La histona H1 es la responsable de la condensación de la cromatina en la fibra de 30 nm. Se ha descrito que la H1 tiene preferencia por el DNA tipo SAR. Hemos mostrado que los subtipos H1a-e, H1º y H1t individualmente muestran preferencia por las SAR. La H1 está compuesta por 3 dominios: N-terminal, globular y C-terminal. El análisis independiente de los dominios mostró que el C-terminal determina la preferencia por las SAR de la H1. Las protaminas, relacionadas evolutivamente con la histona H1 y muy ricas en arginina también tienen preferencia por las SAR. La unión preferencial a las SAR del C-terminal y la protamina se pierde en presencia de distamicina, lo que indica que la interacción involucra el surco menor del DNA. La preferencia por las SAR está determinada por los bloques AT homopoliméricos. El dominio C-terminal de las histonas H1º (C-H1º) y H1t (C-H1t) se encuentra desestructurado en disolución acuosa, pero en presencia de DNA y 140 mM de NaCl se estructura completamente. La estructura secundaria obtenida está caracterizada por la presencia de hélice α, estructura β, giros y lazos abiertos. El TFE también induce estructura secundaria en los dominios C-terminales con características similares a las encontradas en los complejos con DNA. La estructura de los dominios C-terminales unidos al DNA es extremadamente estable. La desnaturalización de los dominios C-terminales unidos a DNA es cooperativa. El acoplamiento entre la unión al DNA y la inducción de estructura secundaria en el C-terminal permite incluir este dominio en el grupo de las proteínas intrínsecamente desordenadas que funcionan mediante el reconocimiento molecular.Las elevadas concentraciones de solutos macromoleculares en el interior de la célula hacen que una fracción importante del volumen intracelular no esté disponible. Los dominios C-H1º y C-H1t se estructuran en presencia de Ficoll 70 (30%) y el PEG 6000 (30%) por efectos del volumen excluido. La estructura secundaria inducida es similar a la encontrada en el C-terminal unido a DNA. Los resultados de SAXS indican que la compactación del C-terminal en presencia de aglomerantes macromoleculares es propia de un estado globular. La compactación va acompañada de la aparición de un núcleo hidrófobico. Sin embargo, el dominio C-terminal no está estructurado cooperativamente en presencia de agentes aglomerantes. Estas características indican que el C-terminal en presencia de agentes aglomerantes se encuentra en un estado de glóbulo fundido. La formación del glóbulo fundido en la célula aceleraría el paso al estado nativo o unido al DNA y facilitaría la difusión y el intercambio de la H1 en la cromatina.La histona H1 es fosforilada por las quinasas dependientes de ciclinas (CDKs). Esta fosforilación es dependiente del ciclo celular con el máximo de fosfatos en la metafase de la mitosis. La mayoría de las dianas de las CDKs se encuentran en el dominio C-terminal. La fosforilación de los tres motivos TPXK del C-H1º induce un cambio estructural caracterizado por la disminución de la proporción de hélice α y un aumento de la estructura β. La magnitud del cambio depende de la relación proteína/DNA. A relaciones cercanas a la saturación la conformación de la proteína es del tipo todo-β. La fosforilación de uno o dos de los tres sitios TPXK presentes en el C-H1º tiene efectos estructurales específicos. La fosforilación en T118 es la que afecta más profundamente la estructura con una disminución importante de la hélice α, acompañada de la aparición de un porcentaje significativo de ovillo estadístico. La neutralización de la carga positiva de las lisinas por los grupos fosfato del DNA puede ser una de las causas principales de la estructuración del dominio C-terminal en los complejos con el DNA. A pH alcalino se induce estructuración en el C-H1º no fosforilado y trifosforilado, la cual refleja los cambios dependientes de fosforilación encontrados en los complejos con DNA. / H1 linker histones are thought to be primarily responsible for the condensation of the 30 nm chromatin fibre. Histone H1 preferentially binds to scaffold-associated regions (SARs). Here we show that the mammalian somatic subtypes H1a,b,c,d,e and H1_ and themale germline-specific subtype H1t, all preferentially bind to SARs. Experiments with the isolated domains show that whilst the C-terminal domain maintains strong and preferential binding, the N-terminal and globular domains show weak binding and poor specificity for the SAR. The preferential binding of SAR by the H1 molecule thus appears to be determined by its highly basic C-terminal domain. Salmine, a typical fish protamine, which could have its evolutionary origin in histone H1, also shows preferential binding to the SAR. The interaction of distamycin, a minor groove binder with high affinity for homopolymeric oligo(dA).oligo(dT) tracts, abolishes preferential binding of the C-terminal domain of histone H1 and protamine to the SAR, suggesting the involvement of the DNA minor groove in the interaction.The carboxyl-terminal domain of linker histone H1 subtypes H1º (C-H1º) and H1t (C-H1t) has little structure in aqueous solution but becomes extensively folded upon interaction with DNA. The secondary structure elements present in the bound carboxylterminal domain include α-helix, β-structure, turns, and open loops. The addition of TFE also induces secondary structure in the C-terminal domain that is very similar to the structure of the DNA bound. Examination of the changes in the amide I components in the 20-80 °C temperature interval showed that the secondary structure of the DNA-bound C-H1t is for the most part extremely stable. The H1 carboxyl-terminal domain appears to belong to the so-called disordered proteins, undergoing coupled binding and folding.In the cellular environment macromolecules and small molecule solutes are present at high concentrations so that a significant fraction of the intracellular space is not available to other macromolecules.The C-terminal domains C-H1º and C-H1t are significantly structured in the presence of Ficoll 70 (30%) and PEG (30%) The proportions of secondary structure motifs were comparable to those of the DNA-bound domain. The small-angle X-ray scattering showed that in crowding agents the C-terminus had the compaction of a globular state. Progressive dissipation of the secondary structure and a lineal increase in partial heat capacity (Cp) with temperature together with increased binding of ANS indicated that the C-terminus is not cooperatively folded in crowded conditions. These results indicate that the C-terminus in crowding agents is in a molten globule state. Folding of the C-terminus in crowded conditions may increase the rate of the transition toward the DNA bound state and facilitate H1 diffusion inside cell nuclei.Histone H1 is phosphorylated in a cell cycle-dependent manner by cyclin-dependent kinases (CDKs). The highest number of phosphorylated sites is found in mitosis. The majority of the phosphorylation sites for CDKs are located on the C-terminal domain. Complete phosphorylation of C-H1º is associated to a major structural change. This structural rearrengement implies the loss of almost all the α-helix and a large increase in β-structure. The extent of the conformational change appears to be dependent on triphosphorylation and the protein/DNA ratio. The final state of the structural change consists in an all-β protein at ratios near saturation. Phosphorylation of one or two site have distintic structural effects. Phosphorylation of T118 affects the secondary structure the most, with a decrease of the α-helix and the appearence of random coil.Charge neutralization provided by DNA phosphate groups is an important factor in the folding of the C-terminal domain of histone H1 when bound to DNA. Alkaline pH induces secondary structure in C-H1º unphosphorylated and triphosphorylated that reflects the structural changes associated to phosphorylation.

