S phase checkpoint executes its response. Because the checkpoint elements and pathways are conserved, our work has been carried out in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. In this organism Rad53 is the S phase checkpoint effector kinase. To identify novel Rad53 targets, we carried out an in vitro kinase assay with different potential substrate proteins involved in cell cycle control. This approach identified the S phase cyclin Clb6 as an in vitro Rad53 substrate.Cyclins are the activatory subunits for Cdc28/Cdk1, the cyclin dependent kinase that drives cell cycle progression in budding yeast. Cdc28/Cdk1 is activated by different cell cycle phase specific cyclins, that also confer substrate specificity to the kinase. Clb6 and Clb5 are the S phase cyclins, promoting the onset of DNA replication. Interestingly, whereas the presence of Clb5 spans from late G1 to anaphase, Clb6 is eliminated earlier, during S phase.To study whether Clb6 is a target of Rad53 in vivo, we explored the effect of genotoxic stress on the cyclin. When cells are exposed to replication stress or to DNA damage during S phase, the presence of Clb6 is stabilized, and such stabilization depends on Rad53.Experiments with the inhibitor of protein translation cycloheximide show that the stabilization of Clb6 requires de novo synthesis. In an unperturbed cell cycle Clb6 is expressed only during G1 phase, under the control of the transcription factor MBF. Our results show that MBF is reactivated in a compromised S phase: the transactivatory subunit Swi6, excluded from the nucleus in an unperturbed S phase, shows nuclear localization during a compromised S phase; in addition, the overexpression of a hyperstable form of the MBF repressor Nrm1 results in Clb6 elimination, despite the continued presence of genotoxic stress and a functional checkpoint response. To date, MBF was considered a transcription factor operating solely and characteristically during G1 phase.Finally we have explored the role of Clb6 stabilization in response to genotoxic stress. The clb6 null mutant does not present a detectable phenotype, which is compatible with a redundant role in the response to genotoxic stress. We therefore chose to address the question the other way round, and study the effect of keeping the levels of Clb6 stable during an otherwise unperturbed S phase (and therefore in the absence of the vast checkpoint response that could mask the specific role of Clb6). Under such conditions cells replicate normally, but arrest in a stage previous to anaphase. These results suggest that Clb6 may be an effector element in the S-M branch of the S phase checkpoint. One such role would explain why Clb6 must be eliminated in S phase, ahead of Clb5 during mitosis.

Les flors emeten compostos orgànics volàtils (VOCs) per tal d’atreure pol·linitzadors i estimular la fecundació creuada. Alguns volàtils florals però juguen altres funcions, com ara la defensa contra els herbívors. Aquesta dualitat de rols que tenen les olors florals les converteix en complexes mescles de compostos amb múltiples efectes sobre diferents organismes. La complexitat de comprendre i caracteritzar les emissions florals augmenta quan considerem que són variables en el temps i l’espai. A aquestes fonts de variabilitat cal afegir diversos factors ambientals biòtics i abiòtics que modifiquen les emissions de COVs florals de diverses maneres. L’objectiu principal d’aquesta tesi és esclarir quins són els factors que determinen les emissions florals de volàtils, i veure de quina manera les afecten a elles i a les seves funcions ecològiques. En el primer capítol de la tesi hem revisat el coneixement actual sobre les emissions florals de VOCs i hem identificat les qüestions que necessitaven ser investigades en aquest camp de recerca. Les emissions florals estan determinades en primer lloc per la diversitat de compostos que les espècies són capaces de produir, els seu potencial biosintètic i la seva capacitat d’emissió, que estan fortament lligades a la biologia de l’espècie. Hem testat i demostrat que les plantes pol·linitzades per insectes solen presentar major diversitat de volàtils florals i emeten una major quantitat d’aquests que les plantes pol·linitzades pel vent, que no necessiten volàtils florals per funcions d’atracció. Hem testat si els patrons estacionals de disminució de la competència que ocorren cada any entre plantes d’una mateixa comunitat vegetal han donat lloc a la selecció d’un patró de disminució de les emissions i les recompenses florals al llarg del període de floració de cada espècie. També hem observat que les plantes adapten la seva fisiologia per optimitzar les seves emissions florals sota les condicions climàtiques de la seva època de floració. Les emissions florals de COVs es veuen afectades per factors ambientals al nivell d’organisme o de teixit. Hi ha diversos estats fisiològics de la planta que poden modificar substancialment la composició i la quantitat de les emissions florals de COVs. Els nostres experiments han demostrat que la microbiota floral pot jugar un rol crucial sobre la quantitat i composició de les emissions florals de COVs. També hem mostrat que l’herbivoria de flors per part d’erugues de Pieris brassicae sobre plantes de Diplotaxis erucoides indueixen augments immediats de les emissions de compostos amb funcions defensives. A més, l’herbivoria de flors i fulles combinada va mostrar un efecte sinèrgic que augmenta la resposta defensiva. La recerca sobre els canvis que poden experimentar les emissions florals en resposta a diversos agents del Canvi Global són de gran interès degut als diversos efectes que aquests canvis poden tenir sobre les interaccions que s’estableixen mitjançant els COVs florals. Els nostres resultats revelen que els augments de temperatura previstos per al segle següent deguts a l’Escalfament Global poden conduir a augments significatius de les emissions totals de COVs i també a canvis importants en la composició relativa de les olors florals. També hem observat que l’ozó causa una degradació significativa dels compostos florals i provoca canvis en la composició relativa de les olors. Els testos de resposta indiquen que els canvis observats en les olors florals exposades a ozó resulten en la pèrdua de l’atracció de pol·linitzadors. Aquesta tesi proporciona una nova visió sobre els factors que determinen les emissions florals de volàtils i les seves repercussions sobre les interaccions planta-pol·linitzador, i garanteix una major consideració dels factors biòtics i abiòtics que afecten la química i l’ecologia de les olors florals en un ambient contínuament canviant. / Flowers emit volatile organic compounds (VOCs) to attract pollinators and stimulate reproductive outcrossing. Some floral volatiles can play roles other than attraction, such as defense against herbivores. This duality of roles of flower emissions converts floral scents into complex mixtures of compounds with multiple effects on different organisms. The complexity of understanding and characterising floral emissions increases when considering that they are variable in time and space. To all these sources of variability we can add diverse biotic and abiotic environmental factors that modify floral VOC emissions in many different ways. The main objective of this thesis was to shed light on which are the factors that determine floral volatile emissions, and how do they affect these emissions and their ecological functions. In the first chapter of this thesis we reviewed the current knowledge on floral VOC emissions. We identified the open questions that still needed to be addressed or investigated in more detail in the research field of floral VOC emissions. Floral emissions are first determined by the array of compounds that the species are able to produce and their potential biosynthetic and emission capacities, which are strongly related to the species biology. We tested and demonstrated that flowering plants pollinated by insects usually present higher diversities of floral volatiles and emit higher amounts of them, than do plants pollinated by wind which do not need floral volatiles for attractive purposes. We tested whether well-known seasonal patterns of decreasing competition occurring every year in a community among co-flowering plants for pollinators led to the selection of a pattern of decreasing emission of floral volatiles and decreasing production of floral rewards along the flowering period of each species. We also observed that plants adapt their physiology to optimize their floral emissions under the climatic conditions of the flowering period. Floral VOC emissions of the species are affected by environmental factors at the individual (organism) or tissular level. There are diverse physiological states of the plant that can substantially modify the emission profiles and amounts of floral VOCs. Our experiments demonstrated that floral microbiota can play a crucial role in the quantity and quality of floral VOC emissions. We also showed that flower herbivory by Pieris brassicae caterpillars on Diplotaxis erucoides plants induced immediate increases in floral emission rates of few compounds with known defensive functions. Leaf herbivory caused no changes in the emissions of intact flowers, but the combination of leaf herbivory with flower herbivory showed a synergistic effect with enhanced defensive response. The research on the potential changes that floral emissions could experience in response to diverse drivers of Global Change are of critical interest because of the diverse effects that such changes can have on the interactions that floral VOCs mediate. Our results revealed that temperature increases as those predicted for the next century as a result of Global Warming can lead to significant total increases in floral VOC emissions and also to important changes in floral scent relative composition. We also detected that ozone caused significant degradation of floral compounds and changes in their relative composition. Behavioural tests indicated that all the changes observed in floral chemical cues when exposed to ozone resulted in the loss of attraction effect on pollinators. This thesis thus provides new insights on the factors that determine floral volatile emissions and their repercussions on plant-pollinator interactions and warrant deep consideration of both biotic and abiotic factors driving floral scent chemistry and floral scent ecology in a continuously changing environment.

S'ha aconseguit preparar per electrodeposició, a partir d'un medi sulfat-citrat, capes binàries cobalt-molibdè (aliatge Co-Mo) i capes ternàries cobalt-níquel-molibdè (aliatge Co-Ni-Mo) magnèticament toves, adequades per poder ésser implementades en dispositius d'actuació magnètica. La deposició de l'aliatge Co-Mo és un procés induït i té lloc a través de la formació d'òxids/hidròxids de molibdè de valència mixta (MoIV-V). Per a cada bany existeix un potencial llindar que permet la reducció d'aquests òxids fins a molibdè metàl·lic, cosa que condueix a la formació de l'aliatge. Si s'apliquen potencials més positius que el corresponent valor llindar, aleshores la descàrrega del molibdè no és completa i poden obtenir-se exclusivament sobre l'elèctrode pel·lícules d'òxids de molibdè. En condicions de formació d'aliatge (el potencial aplicat és més negatiu que el corresponent valor llindar) i quan s'incorporen percentatges de molibdè del 5-15% en pes a les capes de cobalt, s'aconsegueix reduir significativament la coercitivitat del material bo i mantenint una magnetització de saturació raonablement elevada. Això s'aconsegueix a partir de banys a pH = 4,0 que contenen un excés de Co(II) respecte d'agent complexant (citrat) i una baixa concentració de molibdat. A