El càncer es un conjunt de més de 100 malalties que es caracteritzen per l'acumulació de múltiples alteracions genètiques. Nosaltres ens hem centrat en l'estudi de tres tipus de tumors sòlids epitelials: tumors esporàdics de bufeta, tumors hereditaris o familiars de càncer colorectal i de càncer ronyó.Per aquests estudis la tècnica més àmpliament utilitzada ha estat la Hibridació Genòmica Comparada (CGH), que permet fer un anàlisi global del genoma tumoral, i dona informació sobre quins desequilibris es produeixen més freqüentment, indicant quines regions serien susceptibles de contenir gens supressors de tumors o oncògens; a més també permet portar a terme estudis de clonalitat i detectar patrons d'evolució cromosòmica.Pel que fa als tumors de bufeta, vàrem observar que el dany genòmic augmenta a mida que augmenta l'estadi i grau tumoral, sent els desequilibris més freqüents, les pèrdues de 9q,9p,5q,8p i els guanys de 1q, Xq,17q,8q i 20q. Hi ha però una sèrie d'alteracions que presenten diferencies significatives entre els diferents estadis, entre pTa i pT1 són les pèrdues de 5q, 9p, 9q, 10q, 8p, 11q, 18q i els guanys de 8q,10p. Mentre que entre pT1 i pT2-T4, són els guanys a 5p,7p,3p,10p i pèrdua de 6q.Un elevat nombre dels tumors estudiats eren tumors superficials o mínimament infiltrants, els quals els vàrem classificar en base als patrons de desequilibris genòmics observats, de manera que es va posar de manifest l'existència de tres subgrups: el primer caracteritzat per la predominança de guanys, essent 1q,1p,17q,19p els més freqüents, el segon caracteritzat per pèrdues afectant principalment a 9q,9p,11q,8p,5q,11p, i un tercer grup caracteritzat per la presència d'un nombre baix de desequilibris. El fet de trobar dos subgrups amb cariotips complexes podria suggerir que l'evolució d'aquests tumors es produiria com a mínim per dues vies una caracteritzada per guanys i l'altre per pèrdues. Per altra banda, el 30% dels tumors urotelials presenten multifocalitat, fet que converteix aquests tumors en un model excepcional per l'anàlisi de les diferents relacions entre tumors esporàdics sincrònics. L'estudi d'aquests tumors sincrònics d'un mateix pacient ens va confirma el seu origen monoclonal i ens va permet traçar vies d'evolució a partir d'un únic tumor original.Pel que fa a l'estudi de tumors sincrònics familiars, vàrem fer dos estudis, un amb tumors de pacients afectats de Càncer Renal Papil·lar Hereditari (HPRC), i un altre amb tumors de pacients afectats de Poliposi Adenomatosa Familiar (FAP); l'estudi d'aquests tumors proporciona un model natural excel·lent per estudiar les alteracions presents en estadis primerencs de la evolució tumoral i proporcionar alhora important informació sobre el dinamisme de formació de les alteracions en aquests tumors.Pel que fa a l'estudi de HPRC es va observar la presència d'alteracions cromosòmiques estructurals idèntiques en diferents tumors d'un mateix pacient fet que suggereix un origen embrionari comú, o que la predisposició genètica pot condicionar l'adquisició d'alteracions a regions cromosòmiques específiques. També es va estudiar el comportament de MET (els pacients que pateixen aquesta malaltia presenten la mutació d'aquest proto-oncogen en la línia germinal, fet que predisposa a HPRC); vàrem observar que la duplicació del gen MET portador de la mutació germinal va associada a la trisomia 7. En aquells tumors amb tetrasomia 7 s'observava la duplicació tant de l'al·lel normal com del mutat.Pel que fa a l'estudi de patrons d'evolució en càncer colorectal a partir de l'anàlisi dels desequilibris presents en adenomes i carcinomes procedents de tumors de pacients afectes de FAP; vàrem observar que els diferents adenomes d'un mateix pacient mostren una clara relació genètica indicant un patró comú d'evolució. Aquest fet suggereix, de nou, que la predisposició genètica pot condicionar l'addquisició d'alteracions genòmiques en subregions cromosòmiques específiques. / Under the concept of cancer there is a group of more than a hundred illness that are caracterized by the accumulation of multiple genetic alterations. We have focused our study in three different kinds of epithelial solid tumours: sporadic bladder tumours, hereditary or familial colorectal cancer and kidney cancer. In order to analyze these tumours, we applied the Comparative Genomic Hybridization (CGH) technique. The global analysis of the tumoral genome allowed by this technique provides information about the frequency of unbalances, the regions where these unbalances are located and about which of these regions could be more susceptible to contain tumour supressor genes or oncogenes. Moreover, this technique also allows us to perform clonality studies and to detect different patterns of chromosomal evolution.In the bladder tumours, we observed that the genomic damage increases with the tumoral stage and grade. The unbalances that were more frequently found were the losses of 9q, 9p, 5q, 8p and the gains of 1q, Xq, 17q, 8q and 20q. However, there is a group of abnormalities that present significant differences among the different tumoral stages. Between pTa and pT1, are the losses of 5q, 9p, 9q, 10q, 8p, 11q, 18q and the gains of 8q and 10p. Between pT1 and pT2-4, are the gains of 5p, 7p, 3p, 10p and the loss of 6q.The classification of the superficial or minimally invasive tumours according to their observed patterns of genomic unbalances allowed us to subclassify them in three different subgroups. The first subgroup was characterized for the predominance in gains, being +1q, +1p, +17q and +19p the most frequents. The second subgroup was characterized for the losses of 9q, 9p, 11q, 8p, 5q, 11p and the third subgroup was characterized for a low number of unbalances. The fact of finding two subgroups with complex karyotypes could suggest that these tumours could have evolved from two different pathways, one characterized for gains and the other for losses.On the other hand, 30% of the bladder tumours present multiplex damages, and this fact makes these tumours an excellent model for the analysis of the different relations between sincronous sporadic tumours. The study of sincronic tumours from the same patient confirmed their monoclonal origin and allowed us to design the evolutive pathway from a single original tumour.We performed two analysis, one in tumours of patients affected of Hereditary Papilary Renal Cancer (HPRC) and one in tumours of patiens affected of Familiar Adenomatose Poliposi (FAP). These kind of tumours provides an excellent natural model to study the chromosomal aberrations in primary stages of tumoral evolution. In addition, they provide important information about the dynamics of formation of these aberrations in the tumours.Identic structural chromosomal aberrations were found in different tumours of the same patient affected of HPRC. This fact suggest either a common embrionary origin or conditioned adquisition of alterations in specific chromosomal regions due to the genetic predisposition. The behaviour of the MET gen was also studied in these patients. The duplication of the MET gen was found to be associated with the trisomy of chromsome 7. In those tumours with tetrasomy of chromosome 7, both normal and mutated alleles were found to be duplicated.The analysis of unbalances present in adenomes and carcinomes from patients affected of FAP allowed the establishment of evolution patterns of colorectal cancers. We observed that the different adenomes from a same patient affected of FAP display a strong genetic relation, which indicates a common evolution pattern. Again, this fact suggest that the genetic predispostion may direct the adquisition of genomic alterations in specific chromosomal subregions.