valors de pH superiors i en condicions d'excés de citrat respecte de Co(II) en solució, la incorporació de molibdè als dipòsits és superior (20% en pes aprox.). En aquest darrer cas, si bé la coercitivitat de les capes continua essent inferior a la del cobalt pur, la magnetització de saturació també és considerablement menor. L'electrodeposició de capes ternàries Co-Ni-Mo té lloc segons un procés induït del molibdè i simultàniament anòmal entre cobalt i níquel. La incorporació de níquel (11-15% en pes) millora l'aspecte de las làmines i, a més, augmenta la duresa i la resistència a la corrosió del material sense perjudici sobre la resposta magnètica. Poden obtenir-se, d'una banda, capes gruixudes d'aliatge sobre elèctrodes de coure i grafit i, de l'altra, capes primes (d'entre 1 i 3 micres) apropiades per a actuació magnètica sobre elèctrodes de base silici. Ambdós processos d'electrodeposició, Co-Mo i Co-Ni-Mo, són altament selectius, de manera que poden preparar-se microestructures amb un perfil ben definit i parets laterals verticals quan es diposita sobre substrats de base silici folotilografiats. S'ha assajat la resposta magnètica i mecànica dels aliatges desenvolupats en sistemes de test com ara microvàlvules i s'ha vist que són aptes per poder ésser implementats en la tecnologia de MEMS (sistemes microelectromecànics). / The preparation of binary cobalt-molybdenum (Co-Mo) and ternary cobalt-nickel-molybdenum (Co-Ni-Mo) layers has been successfully achieved by means of electrodeposition from a sulphate-citrate medium. These layers are soft-magnetic and satisfy the requirements for further implementation in magnetic actuation devices. Co-Mo codeposition is an induced process and occurs through the formation of mixed valence (IV-V) molybdenum oxides/hydroxides as intermediate species on the electrode. There is a threshold potential that determines the evolution of molybdenum oxides towards metallic molybdenum, thereby allowing alloy formation. The threshold potential value depends on the composition of the electrolytic bath. Either molybdenum oxide films or Co-Mo alloy layers can be prepared by applying more positive or more negative values, respectively, than the threshold potential. Co-Mo layers with 5-15 wt.% Mo show lower coercivity than pure Co coatings while maintaining a reasonably high saturation magnetisation. Baths used to prepare these layers are acidic (pH 4.0) and contain a higher Co(II) concentration than that of citrate and a very low molybdate concentration. Molybdenum-richer layers (20 wt.% aprox.) can be obtained from baths at a higher pH which contain, conversely, a higher citrate concentration than that of Co(II). Under these conditions, coercivity remains low but the saturation magnetisation decreases considerably. The electrodeposition of ternary Co-Ni-Mo layers is a complex process since molybdenum discharge is induced and that between cobalt and nickel anomalous. The addition of 11-15 wt.% nickel to the layers improve their appearance, hardness and corrosion resistance. Thick Co-Mo and Co-Ni-Mo coatings can be obtained onto copper and graphite electrodes, while thinner layers (of 1-3 microns) appropriate for magnetic actuation can be obtained on silicon-based substrates. Well-grown microstructures with vertical-side walls have been prepared on photolithographed silicon. Both magnetic and mechanical responses of the developed alloys have been explored with good results. Thus, they would be suitable for microelectromechanical (MEMS) applications.

There is considerable evidence of the need for a semiconductor technology which exceeds the limitations imposed by silicon across a wide spectrum of industrial applications. Wide bandgap semiconductor, such as silicon carbide (SiC), gallium nitride (GaN) and diamond, offer the potential to overcome both the temperature and voltage blocking limitations of Si. SiC is nowadays the most attractive candidate, offering significant potential advantages at both high temperature and high voltage levels whilst benefiting from tractable materials technology. Moreover, SiC is the only that can be thermally oxidized to form a high quality native oxide (SiO2), which enables the fabrication of MOS based devices. However, very near the definitive emergence, the SiC technology needs to address two fundamental limitations: The price of the wafers and the poor SiC/SiO2 interface. The high density of imperfections encountered at the SiC/oxide interface represents a major obstacle in the development of functional SiC devices. The main efforts of this thesis have been directed to the detection and reduction of interface traps in the oxide/SiC interface. To achieve this demanding objective, two different ways have been contemplated: (1) Investigations have been carried out to improve the thermal oxidation or even to improve the formation of the interface with alternative techniques as nitridation or deposited oxides. (2) The classical insulator made up with SiO2 has been replaced by other innovative dielectrics.Innovative gate fabrication processes have been proposed in this thesis using deposited SiO2 gate oxides from PECVD with silane and TEOS as precursors. SiO2-TEOS deposited oxides are an alternative to thermal oxidation. 4H-SiC MOSFET with mobilities up to 38-45 cm2/Vs [(0001) face] and 216 cm2/Vs [(11-20) face] have been fabricated. We have demonstrated that the thermal oxidation of Ta2Si is a simple way to achieve a high-k dielectric on SiC (and on Si). We have fabricated one of the first well behaved high-k MOSFET on SiC with a mobility peak up to 45 cm2/VsIn the last section, a field-effect mobility model including Coulomb scattering at interface traps has been proposed fitting the experimental channel mobility of SiC MOSFETs and the device behavior depending on the density of interface traps, the substrate doping level and the temperature.

Les interaccions planta-pol·linitzador són un component essencial de la biodiversitat i la funció ecològica dels ecosistemes terrestres. Un dels principals objectius de l'ecologia de la pol·linització és descriure aquestes interaccions i comprendre els factors subjacents a la seva estructura. En aquesta tesi doctoral es presenten els resultats dels estudis duts a terme durant tres anys en una comunitat mediterrània de plantes i els seus insectes pol·linitzadors al parc natural del Garraf (NE Espanya). En el capítol 1 es van registrar les interaccions planta-pol·linitzador i es van mesurar diferents trets morfològics, fenològics i ecològics de les especies de plantes i pol·linitzadors en un intent d'establir quins d’aquest trets estructuren les relacions planta-pol·linitzador. Es van registrar 14.713 contactes entre les principals 23 espècies de plantes i 221 espècies de pol·linitzadors, que van representar 960 interaccions específiques. Trobem que un tret ecològic (densitat de flors) i un tret fenològic (temps de floració) de les plantes van ser els principals factors que expliquen les interaccions observades. Trets florals, com la restricció de la corol·la i el pol·len i la producció de nèctar per flor, van tenir un efecte menor. En el capítol 2 s’explora el paper d'un atribut floral diferent i complex, l’aroma floral, en l'estructuració de la variació temporal de les taxes de visites de pol·linitzadors en la mateixa comunitat. Trobem que les plantes que floreixen a principis de la temporada, en un moment en què les flors són més abundants però els pol·linitzadors són escassos, produeixen major quantitats de compostos volàtils que les plantes que floreixen més tard, quan els pol·linitzadors són molt més abundants en relació a les poques flors disponibles. Aquest és el primer estudi en el qual s'analitzen els patrons d'emissió de fragàncies florals a nivell comunitari. Finalment, al capítol 3 s'exploren amb més detall la importància d’aquestes fragàncies florals mitjançant un cas d’estudi realitzat en el Jardí Botànic i Ecològic de la Universitat de Bayreuth (Alemanya). En aquest estudi es va utilitzar una planta focal (la composta Cirsium arvense) i un dels seus pol·linitzadors principal (el sírfid Episyrphus balteatus). Mitjançant mesures de volàtils al laboratori, tècniques d’electroantenografia i bioassajos es va trobar que els senyals olfactius eren més importants que els senyals visuals com a atraients de E. balteatus cap a les inflorescències de C. arvense. / Plant-pollinator interactions are an essential component of biodiversity and ecological function in terrestrial ecosystems. One of the main objectives of pollination ecology is to describe these interactions and to understand the factors underlying their structure. In this PhD thesis we present the results of studies conducted over three years in a Mediterranean plant-pollinator community in the natural park of el Garraf (NE Spain). In chapter 1 we monitored plant-pollinator interactions and measured plant and pollinator traits in an attempt to establish the main drivers of plant-pollinator relationships. We recorded 14713 contacts between the main 23 plant species and 221 pollinator species, representing 960 specific interactions. We found that an ecological trait (flower density) and a phonological trait (flowering time) were the main factors explaining the observed interactions. Floral traits, such as corolla restrictiveness and pollen and nectar production per flower, had a lesser effect. In chapter 2 we explore the role of a different and complex floral attribute, floral scent, in structuring temporal variation in pollinator visitation rates in the same community. We found that plants blooming early in the season, at a time when flowers are most abundant but pollinators are scarce, produce larger amounts of volatiles than plants blooming later, when pollinators are plentiful for the few flowers available. This is the first study in which emission patterns are analysed at the community level. Floral fragrances are further explored in chapter 3, which describes a case study conducted at the Ecological Botanical Garden of the University of Bayreuth (Germany). This study involves a focal plant (the composite Cirsium arvense) and a focal pollinator (the syrphid fly Episyrphus balteatus), and uses laboratory volatile measurements, electroantennography techniques and biossays. We found that olfactory cues were more important than visual cues as attractants of E. balteatus to C. arvense inflorescences.

La Enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa cuyos síntomas incluyen no sólo la pérdida de memoria de los pacientes, sino también problemas en la función ejecutiva, cambios de personalidad, etc. Se trata de una enfermedad compleja, son numerosos los factores de riesgo que pueden estar implicados en su desarrollo y se observan también alteraciones a diferentes niveles, tanto neurohistológicas, como genéticas, metabólicas, etc. En los últimos años, se ha estudiado extensamente la implicación de la Diabetes Mellitus y la Resistencia a la Insulina como factores de riesgo para el desarrollo de la AD. Así, numerosos estudios demuestran que la administración de insulina es capaz de mejorar la memoria tanto en personas sanas como en pacientes de AD. También se ha demostrado que los péptidos IGF‐1 y GLP‐1, estrechamente relacionados con la vía de señalización de la insulina, pueden actuar como factores de crecimiento y neuroprotección a nivel del Sistema Nervioso Central. Además, los niveles de expresión de los receptores de insulina, IGF‐1 y GLP‐1, así como su capacidad de activación se encuentran significativamente reducidos en el cerebro de pacientes de AD y esto correlaciona con el avance de la enfermedad, especialmente con el avance de la patología amiloide. En esta tesis doctoral, demostramos que los niveles de mRNA de IGF‐1R aumentan significativamente en animales 3xTgAD de 9 meses, pero los niveles del receptor proteico total y activado se encuentran reducidos en animales 3xTgAD de 9 y 12 meses. Esta reducción coincide en el tiempo con el cambio en la acumulación de los péptidos desde una localización intraneuronal a una localización extraneuronal, y ambos fenómenos podrían estar relacionados. Para demostrar la implicación de IR/IGF‐1R y GLP‐1R en el correcto funcionamiento neuronal y en el desarrollo de los síntomas de la AD, hemos diseñado dos vectores adenoasociados (AAV) que expresan un shRNA‐IGF1R y un shRNA‐IR, respectivamente, y los hemos inyectado conjuntamente en el hipocampo de hembras 3xTgAD de 2 meses de edad. Este silenciamiento de la vía IR/IGF‐1R provocó un aumento en la acumulación intraneuronal de Aβ a