La creciente complejidad de los dispositivos electrónicos portátiles demanda fuentes de energía que cumplan con los requerimientos de entregar una alta densidad de potencia en un tamaño reducido y en muchos casos la posibilidad de lograr una completa integración. En este sentido, un intenso trabajo de investigación se ha enfocado hacia la miniaturización de las fuentes de alimentación en una amplia variedad de tecnologías. Una tendencia similar se ha seguido en el campo de los sistemas micro electromecánicos (MEMS), donde el concepto de sistema inteligente o Smart System ha impulsado el desarrollo de una nueva generación de dispositivos de alimentación, tales como baterías, pilas de combustible o generadores de energía, que en conjunto se conocen como powerMEMS. Entre los diferentes sistemas de generación de energía, las micro pilas de combustible han recibido una especial atención debido a sus particulares características, como son la alta densidad de energía, emisiones no-tóxicas y la posibilidad de eliminar partes móviles simplificando el proceso de fabricación y reduciendo la probabilidad de fallo. Las pilas de combustible de electrolito polimérico (PEMFC) son particularmente atractivas debido a su capacidad de trabajar a temperatura ambiente usando hidrógeno o combustibles líquidos. La posibilidad de funcionar con combustibles líquidos, tales como metanol o compuestos orgánicos, representa una ventaja importante para las aplicaciones portátiles debido a la simplicidad de almacenamiento y manipulación del combustible. En esta tesis se presentan los primeros desarrollos y contribuciones tecnológicas al campo de micro pilas de combustible llevados a cabo en el IMB-CNM (CSIC). En particular, este trabajo está dedicado al estudio de pilas de combustible microfabricadas como fuentes de energía para microsistemas. Esta tesis se compone de siete capítulos: el capítulo de introducción y seis capítulos experimentales divididos en tres secciones. La primera sección describe el desarrollo de una micro pila de combustible de metanol directo utilizando un enfoque híbrido, el cual fue utilizado para identificar y medir los efectos que más influyen en el rendimiento del dispositivo en la microescala. La segunda sección presenta las estrategias realizadas respecto a la integración de todos los componentes de la micro pila hacia un dispositivo más compacto utilizando tecnologías de microfabricación compatibles. Estos métodos incluyeron el uso de diferentes técnicas de microestructuración de polímeros como una manera de optimizar las dimensiones del dispositivo, así como la reducción de costes de los materiales y producción. Por último, la tercera sección presenta dos aplicaciones específicas de las micro pilas de combustible desarrolladas, una bio pila de combustible microfabricada utilizando microorganismos como biocatalizadores de compuestos orgánicos y una plataforma microfluídica alimentada por una micro pila de combustible que puede ser de gran interés para aplicaciones Lab-on-a-Chip o micro Total Analysis Systems (µTAS). / The increasing complexity of portable electronic devices demands energy sources that meet the requirement of delivering a high power density within a reduced size, and in many cases the possibility of achieving complete integration. In this sense, an intense research effort has been focused towards the miniaturization of powering devices in a wide variety of technologies. A similar trend has been followed in the micro electromechanical systems (MEMS) technology field, where the smart-system concept has impelled the development of a new generation of powering devices, such as batteries, fuel cells or energy harvesters, which altogether are known as powerMEMS. Among the different energy generation systems, micro fuel cells have received special attention due to their particular features, i.e. high energy density, non-toxic emissions and the possibility of avoiding movable parts simplifying the fabrication process and reducing the risk of failure. Polymer electrolyte membrane fuel cells (PEMFCs) are particularly attractive due to their capability of working at room temperature using both hydrogen and liquid fuels. The possibility to operate using liquid fuels, such as methanol or organic compounds, represent an important advantage for portable applications due to the great simplification of fuel storage and handling processes. This thesis presents the first developments and technological contributions to the micro fuel cell field performed at IMB-CNM (CSIC). Particularly, this work is dedicated to the design and fabrication of microfabricated fuel cells as power sources to be integrated within the microsystems to be powered. The work is organized in seven chapters: one introductory chapter and six experimental chapters that have been divided in three sections. The first section describes the development of a micro direct methanol fuel cell using a hybrid approach, which was used to identify and measure the effects that influence the most on the device performance at a microscale. The second section presents different strategies regarding the integration of all micro fuel cell components into a more compact device by taking advantage of microfabrication compatible technologies. These approaches involved the use of different polymer micropatterning techniques as a way to optimize the device dimensions and reduce materials and production cost. Finally, the third section presents two particular applications of the developed micro fuel cells, a microfabricated bio fuel cell using microorganisms as biocatalysts of organic compounds and a fuel cell powered microfluidic platform that can be of great interest for Lab-on-a-Chip or micro Total Analysis Systems (µTAS).

Els diferents subtipus de la histona H1 tenen un paper molt important en la condensació de la cromatina i en la regulació gènica. En mamífers s’han identificat sis subtipus somàtics, H1a-e, dos subtipus específics de línies germinals, H1t i H1oo i dos subtipus associats a diferenciació H10 i H1x. L’H1 està formada per tres dominis, un domini globular flanquejat per un domini amino-terminal i un domini carboxi-terminal. Es va caracteritzar l’efecte de la fosforilació sobre la interacció amb el DNA del domini C-terminal de l’H10. El domini fosforilat continua mantenint la preferència d’unió per les seqüències SAR i la cooperativitat d’unió a DNA. Es va analitzar per dicroisme circular el domini i les seves espècies fosforilades amb diferents fragments de DNA. Les espècies fosforilades són capaces d’induir un espectre ψ més intens que el domini no fosforilat, mostrant una major capacitat d’agregació ordenada del DNA. Experiments de competició varen determinar que l’afinitat relativa pel DNA en fosforilar-se el domini disminueix aproximadament en un factor de 3. Es va estudiar l’estructura secundària del domini C-terminal de l’ H1e i de l’H1e sencera per espectroscòpia d’infraroig de transformada de Fourier (FTIR). La fosforilació de l’H1e provoca un canvi estructural en la proteïna: la disminució d’hèlix α i l’augment de fulla β. El grau d’estructuració secundària depèn de la posició i del nombre de fosfats. La fosforilació de la histona H1e té efectes diferencials sobre les afinitats relatives pel DNA i la capacitat d’agregació del DNA de les seves espècies fosforilades. Les espècies amb més grau de fosforilació mostren una menor afinitat pel DNA però també una major capacitat d’agregació d’aquest. A la vegada, aquestes mateixes espècies són les que contenen més estructuració en forma de fulla β, fet que afavoriria la formació d’agregats DNA-proteïna. / Linker histone H1 plays an important role in chromatin folding and genic regulation. In mammals has been identified 6 somatic subtypes, H1a-e, 2 germline-specific subtypes, H1t i H1oo and 2 subtypes related to diferenciation, H10 i H1x. H1 linker histones present a tripartite structure consisting of a central globular domain flanked by N- and C-terminal tail-like domains. We characterize the effect of phosphorylation of C-terminal domain of H10 upon the interaction with DNA. The phosphorilated domain maintains the preferential binding to SAR sequences and the cooperative binding to DNA. We analyze by circular dicroism the domain and its phosphorilated species with different DNA fragments. The phosphorilated species induces an intense ψ spectrum than the non-phosphorilated domain, showing a higher organized aggregation capacity of the DNA. Competition experiments determined that relative affinity for DNA when the domain is phosphorilated decrease approximately 3-fold. We studied the effects of phosphorylation on the secondary structure of H1e and its carboxy-terminal domain by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). Phosphorilation of H1e leads to a structural change in the protein: a decrease of α-helix and an increase of β-sheet. The secondary structuration grade depends both of position and number of phosphate groups. Histone H1e phosphorylation has different effects in its phosphorilated species upon relativity affinities for DNA and aggregation capacity of DNA. The species with more grade of phosphorilation shows less affinity for DNA but more aggregation capacity of DNA. Furthermore, these same species are which contains a more β-sheet structure, favoring the formation of DNA-protein aggregates.