los 4 meses de edad en comparación con la encontrada en hembras inyectadas con un shRNA‐scrambled. Por otra parte, también diseñamos dos vectores AAV para sobreexpresar el cDNA de IGF‐1R y GLP‐1R en el hipocampo y córtex prefrontal de animales 3xTgAD de 5 meses de edad. De esta manera hemos demostrado que la sobreexpresión de GLP‐1R, pero no la de IGF‐1R, consigue corregir los síntomas neuropsichiátricos asociados a la demencia (BPSD), así como la flexibilidad cognitiva de los machos 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con una reducción en la acumulación de Aβ en el hipocampo, así como una reducción de la neuroinflamación y de la pérdida neuronal en el córtex cerebral. En las hembras, ambos tratamientos tienen efectos moderados sobre los BPSD, pero sólo la sobreexpresión de IGF‐1R consigue mejorar la capacidad de aprendizaje y memoria espacial de las hembras 3xTgAD de 12 meses de edad. Esto correlaciona con una reducción en la neuroinflamación en hipocampo y amígdala, una menor acumulación de la proteína tau fosforilada, así como una reducción de la pérdida neuronal en el córtex. / Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder whose symptoms include not only memory loss, but also executive function problems, personality changes, etc. It is a complex disease, there are many risk factors implicated in its development and impairment in many aspects can be observed, as neurohistology, metabolism, genetics, etc. Diabetes Mellitus and Insulin Resistance have emerged in the late years as a risk factor for AD, as several studies demonstrate that insulin administration is able to improve memory in healthy patients as well as in AD patients, and the related peptides IGF‐1 and GLP‐1 can act as growth and neuroprotection factors in the Central Nervous System. Moreover, expression levels of IR, IGF‐1R, GLP‐1R, as well as their activation ability after binding of insulin, IGF‐1 and GLP‐1 to their corresponding receptors are impaired in brains of AD patients and this correlates to the stage of the disease, specially to the amyloid pathology. In this study, we demonstrate that IGF‐1R mRNA levels are significantly elevated in 3xTgAD animals when compared to WT at 9 months‐old, but there is a reduction at protein level and activation of IGF‐1R in 9 and 12 months‐old 3xTgAD animals. This reduction could be related to the change from an intra to an extraneuronal accumulation of Aβ peptides. To demonstrate the implications of IR/IGF‐1R and GLP‐1R for a correct neuronal function and in the developments of AD symptoms, we designed two AAV vectors expressing a shRNA‐IGF1R and a shRNA‐IR respectively, and we jointly injected them in the hippocampus of 2 months‐old 3xTgAD females. This IR/IGF‐1R silencing caused an increase in the intraneuronal Aβ accumulation at 4 months‐old when compared to females injected with a shRNA‐scrambled. We also designed two AAV vectors for the overexpression of IGF‐1R and GLP‐1R in the hippocampus and prefrontal cortex of 5months‐old 3xTgAD animals. We demonstrate that the overexpression of GLP‐1R, but not IGF‐1R, correct Behavioral and Psychiatric Symptoms associated to Dementia (BPSD) and cognitive flexibility in 12 months‐old 3xTgAD males, and this correlates with a reduction of Aβ accumulation in hippocampus, as well as with a reduction of neuroinflammation in amygdala and neuronal loss in cortex. In females, both treatments have moderate effect on BPSD, but only IGF‐1R overexpression improves spatial learning performance and spatial memory in 12 months‐old 3xTgAD females. This correlates with a reduction of neuroinflammation, accumulation of phosphorylated tau and neuronal loss in cerebral cortex.

Esta tesis abarca un análisis estructural y funcional de las ribonucleasas antimicrobianas. Se han analizado los centros de interacción de ligandos nucleotídicos con la RNasa A como referencia. Los estudios estructurales, estadísticos y por cristalografía de rayos X, de complejos de RNasas han permitido definir, junto a la triada catalítica, otros subcentros de interacción secundarios. La superfamilia de la RNasa A incluye miembros con funciones no necesariamente relacionadas con la actividad RNasa. En particular, las propiedades antimicrobianas aparecen en miembros con puntos isoeléctricos elevados , que explican asimismo su elevada afinidad por componentes de membrana y estabilidad. No obstante, se ha observado una baja actividad RNasa, probablemente debido a modificaciones en el alineamiento del sustrato. Se han analizado los patrones de reconocimiento y unión de sustratos nucleotídicos para caracterizar mejor las ribonucleasas citotóxicas de secreción mediante estudios estadísticos generales con complejos estructurales con mono- y dinucleótidos, realizando asimismo una comparativa con las particularidades de familias seleccionadas de endorribonucleasas representativas. Se han establecido modelos generales de interacción entre proteínas y nucleótidos y se han identificado los aminoácidos y átomos presentes en estas interacciones, definiéndose los motivos tridimensionales para los grupos fosfato, ribosa y bases nitrogenadas dentro de la superfamilia de la RNasa A. Junto a la triada catalítica, conservada en el centro activo, se ha visto una variabilidad en los subcentros secundarios, de acuerdo con los patrones de unión preferenciales de las RNasas, alineamiento y especificidad de sustrato o eficiencia catalítica variable. Estos resultados se han completado con predicciones por modelado molecular y comparaciones evolutivas por alineamiento de secuencia y solapamiento estructural. Con una comparación final con la superfamilia de la RNasa T1 (RNasas microbianas) se han analizado las características comunes y particulares para aplicarlas al reconocimiento de biomoléculas polianiónicas y configurar un punto de partida para el diseño de nuevos fármacos. Finalmente, se han estudiado, por cristalografía de rayos X, distintas RNasas recombinantes nativas (RNasa A, RNasa 3, RNasa 6), así como variantes mutantes, expresadas en un sistema procariota de alto rendimiento. Se han resuelto sus estructuras cristalinas. En particular, el estudio estructural de la ribonucleasa 6 humana (RNasa k6), el primero para el enzima, supone el punto de partida para posteriores análisis de interacciones con potenciales sustratos nucleotídicos y otros ligandos relacionados. Por otra parte, se ha cristalizado un mutante de RNasa A (RNasa A/H7H10), en complejo con 3’-CMP, cuyo centro de unión de fosfatos p2 se ha convertido en un segundo centro activo, ocasionando cambios estructurales próximos. Con un segundo complejo de RNasa A con 3’-CMP, obtenido a resolución atómica, se ha realizado un