Les histones linker juguen un paper important en l’organització i manteniment de la cromatina en estructures d'ordre superior i en la regulació transcripcional. La histona H1 en vertebrats té una estructura característica en tres dominis: un domini N-terminal curt i flexible; un domini globular central; i un domini C-terminal llarg. Els dominis N- i C-terminals (CTD) són molt bàsics i es troben desestructurats en solució aquosa. La distribució de càrrega és bastant uniforme al llarg de tot el CTD. La interacció amb el DNA indueix un plegament total i estable del CTD en condicions fisiològiques, fet que permet classificar aquest domini en el grup de les proteïnes intrínsecament desordenades, on el plegament i la unió al lligand estan acoblades. La fosforilació post-traduccional del CTD de la H1 té efectes en l’estructura secundària de la proteïna i en la condensació del DNA. L’estructura secundària de la H10 sencera es va analitzar per espectroscòpia d’infrarroig. La H10, igual que el CTD aïllat, també es plegà degut a la interacció amb el DNA i l’estructura secundària també va ser modulada per fosforilació. El canvi estructural induït per la fosforilació va consistir en un increment de la quantitat d’estructura β, que va esdevenir més significant amb la unió a DNA, on també es va observar una dependència d’aquest increment amb la relació proteïna/DNA. En aquest cas, la proporció d’estructura β va arribar al 54%, suggerint que el CTD en la proteïna sencera presentava una conformació tot-β. Simultàniament, es va observar una reducció significant de l’estructura en hèlix-α, fet que va suggerir una disminució d’aquest element estructural en el domini globular, probablement per la propagació de l’estructura β des del CTD cap a la resta de la proteïna. En presència de SDS, la H10 es va plegar amb percentatges d’estructura secundària similars als observats en la unió al DNA. A una relació molar SDS/proteïna 14:1, la H10 trifosforilada presentava un 55% d’estructura β, indicant que el CTD en la histona H10 també es trobava en una conformació tot-β i formava fibres amiloides. Els nuclis d’eritròcit de pollastre contenen cromatina inerta i altament compacta consistent, principalment, en DNA i proteïnes histona. En aquest estudi, es va emprar aquesta cromatina per analitzar les modificacions post-traduccionals de les histones i l’efecte de la fosforilació per CDK2 en l’agregació de la cromatina. Els nuclis es van digerir amb nucleasa micrococcal i la cromatina es va fraccionar per centrifugació en tampó de baixa força iònica en fraccions soluble i insoluble. Les modificacions post-traduccionals (PTMs) de les histones linker purificades d’ambdues fraccions es van analitzar per Tandem MS. Els sis subtipus d’histona H1 i la histona H5 van ser identificats. En aquest estudi, es van trobar vuit PTMs novells: dues a la histona H5 i sis en els subtipus d’ H1. Algunes de les modificacions van ser identificades específicament en una de les fraccions, suggerint una distribució diferencial d’algunes PTMs en la cromatina. La comparació de les PTMs novells identificades amb altres prèviament descrites en altres espècies va demostrar que la majoria d’elles estan conservades en l’evolució. Atès que les histones linker desenvolupen la seva funció en la cromatina, es va fosforilar ex vivo amb CDK2 els motius S/T-P-X-Z de les histones linker presents en la cromatina d’eritròcit de pollastre; amb l’objectiu d’estudiar l’efecte de la fosforilació en l’agregació de la cromatina. L’anàlisi proteòmic per HPCE i MALDTOF-MS va mostrar que el nombre de grups fosfat va augmentar amb el temps de fosforilació, assolint un 54% d’espècies fosforilades (mono- i di-fosforilades) en el cas de la H5 després de la fosforilació overnight. Experiments de Tandem MS van revelar que, en cap de les histones purificades de la cromatina nativa, cap dels motius S/T-P-X-Z estava fosforilat, indicant que la fosforilació detectada en les mostres tractades amb CDK2 havien estat modificats ex vivo. En H5, nomes S148 va identificar-se en totes les mostres i es trobava fosforilat després d’1 hora. En l’anàlisi per TandemMS de les H1, tots els motius consens de CDK2, excepte S171 (posició en H1.01), es van identificar en els subtipus H1.03, H1.1L i H1.1R. H1.03T16 es va trobar fosforilat després de 15 minuts; H1.1LS192 I H1.1RS186 després d’1 hora; H1.03S155, H1.1LS155 i H1.1RS153 després de 3 hores. Un cop la fosforilació ex vivo de les histones en la cromatina es va comprovar, es va procedir a estudiar l’efecte de la fosforilació en l’agregació de la cromatina induïda per MgCl2 (1.6mM) per Dynamic Light Scattering (DLS). El resultat més significant associat a la fosforilació va ser la disminució del diàmetre hidrodinàmic de les molècules agregades. Aquestes diferències van esdevenir més important amb l’augment del temps de fosforilació i amb la mida dels fragments de cromatina. Els resultats obtinguts van demostrar que la fosforilació de les histones linker impedia l’agregació de la cromatina. / Linker histones play an important role in establishing and maintaining chromatin higher-order structure and in transcriptional regulation. Histone H1 in vertebrates has a characteristic three-domain structure consisting of a short flexible N-terminal domain, a central globular domain and a long C-terminal domain. The amino- and carboxyl-terminal (CTD) domains are highly basic and mainly unstructured in aqueous solution. The charge distribution is quite uniform along the CTD. Because of that, chromatin condensation is mediated through charge-neutralization of the negatively charged linker DNA, facilitating chromatin condensation into the 30nm fibre and also intermolecular aggregation. Interaction with DNA induces the complete folding of the CTD under physiological conditions in a very stable manner, which allows to classify this domain as an intrinsically disordered protein, with coupled binding and folding. Post-translational phosphorylation of the CTD of H1 has effects on secondary structure and DNA condensation. Secondary structure of the entire H10 was analysed by infrared spectroscopy. H10, as the isolated CTD, also folded upon DNA interaction and the secondary structure was modulated by phosphorylation. The structural change following phosphorylation was characterized by an increase in the amount of β‐structure that was more significant when bound to DNA and was dependant on the protein/DNA ratio. The proportion of β‐structure reached 54 % suggesting that the CTD was in an all‐β conformation in the entire protein. Concomitant with the increase in β‐structure, there was a remarkable decrease of α‐helix that suggested the loss of some of the α‐helix in the globular domain; probably associated to the propagation of the β‐structure from the CTD towards the rest of the protein. In the presence of SDS, H10 folded with percentages of secondary structure motifs similar to those found when bound to DNA. At a molar ratio 14:1 (SDS/protein) the triphosphorylated protein had 55% of β‐structure indicating that the CTD within histone H10 was also in an all‐β conformation and formed amyloid fibres. Mature chicken erythrocyte nuclei contain highly condensed and inert chromatin, mainly consisting of DNA and histone proteins. Chicken erythrocyte chromatin was used to analyse linker histones post-translational modifications and the effect of phosphorylation by CDK2 on chromatin aggregation. The nuclei were digested with micrococcal nuclease and fractionated by centrifugation in low-salt buffer into soluble and insoluble fractions. Post-translational modifications (PTMs) of the purified linker histones of both fractions were analyzed by Tandem MS. All six histone H1 subtypes (H1.01, H1.02, H1.03, H1.10, H1.1L and H1.1R) and histone H5 were identified. In our study, we identified eight novel post-translational modifications: two were identified in histone H5 and six in histone H1 subtypes. Some of the identified modifications were specific of one chromatin fraction suggesting the differential distribution of some PTMs within chromatin. Comparison of the PTMs found with other previously reported for other species showed that most of them are conserved through evolution. Since histone H1 develops its function within chromatin; chicken erythrocyte chromatin was phosphorylated ex vivo with CDK2 in the S/T-P-X-Z motifs present in linker histones in order to study the effects of ex vivo phosphorylation of linker histones on chromatin aggregation. Proteomic analyses by HPCE and MALDITOF-MS showed that the the number of phosphate groups increased with the time of phosphorylation, reaching, in the case of H5, 54% of phosphorylated species (mono and diphosphorylated) after overnight phosphorylation. Tandem MS after proteolytic digestion revealed that in all linker histones the S/T-PX-Z motifs were unphosphorylated in native chromatin indicating that the phosphorylated peptides found at other times of reaction were modified ex vivo. In H5, only S148 was identified in all samples and was phosphorylated after 1 hour. In the Tandem MS analysis of histone H1 subtypes, all the CDK2 consensus sequences, except S171(H1.1R numbering) were identified for H1.03, H1.1L and H1.1R. H1.03T16 was found phosphorylated after 15 minutes; H1.1LS192 and H1.1RS186 after 1 hour; H1.03S155, H1.1LS155 and H1.1RS153 after3 hours. Once ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was confirmed, the effect of linker histones ex vivo phosphorylation on chromatin aggregation induced by MgCl2 (1.6 mM) was analysed by Dynamic Light Scattering (DLS). The most remarkable result associated to ex vivo phosphorylation of linker histones within chromatin was a decrease in the hydrodynamic diameter of the aggregated molecules. The differences became greater with the increase of phosphorylation time and with the size of the chromatin fragments. These results indicated that linker histones phosphorylation impaired chromatin aggregation.

Este proyecto de tesis se ha focalizado en determinar con precisión, en células de Saccharomyces cerevisiae, la diferencia de enlace del ADN estabilizada por nucleosomas canónicos in vivo, así como la contribución topológica del centrómero y de diferentes promotores génicos sensibles a topoisomerasa II. Para ello, tanto la secuencia TRP1ARS1 como derivados de esta, se han introducido en diferentes cepas de S. cerevisiae: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (Δtop1 TOP2 TOP3), se han extraído en forma de cromatina y se han analizado mediante técnicas electroforéticas para determinar su topología in vivo. Gracias al pequeño tamaño de estos anillos de ADN (nunca superior a 2kb), las distribuciones de topoisomeros generadas han permitido identificar cualquier modificación en la estructura de la cromatina. Topología región TRP1ARS1: La secuencia de 1453 pb de la región TRP1ARS1 (TA1) se ha ciclado y usado para la transformación de las diferentes cepas de S. cerevisiae. Un análisis topológico de los nucleosomas ensamblados en esta región ha determinado una diferencia de enlace (ΔLk), respecto al anillo relajado, de -9.6 unidades. Este valor indica una estabilización de -1.37 unidades por nucleosoma, contrastando con el valor generalmente aceptado de -1 unidad por nucleosoma conocido como “linking number paradox”. Centrómero: El centrómero puntual de S. cerevisiae se caracteriza por: una secuencia de entre 111 y 120bp con tres elementos diferenciados (CDEI, CDEII y CDEIII) y por un hemisoma (H2A+H2B+cenH3+H4) con la histona H3 modificada (CenH3). Sobre las secuencias CDEI y CDEIII se unen dos complejos proteicos, Cbf1 y CBF3 respectivamente, capaces de doblar el ADN in vitro. Durante esta tesis se ha estudiado la topología del centrómero del cromosoma 4 de S. cerevisiae (CEN4), clonado en el anillo TA1, observando que produce una ganancia de +0.6 unidades de ΔLk. Este valor se ha establecido al comparar la topología del anillo TA1+CEN4 con la observada en anillos donde CEN4 ha sido mutado en CDEIII, impidiendo la unión de CBF3 y como consecuencia anulando su función, o sustituido por la secuencia High2 que estabiliza de forma muy eficiente un nucleosoma. El análisis topológico de anillos CEN4 de diferente tamaño y de anillos con la secuencia centromérica invertida, en cepas deficientes en topoisomerasa I y II, han ratificado que la estabilización de ΔLk =+0.6 es una propiedad robusta e intrínseca del complejo centromérico. Además, del estudio comparativo de los centrómeros CEN2, CEN4, CEN7 y CEN12 se ha descartado que la estabilización de +0.6 unidades dependa de la fase rotacional de CDEI y CDEIII y por tanto, se deba a una interacción entre ambos complejos proteicos. A partir de todos estos datos, se puede concluir que la estabilización de ΔLk = +0.6 estaría determinada por un enrollamiento dextrógiro del ADN en el hemisoma formado en CDEII o bien, por la combinación de distintos planos de curvatura del ADN en los segmentos CEI, CDEII y CDEIII. Promotores: Aprovechando la metodología usada para el análisis topológico del centrómero y del anillo TA1, se ha comenzado el estudio de la estructura de promotores de genes sensibles a topoisomerasa II. Se ha observado que la estructura de la cromatina de estos promotores no estabiliza el mismo número de enlace que segmentos de cromatina del mismo tamaño formados por nucleosomas típicos (cromatina control). Además,.la ianctivación de la topoisoemrasa II produce en estos promotores cambios topológicos distintos a los de la croamtina control lo que sugiere la posible presencia de mecanismos de regulación de la transcripción mediados por la topoisomerasa. / This thesis has focused on the accurate measure, in Saccharomyces cerevisiae cells, of the DNA linking number stabilized by canonical nucleosomes in vivo, as well as the centromere and several promoter regions topological contributions. To that end, TRP1ARS1 sequences, as well as its derivatives, were introduced in different S. cerevisiae strains: JCW25 (TOP1 TOP2 TOP3), JCW26 (TOP1 top2ts TOP3) y JCW27 (Δtop1 TOP2 TOP3), extracted as chromatin and analyzed by electrophoretic techniques in order to determine its in vivo topology. Thanks to the little size of these DNA ring (never bigger than 2kb), the distributions of the topoisomers have allowed to identified any modification of the chromatin structure Topology of TRP1ARS1: The TRP1ARS1 (TA1)1453 bp sequence has been cycled and used to electroporate different S. cerevisiae strains. The topological analysis of the nucleosomes located in this region has resulted in a Linking number difference (ΔLk) of -9.6 units. This value points to the stabilization of -1.37 per nucleosome, contrasting with the assumed value of -1 unit per nucleosome, known as the “linking number paradox” Centromere: S. cerevisiae centromere is characterized by 11-120 bp sequence, with three differentiated elements (CDEI, CDEII y CDEIII), as well as a hemisome (H2A+H2B+cenH3+H4) harboring the variant H3 histone CenH3. Over CDEI and CDEII sequences two protein complexes are bound, Cbf1 and CBF3 respectively, which are able to bend the DNA in vitro. Along this thesis, the topology of centromere of chromosome IV (CEN4) of S. cerevisiae, cloned in TA1 ring, has been studied resulting in a gain of +0.6 units of ΔLk. This value has been established when comparing the topology of TA1+CEN4 with the observed in DNA rings where CDEIII of CEN4 has been mutated, preventing CBF3 bound and as a consequence, abolishing centromere function, or where CEN4 has been substituted by High2 sequence which establishes a well-positioned nucleosome. The topological analysis of CEN4 rings of different size, in different strains of S. cerevisiae with altered topoisomerase activity, have confirmed that the stabilization of ΔLk =+0.6 is a strong and intrinsic characteristic of the centromeric complex. Besides this, the comparative study of CEN2, CEN4, CEN7 and CEN12 centromeres has discarded the stabilization of +0.6 units depending on the rotational phase of CDEI and CDEIII so, it is not due to an interaction between both protein complexes. From these data, it can be concluded that the stabilization of ΔLk = +0.6 would be determined by a right-handed loop around the hemisome formed over CDEII or, by the mixed of different DNA curvature planes in the regions of CDEI, CDEII y CDEIII. Promoters: Taking the advantage of the methodology used in the topological analysisi of the centromere, a study of promoters structure which are located in genes affected by topoisomerase II activity has just been started. It has been observed a difference between the linking number established by these promoters and a non-promoter fragment of chromatin used as a control. Furthermore, the inactivation of Topo II causes in these promoters topological changes that differ from the chromatin used as a control which suggests a trasncription regulation mechanism by Topo II.