análisis comparativo más detallado, en comparación con complejos similares a menor resolución, junto con un estudio de cada subcentro en relación al complejo de RNasa A mutante, permitiendo explicar las propiedades catalíticas del mutante. La observación del estado de protonación de los residuos del centro activo ha proporcionado información adicional sobre el mecanismo de catálisis. A continuación se han cristalizado dos mutantes de la RNasa 3/ECP (ECP/H15A, H128N). Los estudios estructurales confirman los estudios cinéticos previos sobre la abolición de la actividad catalítica. Adicionalmente, dos cristales de ECP nativa se utilizaron para la comparación estructural de sendas formas cristalográficas, cadenas laterales o centros de reconocimiento de aniones. Además, con las estructuras de RNasa A, RNasa 3/ECP y RNasa 6 con iones sulfato se compararon los centros de reconocimiento del anión, análogo a los grupos fosfato de nucleótidos. Se ha confirmado la mayor afinidad de la ECP, y se han identificado las regiones potenciales de reconocimiento de nucleótidos o derivados heterosacáridos. / This thesis encompasses the structural and functional analysis of antimicrobial ribonucleases. Nucleotide-type ligand interaction sites have been analysed using RNase A as a reference protein. RNase complexes were analysed by statistical structural analysis and X-ray crystallography. Together with the catalytic triad, other secondary interaction subsites were also defined at the protein surface. The RNase A superfamily embraces ribonucleases with diverse functions not necessarily related to RNase activity. In particular, antimicrobial properties are ascribed to members with high isoelectric point values, which also explain their stability and high affinity to membrane components. However, a noticeably lower RNase activity is seen for cationic RNases owing to the lack of key residues important for the correct substrate alignment. The different nucleotide-type substrate binding and recognition patterns were deduced from an overall structure complex statistics’ analysis and compared to the particular traits of selected families of representative endoribonucleases . A large amount of mono- and dinucleotide protein complexes was analysed. The results provided a general model of protein-nucleotide interactions for cytotoxic endoribonucleases. The identification of amino acids and atoms frequently involved in the recognition interactions defined three-dimensional motifs for phosphate, ribose and bases in the RNase A superfamily. Together with the conserved catalytic triad at the active site, residue variability is commonly observed throughout the secondary binding subsites, in agreement with the RNase preferential binding patterns, the different alignment capability, substrate specificity and variable catalytic efficiency. Results were complemented with molecular modelling predictions and evolution comparisons by sequence alignment and structural overlapping. A final side-by-side comparison with the microbial RNase T1 superfamily has allowed an analysis of the common and particular features of substrate recognition processes, thereby building a general interaction architecture applicable to recognition for polyanionic biomolecules that may set a structural basis for the design of new drugs. Additionally, structural studies by X-ray crystallography were carried out. Recombinant wild-type RNases (RNase A, RNase 3, RNase 6) and mutant variants were expressed and purified in a high-yield prokaryotic system andtheir crystal structures were solved. In particular, a crystallisation condition has been discovered for human RNase 6. We report here the first crystal structure of RNase 6, which sets the basis for further analysis of interactions with nucleotide molecules and other putative ligands. On the other hand, the structural analysis of an RNase A mutant (RNase A/H7H10), where the secondary phosphate binding site p2 has been converted into a second active site, in complex with 3’-CMP, enabled the visualisation of induced neighbouring conformational changes. A second RNase A – 3’-CMP complex, obtained at atomic resolution, has enabled a more detailed comparative analysis with lower-resolution protein-nucleotide complexes together with a side-by-side study of subsite environments with the mutant complex, explaining the mutant catalytic properties. The additional visualisation of the protonation state of the active site residues has also provided information about the mechanism of catalysis. Following, two RNase 3/ECP active site mutants (ECP/H15A, ECP/H128N) were crystallised. Structural studies confirmed the conservation of the protein overall three dimensional structure together with previous kinetic experiments related to the abolished catalytic activity. Also, two native ECP crystals obtained by two distinct crystallization conditions were used for a comparison of the different unit cell packing, residue side chain variability and anion recognition sites. Finally, the structures of RNase A, RNase 3/ECP and RNase 6 with bound sulphate anions were compared, and their putative anion recognition sites characterized. The comparison of the binding subsites confirmed the higher affinity of RNase 3/ECP for sulphate/ phosphate anionsand may lead to the identification of protein regions prone to host nucleotides or heterosaccharide compounds.

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) siendo la principal causa de discapacidad en adultos jóvenes después de los traumatismos. Su prevalencia en nuestra área geográfica es aproximadamente 60-70 pacientes cada 100.000 habitantes. La causa de la enfermedad es aún desconocida y se han implicado tanto factores genéticos como ambientales. Se considera que es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario, donde linfocitos T activados en periferia son capaces de reconocer antígenos de la mielina en el SNC y desencadenar el proceso autoinmune que culminará con la destrucción de la mielina, de forma que la conducción nerviosa puede afectarse y aparecer los signos y síntomas clínicos característicos de la enfermedad. Existen evidencias de que el estrés oxidativo tiene una función importante en el desarrollo de la lesión en el SNC. En este sentido, se ha observado que el estrés oxidativo puede causar daño axonal y que el daño axonal contribuye a la discapacidad neurológica que se produce en la EM. En el SNC de pacientes con EM se ha observado expresión de marcadores de estrés oxidativo, correlacionándose con el proceso inflamatorio y desmielinizante que se produce en la enfermedad. Por otro lado, los pacientes con EM tienen disminuidos, respecto a controles sanos, los niveles séricos de diferentes antioxidantes naturales como enzimas, vitaminas, ubicuinona, etc. Las metalotioneínas (MT) son unas proteínas para las que se han descrito propiedades antioxidantes, anti-inflamatorias y neuroprotectoras en situaciones donde se produce estrés oxidativo. En este contexto, nos planteamos estudiar la función de las MT en la patogenia de la esclerosis múltiple y sus posibles implicaciones terapéuticas, para ello utilizamos el modelo animal de esclerosis múltiple, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Observamos que la expresión de MT está inducida en el SNC de ratones con EAE y que se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. Los astrocitos y los macrófagos/microglía reactivos son la principal fuente de estas proteínas. El patrón de expresión de MT diverge del patrón de expresión de marcadores relacionados con procesos de neurodegeneración y, sin embargo, coincide con el de marcadores relacionados con procesos de reparación tisular. Por otro lado, la deficiencia en MT hace más susceptibles a los ratones a desarrollar la EAE potenciando la inflamación y los procesos de neurodegeneración en el SNC, mientras que los procesos de reparación tisular están disminuidos significativamente. Estos resultados se corroboraron en la enfermedad humana, en lesiones de EM, donde se observó el mismo patrón de expresión que se había observado previamente en el modelo animal. Estos resultados sugieren que las MT tienen una función importante en la patogenia de la EAE y podrían tener un potencial terapéutico en el tratamiento de esta enfermedad, limitando los procesos de neurodegeneración y potenciando los mecanismos de reparación tisular endógenos. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the central nervous system (CNS) and the most common cause of non-traumatic neurological dysfunction in young adults. Although the etiopathogenesis of the disease is still unknown, both genetic and environmental factors have been implicated. Several lines of evidence suggest that MS is an autoimmune disease, in which activated, myelin-specific CD4+ T lymphocytes recognize CNS myelin antigens, and various mechanisms including antibodies and complement, activated macrophages and microglia, and cytotoxic T cells contribute to CNS tissue damage.There is strong evidence pointing to oxidative stress as a major factor in CNS lesion development that contributes to axonal dysfunction, CNS degeneration and neurological disability in MS. It has been shown that MS plaques contain increased levels of oxidative stress markers. Furthermore, several studies indicate that MS patients have lower serum levels of endogenous antioxidant than controls.Metallothioneins (MT) are a family of proteins with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective properties. MT accumulate under conditions where oxidative stress has taken place. In this context, we aimed to study the role of MT in the pathogenesis of MS and their putative therapeutical implications using a well established animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). We observed that MT expression was not only induced during EAE, but that it also correlated with the severity of clinical signs. Astrocytes and microglia/macrophages were the main source of these antioxidant proteins. The time course of MT expression during EAE differed from the expression of molecules that are considered relevant for neurodegenerative processes. When compared with markers for regeneration/repair, the expression profile of MT followed a similar patter. In addition, MT-deficient mice were more susceptible to EAE and showed more CNS inflammation and neurodegeneration, whereas tissue repair mechanisms appeared compromised compared to wild-type mice. These data were in agreement with the results observed in the human disease in MS lesions. Overall, these findings suggest that MT play an important protective role in the pathogenesis of EAE and might be considered as potential therapeutic candidates to promote neuroregeneration in MS.

El virus de l'Hepatitis E (VHE) és un virus que es transmet per via fecal-oral i causa hepatitis agudes. Tradicionalment les regions tropicals i subtropicals d'Àsia, Àfrica i Amèrica Central s'han considerat zones endèmiques pel VHE, on aquest és el responsable tant de brots epidèmics com de casos esporàdics d'hepatitis agudes. A regions industrialitzades, com Espanya, tradicionalment no endèmiques i lliures del virus, únicament es diagnostiquen alguns casos esporàdics d'infeccions pel VHE, associats majoritàriament a soques importades durant viatges a regions endèmiques. Malgrat els pocs casos diagnosticats, els valors de seroprevalença trobats en aquestes regions varien entre un 1 i un 5%, essent en algunes zones superiors. A més, en els últims anys s'estan identificant casos d'infeccions agudes pel VHE en àrees industrialitzades associats a soques diferents a les de regions endèmiques i que s'estan considerant soques autòctones d'aquestes regions. L'objectiu general d'aquesta tesi és l'estudi de l'epidemiologia molecular del VHE en regions industrialitzades, mitjançant la identificació de soques causants d'infeccions a la població i de possibles reservoris animals.S'analitzaren mostres d'aigua residual recollides a l'entrada d'una planta depuradora de la ciutat de Barcelona. Es detectà el genoma del virus en 24 de las 51 mostres analitzades (47,0%), 22 de les quals pertanyien al període entre desembre de 2000 i juny de 2002. S'identificaren 18 seqüències del VHE diferents. També s'analitzaren mostres d'aigua residual procedents de 4 regions considerades no endèmiques pel virus: Washington D.C. (EUA), Patras (Grècia), Umeå (Suècia) i Nancy (França), detectant-lo en 1 mostra de Washington i una de Nancy. Un estudi de diversitat va mostrar l'existència de múltiples soques del VHE infectant simultàniament la població.També s'analitzaren mostres de sèrum de pacients amb hepatitis agudes i IgG antiVHE en el moment de l'hepatitis. S'aïllà la soca causant de la infecció de 3 pacients, en un cas després d'un viatge a Etiòpia. L'estudi de marcadors d'infecció aguda pel VHE mostrà que els 3 pacients als quals se'ls hi havia detectat el genoma del virus també tenien nivells detectables d'IgM antiVHE. També s'identificaren casos amb possible diagnòstic d'hepatitis aguda pel VHE amb absència d'IgM antiVHE però amb increment dels nivells d'IgG antiVHE i disminució posterior, així com possibles coinfeccions con altres virus causants d'hepatitis.S'analitzaren mostres de sèrum i femta de porcs procedents de 3 granges comercials situades a Catalunya. A una d'elles es detectà una seroprevalença del 18,2%. Cap animal estudiat