El grup prostètic hemo és un component essencial de moltes proteïnes, com l'hemoglobina, la mioglobina i els citocroms. Existeixen quatre reaccions concatenades en la síntesi del grup hemo que són comunes en els diferents regnes animal, vegetal, i bacterià. Dues d'aquestes reaccions estan catalitzades per l'enzim Porfobilinogen Desaminasa (PBGD) i l'enzim Uroporfirinogen III Sintasa (U3S). Alteracions en l'activitat enzimàtica de la U3S donen lloc a una malaltia, la Porfíria Eritropoiètica Congènita (PEC). En les últimes dècades s'han incrementat els anàlisis genètica a pacients, facilitant una gran quantitat d'informació que relaciona aquesta malaltia amb alteracions en la seqüència d'aminoàcids de l'enzim U3S. Per determinar l'activitat enzimàtica dels enzims mutants relacionats amb la patologia s'han clonat, expressat i purificat les 25 mutacions puntuals patogèniques trobades en pacients, així com les proteïnes U3S salvatge i PBGD (necessària per dur a terme l'assaig enzimàtic). Els resultats de l'activitat relativa d'aquests enzims mutants poden explicar un seguit de fenotips, però no la seva totalitat. De fet, l'anàlisi dels resultats de l'activitat enzimàtica ha revelat que la gran majoria de les mutacions retenen una gran quantitat de l'activitat catalítica de la forma salvatge.Per entendre l'efecte d'algunes mutacions, s'ha realitzat un detallat estudi estructural i termodinàmic d'aquestes proteïnes. Amb aquest objectiu, s'ha determinat l'estabilitat cinètica d'aquestes proteïnes mutants respecte a la proteïna salvatge, i s'ha observat que en alguns casos, la mutació afecta l'estabilitat de l'enzim. Aquests estudis han permès identificar una regió helicoïdal de la proteïna imprescindible per al manteniment de l'estructura nativa.Per altra banda, s'havia descrit que la mutació C73R es trobava present en més d'un terç dels pacients de PEC, sent una mutació associada als fenotips més greus. Amb la col·laboració del Dr. Juan Manuel Falcón i el seu equip, i amb l'objectiu d'entendre l'efecte d'aquesta mutació en els sistemes vius, s'han realitzat una sèrie d'experiments in vivo que han permès determinar l'estabilitat relativa de la mutació C73R en l'entorn cel·lular, essent aquesta molt inferior respecte a l'enzim salvatge i mostrant un patró de degradació intracel·lular prematur. Nombrosos estudis han posat de manifest la possibilitat de manipular el plegament proteic dins de la cèl·lula mitjançant la utilització de "xaperones químiques". S'ha vist que l'ús d'aquests compostos pot aplicar-se en varies malalties associades amb pèrdues de la funció degudes a mutacions desestabilitzants. Estudis preliminars amb "xaperones químiques" han permès retenir la proteïna mutant C73R intracel·lular evitant-ne la degradació, obrint així, una nova línia d'investigació terapèutica. / The term porphyria describes a family of autosomal diseases produced by the existence of one or more mutations in any of the enzymes in the heme group biosynthetic pathway. In particular, a deficient Uroporphyrinogen III Synthase (U3S) activity is ultimately responsible for the human Congenital Erythropoietic Porphyria (CEP). The severity of the disease is usually related to the residual enzyme activity. In an effort to better understand the relationship between U3S malfunction and CEP, we set out to obtain a detailed characterization of the 25 pathogenic missense mutations of U3S. Comparing the enzymatic activity results, we demonstrate that in some cases, enzyme activity is not the only explanation for the severity of the disease. Our hypothesis is that mutants can also alter protein unfolding thermodynamics, so stability properties of U3S have been investigated. We have demonstrated that protein unfold takes place so fast in a subset of mutations that retain most of the synthase activity, which explain their CEP phenotype. Furthermore, an important key helix for protein stability has been identified.Through collaboration with Dr. Juan Manuel Falcón, in vivo behaviour of the wild-type human U3S and the most frequently mutation found in CEP patients, C73R mutation, have been investigated. Preliminary results indicate that C73R mutant is expressed in some mammal cells, but its in vivo stability is lower than in case of the wild-type. Our recent experiments with chemical chaperones have increased C73R mutant in vivo stability, suggesting a new potential therapeutic treatment.

Les espècies d'aranyes del gènere Loxosceles són originàries de les zones temperades i tropicals d'Amèrica i d'Àfrica. La major part de les espècies tenen àrees de distribució relativament petites, tot i que existeixen algunes excepcions a aquest patró general, i algunes espècies amb hàbits antropòfils han estat transportades de forma passiva i introduïdes en diverses zones del planeta. Aquest és el cas, per exemple, de L. rufescens (Dufour 1820), l'única espècie descrita d'Europa. Actualment, la diversitat del gènere es concentra a Amèrica del Sud i del Nord, d'on s'han descrit la major part de les 107 espècies del gènere. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat estudiar la diversitat del gènere Loxosceles a la Mediterrània, el Nord d'Àfrica i les Illes Canàries, i situar-la en un context filogenètic. L'intens mostreig de camp portat a terme per tota l'àrea d'estudi a posat al descobert l'existència d'una elevada diversitat. S'han identificat 11 llinatges mitocondrials dins de L. rufescens amb dos patrons filogeogràfics contrastats: (1) uns llinatges amb poblacions ben estructurades al Marroc i la Península Ibèrica, i (2) uns llinatges que manquen d'estructura geogràfica al llarg de la Mediterrània. Les estimes d'edats han situat la major part de diversificacions durant el Pleistocè, i la diferenciació al·lopàtrica dels llinatges és compatible amb els múltiples refugis Pleistocènics identificats amb la modelització de nínxol ecològics (ENM). Sembla que el transport indirecte pels humans ha complicat la biogeografia actual en aquesta espècie. En el cas de les Illes Canàries, les anàlisis filogenètiques han posat al descobert l'existència d'un clade ben recolzat endèmic de les Illes Canàries, format per set llinatges evolutius distribuïts de forma al·lopàtrica. La major part de dispersions entre Illes van succeir durant el Miocè superior. A més, també s'han trobat representants de l'espècie cosmopolita Loxosceles rufescens en l'arxipèlag. Sis dels llinatges pels quals es disposava de representants adults, s'han estudiat morfològicament i s'han descrit com a espècies nominals, quedant la diversitat de Loxosceles en les Illes Canàries amb una espècie endèmica de Fuerteventura i Lanzarote, dues de Gran Canària, dues més de Tenerife i una de La Gomera i El Hierro. Per tal d'aprofundir en la filogeografia de l'espècie endèmica de les illes i illots orientals, s'han desenvolupat set microsatèl·lits polimòrfics utilitzant les noves tecnologies de seqüenciació. Aquests nous marcadors han servit per a ressaltar la importància dels canvis en el nivell del mar i el vulcanisme en l'estructuració genètica d'aquesta espècie. Pel que fa a la diversitat de Loxosceles del Nord d'Àfrica, s'ha descrit una nova espècie de Loxosceles de Tunísia, L. mrazig, representant la segona espècie del gènere en la Conca Mediterrània. Tot i descriure's primerament d'una sola localitat, durant mostrejos posteriors s'han localitzat en diverses zones àrides del Nord d'Àfrica, des del Marroc fins a Israel. A més, l'estudi en profunditat a la regió del Souss-Massa del Marroc ha posat al descobert l'existència de diversos llinatges evolutius molt divergents molecularment i amb notables diferències morfològiques. L'estudi del verí de diferents llinatges de L. rufescens i de dues espècies de les Illes Canàries ha demostrat que existeixen diferències respecte a la composició principalment entre L. rufescens i les dues espècies canàries, que aquestes últimes expressen una diversitat menor de paràlegs de la família gènica SicTox, i que l'activitat esfingomielinasa D és en tots els llinatges i espècies estudiades tan elevada com en espècies americanes, les quals s'ha comprovat que poden provocar casos de loxoscelime. / The spider genus Loxosceles Henieken and Lowe, 1832 is mainly distributed across the Americas and Africa. Most of the species show a narrow, circumscribed, distribution, although a few exceptions exist, for example L. rufescens (Dufour 1820), described from Europe. The aim of this thesis is to study the diversity of the genus Loxosceles in the Mediterranean Basin, North Africa and the Canary Islands, and to situate this diversity within a phylogenetic framework. The extensive sampling across the studied areas revealed the existence of hidden diversity. Using mitochondrial data, 11 different evolutionary lineages were identified within L. rufescens, presenting two contrasting phylogeographic patterns: (1) lineages with well-structured populations in Morocco and Iberia, and (2) lineages lacking geographic structure across the Mediterranean Basin. Dating analyses placed main diversification events in the Pleistocene, and multiple Pleistocene refugia, identified using ecological niche modelling (ENM), are compatible with allopatric differentiation of the lineages. Human-mediated transportation appears to have complicated the current biogeography of this medically important and synanthropic spider. This same species was found in the Canary Islands, where phylogenetic analyses revealed the existence of a well-supported clade formed exclusively by Canarian Loxosceles specimens, comprising seven allopatrically distributed evolutionary lineages. Morphological and molecular data confirmed the distinctiveness of six lineages and were described accordingly. Seven newly developed microsatellite markers were used to study the phylogeographic patterns of the species endemic to Fuerteventura and Lanzarote, and the study revealed the importance of sea-level changes and volcanism in shaping the genetic diversity in this species. Also, a new species of Loxosceles was described from Tunisia based on molecular and morphological data. Although this species was first described from a single locality, further sampling across North Africa expanded its distribution from Morocco to Israel. In the Souss-Massa region of Morocco, several highly divergent lineages were detected using molecular data and were shown to be also different morphologically. Using multiple approaches to study venom variation in selected species and lineages from the Mediterranean Basin and the Canary Islands, we found that SMase D activity, the key bioactive component of Loxosceles venom, is comparable to that of the American species that are confirmed to have medically relevant bites.

La presente tesis doctoral se ha realizado en el grupo de investigación de Catálisis Homogénea del Departament de Química Inorgànica de la Universitat de Barcelona. Este trabajo está dedicado a la síntesis y caracterización de nuevos ligandos quirales diamidofosfito, ligandos P-dadores que contienen dos enlaces P-N y un enlace P-O. Se han preparado 2 ligandos diamidofosfito monodentados y 16 bidentados. La síntesis se realiza en dos etapas por reacción de diaminas quirales enantiopuras ((R,R) y (S,S)-N,N’-dibencil-1,2-diaminociclohexano, (R,R)-N,N’-dimetil-1,2- diaminociclohexano y (R) y (S)-N,N'-dimetil-1,1'-binaftildiamina) y PCl3, seguido de alcoholes quirales ((2S,3S)-(+)2,3-butanodiol, (2R,3R)-(-)2,3-butanodiol, (1R,2R)-trans- 1,2ciclohexanodiol, (-)-2,3-O-isopropilideno-D-treitol, (S)-1,1’-bi-2-naftol y (R)-1,1’-Bi-2- naftol), también enantiopuros en presencia de una base. Los diamidofosfitos monodentados sintetizados son iónicos y contienen un grupo alcoxi funcionalizado con una sal de imidazolio. También se han sintetizado 6 diaminofosfinas bidentadas quirales a partir de diaminas enantiopuras ((R,R)-N,N’-dibencil-1,2- diaminociclohexano, (R,R)-N,N’-dimetil-1,2-diaminociclohexano y (R) y (S)-N,N'- dimetil-1,1'-binaftildiamina) y bis(diclorofosfinas) (1,1’-bis(diclorofosfino)ferroceno, 1,2- bis(diclorofosfino)etano y 1,2-bis(diclorofosfino)benceno), en presencia de una base. A partir de los nuevos ligandos se han preparado 31 precursores de Pd(II) del tipo: [Pd(η3-2-CH3C3H4)(P-P)]+, [Pd(η3-2-CH3C3H4)(P)2]+, [Pd(η3-1,3-Ph2C3H3)(P-P)]+ y [PdCl(η3-2-CH3C3H4)(P)] que se han evaluado en la reacción de alquilación y aminación alílica del rac-(E)-3-acetoxi-1,3-difenil-1-propeno con la sal sódica del malonato de dimetilo y bencilamina como nucleófilos. Se hace una comparación de los resultados de estas reacciones en disolvente orgánico y líquido iónico utilizando los precursores con ligandos diamidofosfito monodentados iónicos funcionalizados con una sal de imidazolio. Los mejores sistemas catalíticos en la reacción de alquilación y aminación en disolvente orgánico han resultado los precursores con ligandos con fragmento terminal derivado de la (R,R)-N,N’-dibencil-1,2-diaminociclohexano y fragmento puente derivado del butanodiol o del ferroceno. Con el fragmento terminal derivado de la N,N'-dimetil-1,1'-binaftildiamina son los que contienen el fragmento puente 1,1’-bi-2-naftol los que han dado mejores resultados. En líquido iónico el mejor precursor ha resultado ser el [PdCl(η3-2-CH3C3H4)P] con el ligando que tiene el heterociclo derivado de la (R)-N,N'-dimetil-1,1'-binaftildiamina y el grupo exocíclico derivado del tetrafluoroborato de 1-(2-hidroxietil)-3-metilimidazolio. También se han preparado 10 precursores de Rh(I) del tipo [Rh(COD)(P-P)]BF4 con una selección de los ligandos diamidofodfito y diaminofosfina y se han evaluado como precursores catalíticos en la reacción de hidrogenación de las olefinas proquirales modelo DMI, MAA y MAC. Algunos de los nuevos ligandos se han ensayado con los precursores de Rh(I) preparados “in situ”. En la reacción de hidrogenación el mejor precursor catalítico resulto ser el que contiene el ligando diamidofosfito bidentado sintetizado a partir de (R)-N,N'-dimetil-1,1'-binaftildiamina y fragmento puente (-)-2,3- O-isopropilideno-D-treitol, con el que se obtiene un 100% de conversión y un ee > 99% con los tres sustratos modelo. Este precursor también presentó buenas conversiones y enantioselectividades en la hidrogenación de enamidas cíclicas y Z-acetamidas. Por último se presentan los ensayos preliminares realizados en la reacción de hidroformilación del estireno utilizando el precursor de Rh(I) formado “in situ” donde los ligandos evaluados han presentado bajas actividades y enantioselectividades. / This Thesis work has been carried out in the Grup de Catàlisi Homogènia del Departament de Química Inorgànica de la Universitat de Barcelona. New enantiopure diamidophosphite ligands, which are P-donor ligands containing 2 P-N and 1 P-O bonds, have been synthesized. The ligands have a highly modular structure, which is well suited for the synthesis of small libraries of compounds. In total, two monodentate and sixteen bidentate diamidophosphite ligands have been isolated and characterized. The preparation of the ligands was accomplished by stepwise addition of optically pure substituted diamines (N,N’-dibenzylcyclohexane-1,2-diamine, N,N’- dimethylcyclohexane-1,2-diamine and N,N’-dimethyl-1,1’-binaphthyl-2,2’-diamine) and optically pure diols (butanediol, cyclohexanediol, di-O-isopropylidene-threitol and binaphthol) to phosphorus trichloride. The new monodentate ligands are ionic and contain an imidazolium salt functionalized with an alcoxy group. A series of six bidentate diaminophosphines have also been synthesized by reaction of enantiopure diamines (N,N’-dibenzylcyclohexane-1,2-diamine, N,N’-dimethylcyclohexane-1,2- diamine and N,N’-dimethyl-1,1’-binaphthyl-2,2’-diamine) with bis(dichlorophosphines) (1,1’-bis(dichlorophosphine)ferrocene, 1,2-bis(dichlorophosphine)ethane and 1,2- bis(dichlorophosphine)benzene). The corresponding bis(diamidophosphite) selenides were prepared and the 1JPSe were calculated in order to evaluate the sygma-donor ability of the new ligands. With the obtained ligands, 31 new Pd(II) complexes of the types [Pd(η3-2-CH3C3H4)(P-P)]+, [Pd(η3-2-CH3C3H4)(P)2]+, [Pd(η3-1,3-Ph2C3H3)(P-P)]+ and [PdCl(η3-2-CH3C3H4)(P)] have been prepared, characterized and tested in catalytic allylic alkylation and amination reactions using sodium dimethylmalonate and benzylamine respectively as nucleophiles in dichloromethane. The allylic substitution reactions have also been run in ionic liquid medium with Pd(II) precursors containing ionic ligands. The best results for the allylic substitution reaction in organic solvents have been obtained with Pd(II) precursors containing ligands with the terminal fragment derived from N,N’-dibenzylcyclohexane-1,2-diamine and the bridging fragments derived from butanediol or ferrocene. With complexes containing ligands with the terminal fragment derived from N,N’-dimethyl-1,1’-binaphthyl-2,2’-diamine those with binaphthol derived bridging fragment lead to the best results. In ionic liquid medium, complexes [PdCl(η3-2-CH3C3H4)(P)] with the ligand containing the heterocyclic fragment derived from N,N’-dimethyl-1,1’-binaphthyl-2,2’-diamine resulted to be the best precursor. Ten new [Rh(COD)(P-P)]BF4 complexes were synthesized with a selection of the new bis(diamidophosphite) ligands. The complexes were used as catalytic precursors in the asymmetric hydrogenation of benchmark substrates, namely methyl-alpha-acetamidoacrylate, methyl-(Z)-alpha-acetamidocinnamate and dimethyl itaconate. The influence of the nature of both the terminal and bridging fragments of the bis(diamidophosphite) ligands on the asymmetric induction is discussed. Most of the complexes proved to be effective catalytic precursors for the process. Total conversion and excellent enantioselectivity (>99% ee) in the hydrogenation of the three substrates was achieved with the complex containing the ligand with N,N’-dimethyl-1,1’-binaphthyl-2,2’-diamine derived terminal fragment and di-O-isopropylidene-threitol derived bridging fragment. The best performing catalytic precursor was tested in the hydrogenation of selected cyclic enamides and beta-acetamides. Preliminary tests in the asymmetric hydroformylation reaction of styrene have been run with “in situ” prepared Rh(I) precursors with some of the new ligands achieving low activity and enantioselectivity.