de 8 o menys setmanes havia seroconvertit en el moment de la presa de la mostra. S'aïllà la soca del VHE causant de la infecció (soca Por1) i s'observà que era molt similar a les soques identificades infectant la població de Barcelona. A les altres 2 granges no se detectaren infeccions pel VHE. Tampoc s'identificà cap soca del VHE d'origen boví a l'estudi preliminar realitzat.Finalment es va dur a terme un estudi per identificar els aminoàcids de l'epítop neutralitzant del VHE que podien ser potencialment importants per la conformació d'aquest epítop. S'estudià el comportament d'anticossos contra l'epítop neutralitzant de la soca Sar55 (genotip 1) davant la Mex14 (genotip 2) i pèptids mutats de Sar55 que contenien aa presents a Mex14. No s'observaren diferències en el reconeixement per part dels anticossos, confirmant l'existència d'epítops comuns a ambdues soques. / The overall aim of this thesis is the study of the molecular epidemiology of the Hepatitis E virus (HEV) in industrialized countries, traditionally considered non-endemic for this virus. HEV is an important cause of sporadic and epidemic cases of acute hepatitis in endemic areas. In non-endemic regions sporadic cases are often associated to HEV strains imported from endemic areas, although autochthonous strains have also been isolated in industrialized countries, where the seroprevalence values vary from 1 to 5% or higher. Urban sewage samples from Barcelona (Spain), Washington D.C. (USA), Patras (Greece), Umeå (Sweden) and Nancy (France) were processed and tested by nested RT-PCR. HEV was detected in Barcelona (47.0% positives samples, with more than 18 different strains detected), Washington D.C. (20% positives samples) and Nancy (25% positive samples). A high diversity of strains was detected infecting simultaneously the population. The strains identified in these industrialized areas belonged mainly to genotype 3.Cases of acute hepatitis E were also detected in humans living in the area of Barcelona and caused by imported and autochthonous strains. The RNA of the virus was detected in patients with detectable levels of IgM antiHEV, although presumptive infections with only an increase and further decrease of the levels of IgG antiHEV were also identified.Moreover, HEV was detected in a swine herd located in the area of Barcelona, where the seropositive animals were older than 8 weeks. The strain infecting the animals belonged to genotype 3 and was very similar to the human HEV strains detected in humans and sewage in the same area. Finally an attempt to identify amino acids critical for the correct conformation of the neutralization epitope present in the capsid of the HEV was performed. Antibodies against Sar55 (genotype 1) were tested against Mex14 (genotype 2) and mutated peptides with the sequence of the neutralization epitope of Sar55 and some amino acids from Mex14. No differences were observed, confirming the existence of a common neutralization epitope in HEV strains from different genotypes.

L’arsènic és un element que es troba en el medi sota diverses formes químiques, cadascuna de les quals presenta una toxicitat i una reactivitat diferent. A l’aigua de mar, l’arsènic és present en concentracions baixes (0,001 mg As kg-1). Per altra banda, les algues tenen una concentració total d’arsènic molt superior (1-350 mg As kg-1). Tot i així, la fórmula química en aquest cas és predominantment la organo-metàl.lica, sobretot, com a arseno-sucres. Pel que fa a la tesi, la primera part de l’estudi experimental n’estudia la metodologia. S’han comparat diversos tipus de tractament previ de la mostra, s’han desenvolupat mètodes cromatogràfics i s’han preparat materials de referència per al control de qualitat. A la segona part, s’han analitzat mostres originàries de zones que no havien estat estudiades fins ara, com el golf Termaïc i Santorini (Grècia), la Terra del Foc (Argentina) i el Carib panameny. A més, s’ha comparat l’especiació d’arsènic dins d’estructures morfològiques d’algues brunes i com afecta el seu embarracat a la platja. També s’ha realitzat un estudi amb mostres d’aigua continental a Xile. La conca del Loa es troba en una regió minera amb uns nivells ambientals d’arsènic alts. En aquest estudi s’han trobat algues hiperacumuladores, les quals es podrien usar en estudis futurs de bioremediació. En el decurs de la tesi s’ha treballat en col.laboració amb les universitats següents: Universidad Católica del Norte (Xile), Universitat de Bremen (Alemanya), Universitat de Creta (Grècia), Universitat Aristotèlica de Salònica (Grècia). També s’ha comptat amb la col.laboració del Departament de Biologia Vegetal de la Universitat de Barcelona (UB). / Arsenic in the marine ecosystem may derive from natural sources or anthropogenic activities. Inorganic arsenic predominates in seawater. In living organisms, organoarsenic compounds were detected years ago. Marine algae contain most of their arsenic in the form of arsenosugars. In recent decades, a number of studies have described the mechanisms of the transformation and accumulation of arsenicals as well as correlations among arsenosugars and algal orders. Furthermore, there have been several reports of the potentially toxic character of such organoarsenic compounds. The presence and behaviour of arsenic compounds in algae is of interest not only to assess the pollution level in a particular zone, but to evaluate the health risk posed by the consumption of seaweed. The first part of the project was focused on the analytical procedures regarding arsenic speciation. Firstly, the effect of pre-treatments in samples and the storage condition were studied. The second study was the adaptation of our chromatographically method in order to use MSD-TOF as an analyser. The third lane followed was the preparation of reference materials. Individual solutions for each arsenosugar were prepared from algal extracts and a feasibility study was conducted on a Reference Material prepared from the alga wakame for arsenic species. The second part consisted of a series of studies in unstudied geographical zones such as Thermaikos Gulf (Greece), Santorini (Greece), Tierra del Fuego (Argentina) and Panama’s Caribbean Rivera. In addition, freshwater algae and plants from Atacama Desert in Chile were analysed. We had also compared the speciation of arsenic in different structural parts and in algae that were collected on the coast. For these studies we collaborated with the following universities: Universidad Católica del Norte, Universität Bremen, University of Creta and the Aristotle University of Thessaloniki. We had also worked with the Department of Plant Biology of the University of Barcelona.