En este trabajo de investigación se han estudiado los efectos de la aplicación de altas presiones hidrostáticas en las propiedades ópticas de distintos tipos de estructuras semiconductoras. Los cambios observados bajo presión, principalmente en la estructura electrónica, permiten la comprensión de los mecanismos microscópicos que rigen las propiedades opto-electrónicas de semiconductores a presión ambiente. Las estructuras semiconductoras investigadas fueron: nanocristales de silicio incorporados en matrices de SiOx, una superred de Ga0.85In0.15As/AlAs con tensión interna crecida en la dirección [311], y sustratos de ZnO (bulk) crecidos con diferentes orientaciones cristalográficas. Los materiales han sido caracterizados a través de medidas de fotoluminiscencia (PL), donde se han realizado diferentes tipos de experimentos; y espectroscopia Raman, ambos estudiados bajo presión. El tema principal de este trabajo concierne al estudio del origen de la emisión de luz de nanocristales de Si en el rango visible. A través de un sencillo método de crecimiento, se ha logrado la separación de fase para una matriz amorfa de SiOx a temperaturas bien inferiores a las referidas en la literatura. La presencia de nanocristales ha sido confirmada por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las transiciones ópticas observadas cuando sometidas a altas presiones presentan dependencias distintas en función del tamaño del nanocristal. La explicación para estas distintas dependencias puede ser dada a través de la estructura de bandas del Si bulk, donde los caracteres enlazante (bonding) y antienlazante (antibonding) de cada banda involucrada poseen un papel fundamental para el coeficiente de presión. El modelo adoptado para explicar los resultados experimentales ha sido confirmado a través de la realización de cálculos ab initio simulando nanocristales de Si bajo presión. La correspondencia entre experimento y teoría aporta un gran contenido en el tema de los nanocristales de Si, tan debatido en la comunidad científica. La superred de Ga0.85In0.15As/AlAs, al estar crecida en la dirección [311] presenta un gran campo piezoeléctrico en su interior. Las transiciones ópticas observadas debido a dicho campo piezoeléctrico habían sido medidas y asignadas anteriormente pero de forma incorrecta. El estudio de estas emisiones bajo presión ha permitido detectar y corregir resultados que ya habían sido publicados en la literatura. Aparte del coeficiente de presión de dichas transiciones y su efecto Stark, medidos también bajo presión, este estudio también nos ha permitido esquematizar el alineamento de bandas entre los pozos cuánticos de Ga0.85In0.15As y de las barreras de AlAs. La dinámica de la red cristalina de sustratos de ZnO y su carga efectiva transversal fueron estudiados mediante la aplicación de presión en muestras especialmente crecidas para que se pudieran observar los fonones ópticos con excelente precisión. Gracias a la alta calidad de los espectros se han logrado calcular los parámetros de Grüneisen para cada uno de los fonones activos Raman y también la dependencia en presión correcta de la carga efectiva transversal de ZnO. Así se han podido corregir trabajos ya publicados en la literatura que presentaban una dependencia positiva en función de la presión, un resultado erróneo debido a que los fonones longitudinales aparecían con una señal muy débil. / In this research work we have studied the effects of applying high hydrostatic pressure on the optical properties of different types of semiconducting structures. The changes under pressure, observed mainly in the electronic structure, allow the understanding of the microscopic mechanisms governing optoelectronic properties of semiconductors at ambient pressure. The investigated semiconductor structures were silicon nanocrystals embedded in matrices of SiOx, a superlattice of Ga0.85In0.15As/AlAs grown with permanent built-in piezoelectric fields in the [311] direction and ZnO substrates (bulk) grown in different crystallographic orientations. The materials have been characterized through measurements of photoluminescence (PL), using different experimental configurations, and Raman spectroscopy, and the two techniques were studied under high pressure. The main focus of this work concerns the study of the origin of light emission from Si nanocrystals in the visible range. Through a simple growth method a phase separation of the nanocrystals and the amorphous SiOx matrix has been achieved at temperatures well below those reported in the literature. The presence of the nanocrystals has been confirmed by transmission electron microscopy TEM measurements. The optical transitions observed when subjected to high pressures experiments have different dependences respect the size of the nanocrystal. The explanation for these different dependences can be given through the band structure of bulk Si, where the characters bonding (bonding) and antibonding (antibonding) of each band involved have a key role in the pressure coefficient. The model adopted to explain the experimental results has been confirmed by ab initio calculations of the electronic structure of Si nanocrystals under pressure. The correspondence of experiment and theory provide new insights for the issue of light emission from Si nanocrystals, largely debated in the scientific community. The superlattice of Ga0.85In0.15As/AlAs was grown in the direction [311] and it has a large built-in piezoelectric field. The optical transitions which can be observed due to the piezoelectric field had been already measured but incorrectly assigned. The study of such transitions under pressure allowed to correct those results already published in the literature. The value of the observed pressure coefficient and the Stark-shift effect under pressure allowed us to outline the band alignments between the quantum wells and barriers of Ga0.85In0.15As/ AlAs. The dynamics of the crystal lattice of ZnO substrates and the transverse effective charge were studied by applying pressure in specially grown samples where it was possible to observe the optical phonons with excellent precision. Because of the high quality of the obtained spectra, the Grüneisen parameters for each one of the optical phonons have been calculated as well as the correct pressure dependence of the transverse effective charge of ZnO. It has been possible to correct this dependence in contrast to a previous publication in the literature which shows an erroneous positive dependence as function of pressure. It became apparent that this erroneous result was due to the poor precision of the longitudinal phonons measurement in that case,, contrary to what has been shown in this thesis.